一、環(huán)境污染的指示微生物

某些微生物種類的存在和消失可以作為監(jiān)測指標(biāo)。指示微生物(indicator microorganism)是指用以指示和評價(jià)環(huán)境樣品污染程度和性質(zhì)的代表性微生物。

1.一般污染的指示微生物

環(huán)境中一般性污染主要是指糖、脂、含氮有機(jī)物、有機(jī)酸等天然有機(jī)物和硫、磷等無機(jī)物引起的化學(xué)性污染，以及細(xì)菌、真菌、病毒等在內(nèi)的生物性污染。指示微生物可以反映出常見有機(jī)物和微生物的一般性污染狀況。

(1)異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)

細(xì)菌總數(shù)不但反映了環(huán)境中細(xì)菌的污染程度，以有機(jī)物作為碳源和能源的好氧和兼性厭氧菌的數(shù)量可以指示環(huán)境一般營養(yǎng)性有機(jī)物的污染程度，故通常用異養(yǎng)細(xì)菌總數(shù)作環(huán)境監(jiān)測指標(biāo)。常用測定方法為異養(yǎng)平板計(jì)數(shù)(heterotrophic plate count，HPC)，即將一定稀釋倍數(shù)的樣品懸液定量接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，在有氧條件下，37℃培養(yǎng)48小時(shí)計(jì)數(shù)所得的菌落生長結(jié)果。HPC常用于水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。飲用水中，HPC應(yīng)不超過每毫升100個(gè)。

(2)霉菌和酵母菌總數(shù)

霉菌和酵母菌都是異養(yǎng)性微生物，有些有致病性或產(chǎn)毒素。霉菌和酵母菌總數(shù)是指環(huán)境中的被測樣品經(jīng)過處理后，在一定條件下培養(yǎng)所得的單位被測樣品(1g或1ml)中所含的霉菌和酵母菌菌落數(shù)。霉菌和酵母菌在環(huán)境中普遍存在，它們營養(yǎng)源廣泛，與細(xì)菌相比，它們一般更喜好偏酸性的好氧環(huán)境，加上霉菌孢子散布廣，存活力強(qiáng)，更能耐受不良環(huán)境，故霉菌和酵母菌總數(shù)可從另一角度反映環(huán)境的一般性污染。目前在食品、藥品和化妝品中都規(guī)定有檢出標(biāo)準(zhǔn)。

2.糞便污染指示微生物

腸道病原菌對水體的污染是引起霍亂、傷寒等流行性疾病的主要原因，而環(huán)境中的腸道病原菌主要來自人畜糞便。由于腸道病原菌在環(huán)境中存在的數(shù)量少，檢測困難，因此，一般的常規(guī)檢測方法不是直接檢測病原菌，而是檢測和病原菌并存于腸道且具有相關(guān)性的“指示菌”，以間接指示腸道病原菌存在的可能性，并從這些“指示菌”的數(shù)量來判斷水質(zhì)污染程度和飲用水的安全性。

指示菌評估糞便污染程度的依據(jù)是，所有溫血?jiǎng)游锏募S便中都存在某些非病原體細(xì)菌，這些細(xì)菌數(shù)量大，可以用簡單的細(xì)菌學(xué)方法方便地分離和測定，在水中檢測到這些細(xì)菌意味著已經(jīng)發(fā)生糞便污染，水中也可能存在腸道病原體。

作為一種理想的糞便污染指示生物，須滿足如下標(biāo)準(zhǔn):該生物應(yīng)是溫血?jiǎng)游锬c道微生物群落的組分;該生物在體外存活時(shí)間應(yīng)比生命力最強(qiáng)的腸道病原體長;不管腸道病原體是否存在，該生物都應(yīng)該存在;該生物的密度應(yīng)與糞便污染程度具有直接關(guān)系;該生物在水體中不能繁殖;該生物適用于各種類型的水體;最后，其檢測方法還要簡單易行。

目前，水體污染常用的指示微生物主要有大腸菌群、糞大腸菌、糞鏈球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、噬菌體和總異養(yǎng)細(xì)菌等。

(1)總大腸菌群

總大腸菌群是最基本的糞便污染指示菌，也是最常用的水質(zhì)指標(biāo)之一。美國1914年起就采用大腸菌群作為飲用水糞便污染的指示生物?，F(xiàn)在很多國家都采用大腸菌群作為評估飲用水、娛樂性洗浴水、廢水排放以及各種食物的官方標(biāo)準(zhǔn)(表13-1，表13-2)。

