（一）主要儀器和材料

WRS－1B數(shù)字熔點測定儀（未校正）、X4型顯微熔點測定儀、Perkin－Elmer　983G紅外光譜儀、Bruker ARX600核磁共振儀（TMS內(nèi)標）、Autospec Ultima－TOF型質(zhì)譜儀、制備高效液相色譜儀、中壓液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器、層析預(yù)柱。葡聚糖凝膠LH－20、聚酰胺、柱層析用硅膠G（100～200目）、硅膠H及薄層層析用硅膠G及石油醚、氯仿、乙酸乙酯等試劑。貓爪草正丁醇提取部位大孔吸附樹脂30%乙醇、50%乙醇洗脫部位。

（二）方法

大孔吸附樹脂30%乙醇的洗脫部分（65g），用硅膠拌樣后經(jīng)硅膠柱層析，氯仿－甲醇－水（8．0∶2．5∶0．5下層洗脫，洗脫液減壓回收溶劑。以0．3%CMC－Na的硅膠G板，以CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下層為展開劑展開，以5%磷鉬酸試液、硫酸乙醇試液為顯色劑顯色，進行薄層層析檢視，合并相同組分，得80份。其中20～50份合并，經(jīng)反復(fù)中壓柱層析，CHCl3－MeOH－H2O（75∶25∶10）下層洗脫，合并相同組分，得化合物Ⅰ（15mg）；51～80份合并，經(jīng)反復(fù)中壓柱層析CHCl3－MeOH－EtOAc－H2O（2∶2∶4∶1）下層洗脫，合并相同組分，LH－20凝膠柱層析，50%甲醇洗脫，得化合物Ⅱ（23mg）和化合物Ⅲ（20mg）。

大孔吸附樹脂50%乙醇的洗脫部分（35g），用硅膠拌樣后經(jīng)硅膠柱層析，氯仿－甲醇（95∶5～50∶50）梯度洗脫，洗脫液減壓回收溶劑，得150份。以0．3%CMC－Na的硅膠G板，以CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下層等為展開劑展開，以5%磷鉬酸乙醇液、硫酸乙醇溶液為顯色劑顯色，進行薄層層析檢視，合并相同組分，將量多的組分再進行柱層析。其中20～50份合并，經(jīng)反復(fù)中壓柱層析，CHCl3－MeOH－H2O（65∶35∶10）下層洗脫，得化合物Ⅳ（15mg）；51～100份合并，經(jīng)反復(fù)中壓柱層析，氯仿－甲醇（含5%水）（95∶5）洗脫，得化合物Ⅴ（20mg）。

（三）結(jié)構(gòu)鑒定與分析

化合物Ⅰ：無色膠狀物（甲醇），經(jīng)鑒定化合物Ⅰ為4－氧代－5－（－O－β－D－葡萄糖基）戊酸正丁基酯4－0－5－（－O－β－D－glucose）valeric acid－n－butylester，結(jié)構(gòu)如下。

解析過程：mp　207～208℃，陽性EI－MS m／z　373．2!M＋Na"＋，189．2!M－162＋H"＋；陰性EI－MS m／z　349．3!M－H"＋；HRFABMS m／z　373．1426［M＋Na］＋。1　HNMR（DMSO－d6，500MHz），13CNMR（DMSO－d6，125MHz），結(jié)果分析見表3－45。

表3－45　1HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz）

化合物Ⅱ：棕色膠狀物（甲醇），經(jīng)分析鑒定為：（R）－3－［3－羥基－4－（－O－β－D－葡萄糖基）－苯基－］－2－羥基丙酸－正丁基酯（R）－3－［3－h(huán)ydroxyl－4－（－O－β－D－glucose）phenyl］－2－h(huán)ydroxylacetic acid－n－butylester，其結(jié)構(gòu)如下。

解析過程：mp　182～183℃，Molish反應(yīng)呈陽性，Libermann－Burnchard反應(yīng)呈陽性EI－MS m／z　439．2!M＋Na"＋，255．2!M－162＋H"＋；陰性EI－MS m／z　415．3!M－H"＋；HRFABMS m／z　439．1551［M＋Na］＋1　HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz），見表3－46。

