一、從環(huán)境中獲取微生物核酸

分析微生物群落的傳統(tǒng)方法一般包括用選擇和鑒定培養(yǎng)基稀釋平板法進行培養(yǎng)檢測或直接計數(shù)。直接計數(shù)可以得到現(xiàn)存細菌的總數(shù)，但不能給出群落的數(shù)量或多樣性信息。然而，數(shù)據(jù)表明僅有少于1%的一般土壤細菌可以被培養(yǎng)。因此培養(yǎng)提供的信息只是九牛一毛。另外，所有培養(yǎng)基實際上都是對在其上生長細菌的選擇，也就是說，培養(yǎng)基的選擇是決定分析結(jié)果的關(guān)鍵。表15-6列出了不同培養(yǎng)基對土樣明顯不同的計算結(jié)果。從表中可見盡管從跨越4.9m深的一系列沉積物樣品中得到的直接計數(shù)結(jié)果很相似，但培養(yǎng)計數(shù)卻隨培養(yǎng)基類型不同而變化。由一種營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基(PTYG)(由蛋白胨、胰蛋白酶酶解酪蛋白、酵母浸出物和葡萄糖組成)培養(yǎng)計數(shù)得到的數(shù)量比兩種低營養(yǎng)培養(yǎng)基低1到3個數(shù)量級。這兩種低營養(yǎng)培養(yǎng)基分別是一種1∶10倍稀釋的PTYG和一種由1∶2表層土懸浮液制備的土壤浸出物瓊脂。這些數(shù)據(jù)表明大多數(shù)土壤微生物生存在有限營養(yǎng)條件下。

以培養(yǎng)基培養(yǎng)方法分離和計算的微生物種群及群落的信息是極其重要的，但不是完整的，而以微生物核酸為基礎(chǔ)的微生物信息則可以彌補前者的不足，并可把這二種方法結(jié)合起來，以得到盡可能多的數(shù)據(jù)，使信息更加完整、豐富。獲取生態(tài)環(huán)境或培養(yǎng)條件下的微生物遺體物質(zhì)(DNA或RNA)，對進一步分析微生物是十分重要的，這里以獲取DNA為例，闡述微生物遺傳物質(zhì)的獲取。

表15-6　　不同培養(yǎng)基對沉積物樣品計數(shù)的影響

引自Balckwill and Ghiorse，1985。

①AODC，吖啶橙直接計數(shù)。

②PTYG，由蛋白胨、胰蛋白酶酶解酪蛋白、酵母提取物和葡萄糖配制的營養(yǎng)豐富培養(yǎng)基。

③稀釋PTYG，1∶20稀釋的PTYG培養(yǎng)基。

④SSA，土壤提取物瓊脂。以1∶2蒸餾水懸浮表層土樣，然后離心并過濾，澄清抽提液經(jīng)滅菌即得該培養(yǎng)基。

⑤這一樣品在未飽和區(qū)與飽和區(qū)界面采集。

將細菌DNA從土壤樣品中分離出來(圖15-4)有兩種方法:

1.土壤中細胞的提取及隨后的DNA回收

在這種方法中，先從樣品中分離完整細胞，然后進行裂解以回收DNA。DNA回收的過程是一個連續(xù)的多步的過程。

(1)回收細胞

首先是樣品(土壤或沉積物)的均質(zhì)化，以便打碎聚集體和分散真菌和細菌細胞。通常將10g樣品置入一種含聚乙烯基聚吡咯烷酮(PVPP)的緩沖液中，PVPP能同腐殖酸化合，從而有助于去除腐殖質(zhì)，因為腐殖質(zhì)會影響DNA分析，所以這一步反應(yīng)非常重要。土壤或沉積物微粒以及真菌細胞都可以通過低速離心去除，接著高速離心獲得細菌細胞，這一過程為差速離心。為確保回收到最大量的細菌，通常要進行多輪均質(zhì)化和差速離心。

(2)裂解回收DNA

在細胞回收后，加入溶菌酶進行裂解。細胞殘渣經(jīng)離心去除，并從上清液中提取游離的DNA，然后進行純化，提取的DNA量因樣而異，但通常每克表層土壤的含量在1～5mg范圍內(nèi)。