大腸菌群(coliform bacteria)存在于所有溫血?jiǎng)游锏哪c道中，隨糞便被大量排出，包括埃希氏菌、檸檬酸桿菌、腸桿菌和克雷伯氏菌等。在被污染的水中，大腸菌群的濃度大致與糞便污染的程度成正比。由于大腸菌群的生命力通常比一些致病菌強(qiáng)，因此，水中不含大腸菌群就表明在細(xì)菌學(xué)上人使用是安全的。相反，如果水中存在大腸菌群則意味著其他可能致病的微生物也可能存在，這樣的水作為飲用水就存在安全隱患。通過經(jīng)驗(yàn)得知，100ml飲用水中不存在此類微生物就可以確保不會(huì)爆發(fā)細(xì)菌性水傳播疾病。

大腸菌群相對容易檢測。大腸菌群包括了所有好氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在乳糖蛋白胨培養(yǎng)基中攝氏35度培養(yǎng)48小時(shí)會(huì)發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣。

表13-1　　歐盟的飲用水規(guī)范

大腸菌群常用的測定方法有發(fā)酵法與濾膜法兩類。三種方法常用于鑒別水中的大腸菌群:最可能數(shù)目試驗(yàn)(most probable number test MPN)、有或無試驗(yàn)(presence-absence test P-A)以及濾膜試驗(yàn)(membrane filter test MF)。

表13-2　　美國聯(lián)邦政府和州政府的微生物標(biāo)準(zhǔn)

1)發(fā)酵法亦稱多管發(fā)酵法或三步發(fā)酵法、最可能數(shù)目試驗(yàn)。MPN試驗(yàn)用于檢測樣品中大腸菌群的存在并估計(jì)其數(shù)量。MPN試驗(yàn)包括三個(gè)步驟:推測試驗(yàn)、確證試驗(yàn)和完成試驗(yàn)。

①初發(fā)酵(又稱推測實(shí)驗(yàn))系將一系列不同稀釋度待檢測水樣分別接種入含有乳糖等糖類之培養(yǎng)液中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24小時(shí)，觀察產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況以初步判別是否有大腸菌群存在。

②平皿分離(確證試驗(yàn))由于水中除大腸菌群外，尚有其他細(xì)菌亦可引起糖類發(fā)酵，故需進(jìn)一步證實(shí)。主要是通過將少量從初發(fā)酵陽性試管中取出的菌種接種在選擇性細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂如伊紅美藍(lán)(EMB)瓊脂或遠(yuǎn)藤氏瓊脂上培養(yǎng)，以證實(shí)大腸菌群的存在。這類培養(yǎng)基可以抑制其他細(xì)菌而利于大腸菌群生長。如培養(yǎng)基上出現(xiàn)綠色光澤或中心顏色較暗的菌落，就表明存在乳糖發(fā)酵細(xì)菌。根據(jù)菌落特征，挑出可能為大腸菌群的菌落制片，如經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，即可進(jìn)一步證明為大腸菌群。

③復(fù)發(fā)酵(完成試驗(yàn)):有些情況下需做完試驗(yàn)(completed test)，即將瓊脂培養(yǎng)基上的菌落重新接種到乳糖培養(yǎng)液中，經(jīng)24小時(shí)產(chǎn)酸產(chǎn)氣者即最后確證為有大腸菌群存在。

根據(jù)肯定有大腸菌群存在的初發(fā)酵陽性試管數(shù)目以及實(shí)驗(yàn)所用水樣，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)原理或查閱專用統(tǒng)計(jì)表，最后估算出每升原始水樣中大腸菌群的最可能數(shù)目(MPN)。

2)濾膜試驗(yàn)(membrance filtration test，MF)。上述發(fā)酵法全部檢測需時(shí)較長。為了縮短時(shí)間，可用濾膜法，有可能在24小時(shí)左右完成。濾膜法同樣可確定樣品中的大腸菌群數(shù)量，但MF法所需試驗(yàn)試管更少，工作量更小，操作更簡便。