表3－46　1HNMR（DMSO－d6，500MHz），13　CNMR（DMSO－d6，125MHz）

化合物Ⅲ：白色結(jié)晶（MeOH），經(jīng)分析鑒定為豆甾醇－3－O－β－D－葡萄糖苷，其結(jié)構(gòu)如下。

解析過程：mp　182～184℃，Molish反應(yīng)呈陽性，Libermann－Burnchard反應(yīng)呈陰性。EIMS：588．9（M＋），536．3，475．7，454．6，362．7，224．6，102．4，66．4，1　HNMR：0．56，0．75，0．94，0．94，1．01，1．03（6個CH3）3．6（1H，m，3－H），4．2（1H，d），5．0（2H，m，22－H，23－H），0．31（1H，6－H）．13　CNMR：38．3，31．4，77．0，42．0，140．0，121．0，31．8，49．6，50．6，36．8，20．2，39．8，45．2，56．3，24．9，28．7，55．3，12．2，19．8，40．3，21．2，137．9，128．712，8．7，55．4，29．3，18．2，19．1，25．5，11．9，100．6，73．4，76．7，69．8，67．8，60．9，EI－MS：588．9（M＋），536．3，475．7，454．6，362．7，224．6，102．4，66．4，1　HNMR，13　CNMR：葡萄糖基：1′：δH4．90（d，1H，7．5）δC101．6，2′：δH3．06（t，1H，7．5）δC77．7，3′：δH3．44（t，1H，7．5）δC77．5，4′：δH3．30（t，1H，7．5）δC74．2，5′：δH3．65（m，1H，7．5）δC70．9，6′：δH（dd，2H，13．5，7．5）　δC61．9，豆甾醇基：基本骨架信息與葫蘆烷一致。

化合物Ⅳ：無色膠狀物，鑒定該化合物為4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析過程：1　HNMR（D2O）D：2．55（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．74（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），3．57（3H，s，H－6），4．35（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．43，4．54（2H，d，J＝17．5Hz，H－5）。13CNMR（D2O）D：27．3（C－2），33．4（C－3），52．4（C－6），60．7（Glu－C－6），69．6（Glu－C－4），73．1（C－5），73．5（Glu－C－2），75．6（Glu－C－3），76．1（Glu－C－5），102．2（Glu－C－1），175．9（C－1），208．9（C－4）。上述NMR數(shù)據(jù)與化合物Ⅶ比較，少了一組正丁基的信號，而多了一個甲氧基的信號，故而得出以上結(jié)論。

化合物Ⅴ：白色粉末，維太菊苷一致。解析過程為：mp　273～276℃，IR（KBr）cm－1：3　400（OH），2　960，2　930，1　660（C＝C），1640（C＝C），1　460，1　380，1　080，1　020。ESIMS m／ z（%）：575（M＋＋1），412（M＋－162），394（M＋－162－H2O），275，255，213，83，69，43。與維太菊苷對照品混合熔點不下降。

化合物Ⅵ：淡黃色粉末，該化合物為羅波斯塔黃酮－4′－甲醚。

解析過程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．19（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．49（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．63（1H，s，H－8″），6．81（1H，s，H－3），6．86（1H，s，H－3″），6．93（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），7．23（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．82（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），7．95（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），8．07（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），3．79（3H，s，OCH3），12．9，13．2（各1H，s，5″，5，5－OH），10．4（1H，s，4－OH），10．8（2H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：56．5（OCH3），94．1（C－8″），94．8（C－8），99．6（C－6），103．6（C－3），104．2（C－3″），104．2（C－10″），104．5（C－10），109．3（C－6″），112．4（C－5′），116．7（C－3，5），121．9（C－1），123．1（C－3′），123．3（C－1′），128．6（C－6′），129．2（C－2，6），131．0（C－2′），157．1（C－9″），158．1（C－9），159．6（C－4），161．4（C－5），161．9（C－5″），162．1（C－7″），162．6（C－4′），164．1（C－7），164．4（C－2），164．9（C－2″），182．4（C－4），182．6（C－4″）。上述NMR數(shù)據(jù)與羅波斯塔黃酮－4′－甲醚報道一致。

化合物Ⅶ：淡黃色粉末，為榧雙黃酮。

解析過程：ESI－MSmz：579［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．17（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．65（1H，s，H－6″），6．90（1H，s，H－3″），6．91（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），6．92（1H，s，H－3），7．33（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．59（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），8．05（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），8．16（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），3．76（3H，s，OCH3），3．80（3H，s，OCH3），3．82（3H，s，OCH3），12．9，13．2（各1H，s，5″，5－OH），10．8（1H，s，7－OH）。13 CNMR（DMSO－d6）D：55．5（OCH3），55．9（OCH3），56．5（OCH3），94．8（C－8），96．3（C－6″），99．7（C－6），103．9（C－3″），104．5（C－10″），104．5（C－3），104．8（C－10），105．3（C－8″），112．5（C－5′），115．2（C－3，5），121．9（C－3′），123．3（C－1′），123．4（C－1），128．6（C－2，6），129．0（C－6′），131．5（C－2′），154．1（C－9″），158．1（C－9），161．0（C－4′），162．1（C－5″），161．2（C－5），163．0（C－4），163．3（C－7″），163．9（C－2），164．2（C－2″），164．9（C－7），182．5（C－4），182．8（C－4″）。HMBC譜中3個OCH3上的氫分別和4′，4，7″位碳相關(guān)，2′位氫和8″位碳及6′位碳相關(guān)，說明OCH3連在4′；4，7″位，雙黃酮的兩部分通過3′，8″位連在一起。上述NMR數(shù)據(jù)與榧雙黃酮文獻報道一致。