操作得當(dāng)時這種方法可回收沙壤土中細菌群體的33%左右。而富含黏土的土樣回收率要低些，這是因為被緊密吸附的細菌細胞在低速離心時隨土壤顆粒被去除。細胞的吸附也會影響回收特定的細菌群體。經(jīng)二分裂產(chǎn)生新細胞的細菌新陳代謝旺盛，它們被吸附的程度較不緊密，會被優(yōu)先回收，相反生長不活躍的老細胞被緊密吸附，因而易于在離心中流失。因此這一過程對細菌的選擇是基于細菌的吸附性和對黏土膠體的吸附程度，而不是所有類型的細胞都以同樣的效率被提取。

圖15-4　從土樣中獲取群落DNA的方法

2.原位裂解及DNA回收

這種方法的特點是目標微生物在土壤中被裂解，它們的DNA在其從樣品中提取之前就釋放出來，裂解通常采用物理與化學(xué)處理相結(jié)合。對細菌而言，物理處理包括凍融循環(huán)、超聲波破碎和玻璃研磨，化學(xué)處理經(jīng)常使用去污劑，如十二烷基硫酸鈉(SDS)或者溶菌酶和蛋白酶。在裂解后，細胞殘片和土壤顆粒通過離心被除去，DNA被保留在上清液中。

二種方法所得的上清液的DNA能夠通過離子交換樹脂或凝膠柱提純。這些步驟對除去干擾DNA分析的腐殖質(zhì)非常重要。DNA樣品再用苯酚-氯仿/戊醇氯化銫密度梯度離心或市售純化試劑進一步提取純化。純DNA樣品能用于后續(xù)的分子水平的分析。然而，不論用哪種提純方法，提純過程中的每一步都會導(dǎo)致DNA損失，因此，DNA的得率總是隨其純度的提高而降。

兩種提取DNA的方法各有不同的特點(表15-7)。前一種方法因為在細胞裂解前細菌就同真菌分離了，這樣最終就可以回收到較純的細菌DNA。這種方法也能從土壤細菌群落中得到有活力的細胞，這些細胞能被二次抽樣并且可以通過不同的途徑來分析。然而需要注意的是完整的無活力的細胞也會被回收。后一種方法的主要優(yōu)點是省力、快捷，并且在通常的情況下可提高NDA的回收率(1～20mg NDA/g土壤)。同時這種方法比分級分離法能更好地代表細菌群落，這是因為它不受土壤膠體吸附細菌的影響。這樣直接裂解法在DNA回收中被廣泛采用。然而也存在一些不足之處，主要包括:①黏土或腐魚質(zhì)膠體對裂解細胞釋放DNA的吸附也能減少DNA提取的回收率;②DNA易被腐殖質(zhì)污染;③DNA易被隨機剪切，因而提取DNA分子量較小。有人認為通過原位裂解得到的DNA可能還包括真菌和原生動物的DNA，但是通常使用的化學(xué)藥品不溶解真菌細胞，原生動物在土壤中的密度也比細菌小得多。因此，即使考慮原生動物較大的基因組，原生動物在每克土壤中含10⁴個，似乎不會對10⁸～10⁹細菌提取的DNA有較大影響。

表15-7　　細菌分級分離法和原位裂解法從土壤中回收DNA的比較

純DNA樣品可以通過紫外分光度法定量測定。DNA含量在260nm波長下測量吸光度達1.0時，相當(dāng)于每毫升溶液中含50μg DNA。DNA純度用260nm與280nm吸光度的比值來估算，比值大于1.7表明DNA純度較高，最大理論值為2.0。

對于水體樣品，細胞可通過適當(dāng)?shù)倪^濾器對一定量的水樣進行濃縮。使用0.2μm濾膜過濾可捕獲細菌。病毒太小，不能以大小排除過濾方法濾得，需用負電性或正電性的濾器來收集。而大一些的賈第蟲屬和隱孢子蟲寄生蟲可用纖維紙濾膜濾得。如同土壤樣品，一旦這些機體從水中收集，即可進行溶解，提取DNA，并做進一步的純化分析。