該法是將一定量的水(飲用水通常為100ml)通過濾膜(孔徑為0.45μm)過濾，濾膜將細(xì)菌截留在其表面。然后將濾膜放在用特殊培養(yǎng)基(如改良的遠(yuǎn)藤氏培養(yǎng)基)飽和的薄吸收墊襯上，該培養(yǎng)基可選擇性地使目的生物生長。濾膜在35℃下培養(yǎng)18～24小時(shí)。計(jì)數(shù)具綠色光澤的菌落，就可確定水樣中大腸菌群的數(shù)量。

主要步驟如下:

①水樣過濾:選用具有微孔的濾膜，通過抽濾一定水量，將水中細(xì)菌截留在濾膜上。

②培養(yǎng):將濾膜不截留細(xì)菌的一面貼附在特定固體培養(yǎng)基上(例如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基)進(jìn)行培養(yǎng)。

③觀察結(jié)果:通過菌落特征及鏡檢菌體形態(tài)初步確定大腸菌群細(xì)菌;凡革蘭氏陰性無芽孢桿菌再接種入含乳糖培養(yǎng)基中產(chǎn)氣者可確證為大腸菌菌群;最后根據(jù)通過水量及濾膜上長出的確證為大腸菌的菌落數(shù)換算出每升水中大腸菌群數(shù)。

3)有或無(presence-absence，P-A)試驗(yàn)。有或無試驗(yàn)(P-A試驗(yàn))不是定量試驗(yàn)，而是確定樣品中是否存在目標(biāo)生物大腸菌群的定性試驗(yàn)。P-A試驗(yàn)中使用單個(gè)如MPN試驗(yàn)中所用的含乳糖培養(yǎng)基的試管，但不稀釋。

雖然濾膜法比發(fā)酵法省時(shí)間，但仍不能及時(shí)指導(dǎo)生產(chǎn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)水質(zhì)有問題時(shí)，這種不符合標(biāo)準(zhǔn)的水已進(jìn)入管網(wǎng)一段時(shí)間了。此外，當(dāng)水樣中懸浮物較多時(shí)，亦會(huì)影響操作及大腸菌群發(fā)育，使測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

近年來，酶檢測法得到了發(fā)展，可同步檢測飲用水中總大腸菌群和大腸埃希氏菌。檢測可以是簡單的P-A試驗(yàn)或MPN試驗(yàn)。如近年來常用的Colilert試驗(yàn)就是將樣品加入含有由鹽或特異酶基質(zhì)組成的粉末狀物質(zhì)的單個(gè)試驗(yàn)瓶(P-A試驗(yàn))或MPN測試管中，以鹽或特異酶基質(zhì)作為目標(biāo)生物的唯一碳源。培養(yǎng)24小時(shí)后，存在總大腸菌群的陽性樣品變黃，大腸埃希氏菌陽性樣品在黑暗中用長波紫外光照射會(huì)發(fā)熒光。

大腸菌群作為反映水樣的衛(wèi)生質(zhì)量和污染程度的指標(biāo)，在評價(jià)水的細(xì)菌學(xué)質(zhì)量上的優(yōu)點(diǎn)是毋庸置疑的。但大腸菌群作為指示生物仍有不足之處，如對一些消毒劑的抵抗力不及腸道病毒和原生動(dòng)物病原體強(qiáng)，存活時(shí)間也較它們短，檢驗(yàn)大腸菌群結(jié)果為陰性的水樣仍可以對人體健康產(chǎn)生危害，這就限制了大腸菌群指示生物的作用。此外，由于水中大量的異養(yǎng)菌可能會(huì)掩蓋大腸菌群在用于分離的選擇性培養(yǎng)基上的生長，故大腸菌群的真實(shí)數(shù)量可能被低估。還有，所有大腸菌群的成員在天然地表水和飲用水配水系統(tǒng)中都會(huì)再生。即使在有游離氯存在時(shí)，大腸菌群也可在配水系統(tǒng)管道上的生物膜中集群和生長。大腸菌群在配水系統(tǒng)中的再生和恢復(fù)，就可能造成糞便污染的假象。

(2)糞大腸菌(Fecal coliforms)

總大腸菌群的許多種類并不僅僅來自于糞便。因此，后來又發(fā)展出一些方法，可只計(jì)數(shù)糞源性的大腸菌群，也即糞大腸菌(fecal coliforms)。糞大腸菌包括埃希氏菌屬和克雷伯氏菌屬，根據(jù)它們具有在44.5℃下培養(yǎng)24小時(shí)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的能力，而在實(shí)驗(yàn)室中被鑒別。