化合物Ⅶ：淡黃色粉末，為羅漢松雙黃酮A。

解析過程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．07（1H，s，H－6″），6．14（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．20（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．70（2H，d，J＝8．5Hz，H－3，5），6．74（1H，s，H－3），6．78（1H，s，H－3″），6．92（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．75（2H，d，J＝8．5Hz，H－2，6），7．88（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），8．22（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），3．60（3H，s，OCH3），13．0，13．1（各1H，s，5″，5－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：55．2（OCH3），93．9（C－8），98．6（C－6″），101．3（C－6），102．3（C－3），103．0（C－3″），103．0（C－10），103．5（C－10″），103．9（C－8″），114．1（C－3，5），118．4（C－5′），118．9（C－1），122．9（C－3′），123．3（C－1′），126．6（C－6′），126．9（C－2，6），131．4（C－2′），154．7（C－9），157．3（C－9″），160．5（C－4），161．4（C－5），161．7（C－5″），162．3（C－4′），163．7（C－7″），163．9（C－7），164．5（C－2″），164．5（C－2），181．5（C－4），181．6（C－4″）。HMBC譜中OCH3上的氫和4位碳相關(guān)，2′位氫和8″位碳及6′位碳相關(guān)，說明OCH3連在4位，雙黃酮的兩部分通過3′，8″位連在一起，上述數(shù)據(jù)與羅漢松雙黃酮A文獻報道一致。

化合物Ⅷ：淡黃色粉末，為去甲銀杏雙黃酮。

解析過程：ESI－MSmz：551［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．11（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．27（1H，s，H－6″），6．39（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．70（2H，d，J＝9．0Hz，H－3，5），6．69（1H，s，H－3″），6．81（1H，s，H－3），7．28（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．47（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），HdJHzHHddJ2．5，9．0Hz，H－6′），3．75（3H，s，OCH3），12．9，13．1（各1H，s，5，5″－OH）。13 CNMR（DMSO－d6）D：56．4（OCH3），94．9（C－8），99．9（C－6″），99．9（C－6），102．9（C－8″），103．2（C－3″），103．9（C－3），104．1（C－10″），104．5（C－10），112．2（C－5′），116．5（C－3，5），121．9（C－3′），121．9（C－1），123．2（C－1′），128．4（C－2′），128．6（C－2，6），131．7（C－6′），155．1（C－9″），158．2（C－9），161．1（C－4），161．3（C－5″），161．9（C－7″），162．1（C－4′），162．1（C－5），163．7（C－7），163．9（C－2″），166．4（C－2），182．2（C－4″），182．3（C－4）。HMBC譜中OCH3上的氫和4′位碳相關(guān)，2′位氫和8″位碳及6′位碳相關(guān)，說明OCH3連在4′位，雙黃酮的兩部分通過3′，8″位連在一起，上述數(shù)據(jù)與去甲銀杏雙黃酮文獻報道一致。

化合物Ⅸ：淡黃色粉末，確定該化合物為異銀杏雙黃酮。

解析過程：ESI－MSmz：565［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．18（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．40（1H，s，H－6″），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．88（2H，d，J＝8．0Hz，H－3，5），6．90（1H，s，H－3″），6．92（1H，s，H－3），7．33（1H，d，J＝8．5Hz，H－5′），7．58（2H，d，J＝8．0Hz，H－2，6），8．02（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），8．16（1H，dd，J＝2．5，8．5Hz，H－6′），3．73（3H，s，OCH3），3．77（3H，s，OCH3），12．9，13．0（各1H，s，5，5″－OH），10．8（2H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：56．2（OCH3），56．6（OCH3），94．8（C－8），99．3（C－6″），99．6（C－6），103．3（C－8″），104．3（C－3″），104．4（C－3），104．4（C－10″），104．6（C－10），112．4（C－5′），115．2（C－3，5），122．3（C－3′），122．3（C－1），123．2（C－1′），128．5（C－2′），128．9（C－2，6），131．6（C－6′），155．0（C－9″），158．1（C－9），161．1（C－4′），161．3（C－5″），162．1（C－4），162．5（C－5），162．9（C－7″），163．8（C－7），164．0（C－2），164．9（C－2″），182．5（C－4″），182．8（C－4）。上述數(shù)據(jù)與異銀杏雙黃酮文獻報道一致。

化合物Ⅹ：淡黃色粉末，易溶于丙酮，經(jīng)解析過程確證該化合物為穗花杉雙黃酮。

解析過程：ESI－MSmz：537［M－H］－。1　HNMR（DMSO－d6）D：6．18（1H，d，J＝2．0Hz，H－6），6．40（1H，s，H－6″），6．46（1H，d，J＝2．0Hz，H－8），6．71（2H，d，J＝9Hz，H－3，5），6．78（1H，s，H－3″），6．82（1H，s，H－3），7．14（1H，d，J＝9．0Hz，H－5′），7．56（2H，d，J＝9．0Hz，H－2，6），7．98（1H，dd，J＝2．5，9．0Hz，H－6′），8．00（1H，d，J＝2．5Hz，H－2′），13．1，13．2（各1H，s，5，5″－OH），10．8，10．3（各1H，s，7，7″－OH）。13　CNMR（DMSO－d6）D：94．7（C－8），99．3（C－6″），99．5（C－6），103．3（C－3″），103．7（C－10），104．3（C－3），104．4（C－10″），104．6（C－8″），116．5（C－3，5），116．8（C－5′），120．7（C－3′），121．7（C－1′），122．1（C－1），128．5（C－6′），128．9（C－2，6），132．1（C－2′），155．2（C－9″），158．1（C－9），160．2（C－4′），161．2（C－5″），161．7（C－5），162．1（C－4），162．5（C－7″），164．4（C－7），164．5（C－2″），164．8（C－2），182．4（C－4），182．8（C－4″）。上述NMR數(shù)據(jù)與穗花杉雙黃酮文獻報道一致。

化合物Ⅺ：無色膠狀物，鑒定該化合物為4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析過程：1　HNMR（D2O）D：0．95（3H，t，J＝7．5Hz，H－9），1．39（2H，m，J＝7．5Hz，H－8），1．61（2H，m，J＝7．5Hz，H－7），2．59（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．86（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），4．08（2H，t，J＝7．5Hz，H－6），4．31（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．34，4．50（2H，d，J＝17Hz，H－5）。上述NMR數(shù)據(jù)與文獻報道一致。

化合物Ⅻ：無色膠狀物，鑒定該化合物為4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

解析過程：1　HNMR（D2O）D：2．55（2H，t，J＝6．5Hz，H－2），2．74（2H，t，J＝6．5Hz，H－3），3．57（3H，s，H－6），4．35（1H，d，J＝7．5Hz，Glu－H－1），4．43，4．54（2H，d，J＝17．5Hz，H－5）。13 CNMR（D2O）D：27．3（C－2），33．4（C－3），52．4（C－6），60．7（Glu－C－6），69．6（Glu－C－4），73．1（C－5），73．5（Glu－C－2），75．6（Glu－C－3），76．1（Glu－C－5），102．2（Glu－C－1），175．9（C－1），208．9（C－4）。根據(jù)上述NMR數(shù)據(jù)可確定為該化合物為4－氧代－5－（O－β－D－葡萄糖基）－戊酸甲酯。

化合物ⅫⅠ：無色結(jié)晶（甲醇），確證該化合物為苯甲醇O－β－D－葡萄糖苷。

解析過程：1　HNMR（D2O）D：7．17～7．35（5H，m），4．80，4．61（2H，d，J＝11．5Hz），4．38（1H，d，J＝8．0Hz，Glu－H－1）。13　CNMR（D3O）D：136．8（C－1），129．7（C－3，5），128．9（C－2，6），128．6（C－4），69．6（C－7），101．4（Glu－C－1），76．1（Glu－C－5），75．9（Glu－C－3），73．3（Glu－C－2），71．6（Glu－C－4），61．0（Glu－C－6）。

（四）小結(jié)

貓爪草正丁醇提取部位經(jīng)大孔吸附樹脂技術(shù)梯度洗脫，然后使用硅膠吸附層析、中壓液相硅膠柱層析（MPLC）及羥丙葡聚糖凝膠柱層析（Sephadex LH－20）等多種層析分離技術(shù)進行分離，利用Mp［α］，EI－MS，NMR，2DNMR等現(xiàn)代分析技術(shù)鑒定13個化合物，分別為4－氧代－5－（－O－β－D－葡萄糖基）－戊酸－正丁基酯和（R）－3－［3－羥基－4－（－O－β－D－葡萄糖基）－苯基－］－2－羥基丙酸－正丁基酯和豆甾醇－3－O－β－D－葡萄糖苷等。

近10年來雖然我國許多學(xué)者對貓爪草化學(xué)成分進行了較深入的研究，但分離得到苷類成分僅見有β－谷甾醇和豆甾醇二者D－葡萄糖苷的混合物及胡蘿卜苷等。此實驗分離鑒定的3個苷類成分均是首次從該類植物中得到，前2個為新化合物，后一個為已知成分。