糞大腸菌可用類似檢測大腸菌群的方法檢測。分析水樣時(shí)，MPN法使用EC營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，膜濾法使用m-FC培養(yǎng)基。Colilert試驗(yàn)可在24小時(shí)內(nèi)同步檢測大腸菌群和大腸埃希氏菌這一主要的糞大腸菌。

使用糞大腸菌也有總大腸菌群類似的一些局限，如在水體中再生以及對水處理的抵抗力較病毒和原生動(dòng)物弱。大腸菌群和糞大腸菌在未經(jīng)污染熱帶水體中的頻繁出現(xiàn)，以及它們在腸道外具有相當(dāng)長時(shí)間的存活能力，意味著這些生物可在熱帶水體中自然發(fā)生，這就需要開發(fā)出適應(yīng)這類水體的新的指示生物。另外，該試驗(yàn)只能指示是否有糞大腸菌，但不能區(qū)分到底是人還是動(dòng)物的糞便污染。

(3)糞鏈球菌(Fecal streptococci)

糞鏈球菌是革蘭氏陽性Lancefield D群鏈球菌的一個(gè)類群。糞鏈球菌屬于腸球菌屬Enterococcus和鏈球菌屬Streptococcus。腸球菌屬中的包括所有能在6.5%NaCl、pH9.6和45℃生長的鏈球菌:Enterococcus avium，Ent.faecium，Ent.durans，Ent.facculis和Ent.gallinarium;鏈球菌屬中僅僅Streptpcoccus bovis和S.equinus被認(rèn)為是真正的糞鏈球菌，這兩種鏈球菌主要在動(dòng)物中占優(yōu)勢，而Ent.Faecalis和Ent.faecium則特異性地存在于人類消化道中。

膜濾法和MPN法都可用于分離糞鏈球菌。膜濾法使用糞鏈球菌瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24小時(shí)。所有紅色、栗色、粉紅色菌落計(jì)數(shù)作為推測性糞鏈球菌數(shù)。分離菌落在膽汁七葉苷培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，44℃18小時(shí)，以確證糞鏈球菌的存在。糞鏈球菌產(chǎn)生周圍棕色或黑色的零散菌落。

如果糞大腸菌/糞鏈球菌(FC/FS)的比值為4或更大，就意味著污染源來自人類;相應(yīng)地，比值小于0.7，則表明是動(dòng)物性污染(表13-3)。然而，F(xiàn)C/FS比值的有效性還值得探究。并且，該比值僅僅對近期(24小時(shí)內(nèi))的糞便污染有效。

與大腸菌群和糞大腸菌相比，糞鏈球菌在水中幾乎不繁殖，對環(huán)境壓力和氯化的抵抗力比大腸菌群大，一般在環(huán)境中存活更久，故其作為指示生物更具優(yōu)勢。

表13-3　　FC/FS比值

腸球菌(Enterococci)已被提議作為娛樂洗浴者患胃腸炎風(fēng)險(xiǎn)的指示生物，同時(shí)也被提議作為環(huán)境中腸道病毒的指示生物。

(4)產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)

產(chǎn)氣莢膜梭菌只來自糞便。這是一種還原亞硫酸鹽的產(chǎn)芽孢厭氧菌，革蘭氏陽性、桿狀。其芽孢耐熱性很強(qiáng)(75℃下存活15分鐘)，在環(huán)境中存活時(shí)間長，對消毒劑有非常強(qiáng)的抵抗力。雖然其堅(jiān)韌的芽孢限制了它用作指示生物，但它可以作為歷史性污染的指示生物、耐受稍差的指示生物的示蹤物、飲用水和廢水處理過程中去除寄生原生動(dòng)物或病毒的指示生物等。

其他的厭氧菌如雙歧桿菌(Bifidobacterium)和擬桿菌(Bacteroides)也被提議作為指示生物。因?yàn)橛行╇p歧桿菌主要與人相聯(lián)系，它們就可用做區(qū)分人類污染和動(dòng)物污染。然而，目前還沒有較好的、更標(biāo)準(zhǔn)的方法來檢測環(huán)境中所有的厭氧菌，以使在常規(guī)檢測中監(jiān)測到厭氧菌。

(5)噬菌體

噬菌體在水樣中的出現(xiàn)意味著出現(xiàn)了有能力維持噬菌體繁殖的細(xì)菌。所以噬菌體也可作為糞便污染的指示生物。由于在很多水環(huán)境中噬菌體的結(jié)構(gòu)、形態(tài)、大小和行為同一些腸道病毒非常相似，噬菌體也作為病毒污染的指示生物。噬菌體常被廣泛地用于評價(jià)病毒對消毒劑的抵抗力、病毒在水和廢水處理期間的死亡規(guī)律以及作為地表水和地下水的示蹤物等。目前常用的是大腸桿菌和脆弱擬桿菌的噬菌體。

使用大腸桿菌噬菌體具有簡單廉價(jià)快速的優(yōu)點(diǎn)，在8～18小時(shí)內(nèi)就可得到結(jié)果。常用的兩組噬菌體是體細(xì)胞大腸桿菌噬菌體，它通過細(xì)胞壁受體感染大腸埃希氏菌宿主菌株。F⁺特異性RNA大腸桿菌噬菌體，它通過F⁺或性菌毛感染大腸埃希氏菌及其相關(guān)細(xì)菌菌株。

大腸桿菌噬菌體存在于人類消化道以外的棲息地中，故難以區(qū)分人類和動(dòng)物污染。脆弱擬桿菌的噬菌體則可作為環(huán)境中人類病毒的指示生物。擬桿菌的種類是嚴(yán)格厭氧的且是人類糞便的主要成分，并且脆弱擬桿菌噬菌體在環(huán)境中的消亡速率與人類腸道病毒類似。所以，積極對抗這些生物的噬菌體就成了潛在的合適的病毒污染指示生物。脆弱擬桿菌噬菌體在環(huán)境中不能繁殖，不存在于天然棲息地中，而只來自人類，僅存在于有人類糞便污染的環(huán)境樣品中，這種特性有助于區(qū)分動(dòng)物污染和人類污染。

然而，由于它們的宿主是檢測方法復(fù)雜而耗時(shí)的厭氧菌，這就限制了脆弱擬桿菌噬菌體用作常規(guī)指示生物。

3.其他指示微生物

許多其他微生物也可作為某些特定用途的指示生物，用于水環(huán)境、公共場所、食品、化妝品、藥物等的衛(wèi)生安全性檢驗(yàn)中。

蛭弧菌(Bdellovibrio)是環(huán)境中的天然寄居菌，以對宿主菌的寄生和裂解存活，當(dāng)水體受到糞便污染時(shí)，可供其寄生的宿主增加，蛭弧菌數(shù)量增加，因而對糞便污染也有一定的間接指示作用。由于蛭弧菌生長繁殖需要一定時(shí)間，其對污染的指示有一定的滯后期，加上其數(shù)量升高后可長時(shí)間維持較高水平，實(shí)踐中可結(jié)合大腸菌群判斷受糞便污染的時(shí)間或污染是否持續(xù)。例如，蛭弧菌數(shù)量低，大腸菌群數(shù)量高表示水體剛受到污染，反之則指示污染已有一段時(shí)間，兩者數(shù)量都高，則表示水體受到持續(xù)污染。

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(綠膿桿菌)可作為游泳池等洗浴用水以及藥品、化妝品衛(wèi)生指示菌。這一革蘭氏陰性無芽孢桿菌是最常見的機(jī)會(huì)性病原體，具有顯著的公共衛(wèi)生學(xué)意義，常引起眼、耳、鼻、咽喉感染、毛囊炎、皮炎、尿道感染。但由于該種類在自然界中普遍存在并能在自然條件下繁殖(它甚至能在蒸餾水中生長)，不能指示糞便污染。

金黃色葡萄球菌、鏈球菌、破傷風(fēng)梭菌、沙門氏菌、志賀氏菌等都是重要的衛(wèi)生指示菌，是食品、化妝品、藥品、游泳池水等的監(jiān)測指標(biāo)。

過去常用大腸菌群評估游泳池水的安全性。然而人們后來發(fā)現(xiàn)，污染通常不是糞源性的，因?yàn)槿祟愒趭蕵酚盟谢顒?dòng)(如在維護(hù)差的游泳池游泳)引起的感染，其感染部位主要是呼吸道、皮膚和眼睛，主要是由一種革蘭氏陽性細(xì)菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等引起的皮膚感染，而水是傳播媒介。因此，金黃色葡萄球菌被提出作為娛樂用水衛(wèi)生質(zhì)量的附加指示生物。另外，酵母中的白假絲酵母也可作為洗浴用水的指示生物。