抗生素發(fā)酵技術(shù)_生物工藝學(xué)實(shí)驗(yàn)指

綜合實(shí)驗(yàn)八　抗生素發(fā)酵技術(shù)

一、背景知識(shí)

（一）抗生素的歷史

抗生素（Antibiotic）是20世紀(jì)的重要發(fā)明之一。由于早期發(fā)現(xiàn)的抗生素（如青霉素、鏈霉素等）均來自微生物的生命活動(dòng)，而且主要應(yīng)用于細(xì)菌感染的疾病防治，因此它一度被認(rèn)為是微生物在新陳代謝過程中產(chǎn)生，具有抑制他種微生物生長及活動(dòng)，甚至殺死他種微生物的一種化學(xué)物質(zhì)。但隨著抗生素工業(yè)的發(fā)展，抗生素的來源從微生物拓展到植物及動(dòng)物，如從植物中提取的黃連素等?？股氐膽?yīng)用也遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了抗菌范圍，它們被應(yīng)用于抗腫瘤、抗蟲等。因此，目前比較確切的抗生素定義應(yīng)為：“抗生素是生物，包括微生物、植物和動(dòng)物在內(nèi)，在其生命活動(dòng)過程中所產(chǎn)生的（或由其他方法獲得的），能在低微濃度下有選擇地抑制或影響他種生物功能的有機(jī)物質(zhì)?！?/p>

抗生素學(xué)科的發(fā)展是勞動(dòng)人民長期以來與疾病進(jìn)行斗爭的結(jié)果，也是隨著人類對自然界中微生物的相互作用，尤其是對微生物之間的拮抗現(xiàn)象的研究而發(fā)展起來的。早在《左傳》中就有記載說：“叔展曰：有麥曲乎？曰：無?！与喔辜材魏?？”該記載表明，用麥曲可以治療消化系統(tǒng)的疾病。歐洲、南美洲等地，在數(shù)世紀(jì)前也曾用發(fā)霉的面包、舊鞋、玉蜀黍等來治療潰瘍、腸道感染、化膿瘡傷等疾病。因此用微生物產(chǎn)物治療疾病很早就有記載，只是那時(shí)不知其原理。到了19世紀(jì)70年代，法國的Pasteur發(fā)現(xiàn)某些微生物對炭疽桿菌有抑制作用。他提出了利用一種微生物抑制另一種微生物的原理來治療一些由于感染而產(chǎn)生的疾病，并報(bào)道了微生物之間的拮抗現(xiàn)象。1928年，英國細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)葡萄球菌的雙碟上感染了一株霉菌，它能殺死周圍的葡萄球菌。他將此霉菌分離純化后，經(jīng)鑒定為點(diǎn)青霉，并將該菌產(chǎn)生的物質(zhì)命名為青霉素。但因?yàn)槭艿疆?dāng)時(shí)科學(xué)思想的阻礙，即認(rèn)為動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果不能反映人體內(nèi)發(fā)生的情況，或者說以動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果來指導(dǎo)人的醫(yī)學(xué)實(shí)踐是不可靠的。Fleming發(fā)現(xiàn)的青霉素被埋沒了10年。在這10年中，青霉素的應(yīng)用僅作為一種選擇培養(yǎng)基的組分來培養(yǎng)百日咳桿菌。

進(jìn)一步推動(dòng)抗生素發(fā)展的是英國的Florey和Chain。1940年，他們進(jìn)一步研究此菌，從該菌培養(yǎng)液中獲得了青霉素的提取物，并對它的某些特性進(jìn)行了報(bào)告，由此開創(chuàng)了抗生素時(shí)代。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，青霉素毒性很小，并對一些革蘭氏陽性菌引起的一些疾病有較好的療效。青霉素的發(fā)現(xiàn)，使感染性疾病的治療發(fā)生了巨大的變革。青霉素成為第一個(gè)作為治療藥物應(yīng)用于臨床的抗生素。在此基礎(chǔ)上，新興抗生素工業(yè)開始發(fā)展，鏈霉素（1941）、金霉素（1947）、氯霉素（1948）、土霉素（1950）、制霉菌素（1950）等品種相繼被發(fā)現(xiàn)并投產(chǎn)。

20世紀(jì)50年代起，許多國家開始致力于農(nóng)用抗生素的研究。如殺稻瘟素（Blasticidin A）、春日霉素（kasugamycin）、滅瘟素S、井岡霉素等高效低毒的農(nóng)用抗生素相繼出現(xiàn)。20世紀(jì)70年代以來，抗生素品種飛躍發(fā)展。到目前為止，從自然界發(fā)現(xiàn)和分離了4300多種抗生素。通過化學(xué)結(jié)構(gòu)的改造，共制備了約三萬余種半合成抗生素。目前世界各國實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用于醫(yī)療的抗生素約120多種，連同各種半合成抗生素衍生物及鹽類約350余種。其中以青霉素類、頭孢菌素類、四環(huán)素類、氨基糖苷類及大環(huán)內(nèi)酯類為最常用。

（二）抗生素的發(fā)酵工藝與種類

1.抗生素的發(fā)酵工藝

菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵→發(fā)酵液預(yù)處理→提取及精制→成品包裝

（1）菌種

從土壤等自然環(huán)境中篩選獲得能產(chǎn)生抗生素的微生物，經(jīng)過純化、選育后得到菌種。以放線菌為例，菌種保存可采用砂土管法或凍干法處理孢子，長期保存。一般生產(chǎn)用菌株經(jīng)多次移植往往會(huì)發(fā)生變異而退化，故必須經(jīng)常進(jìn)行菌種選育和純化以提高其生產(chǎn)能力。

（2）孢子制備

生產(chǎn)用的菌株須經(jīng)純化和生產(chǎn)能力的檢驗(yàn)，若符合規(guī)定，才能用來制備種子。制備孢子時(shí)，將保藏的處于休眠狀態(tài)的孢子接種到滅菌過的固體斜面培養(yǎng)基上，在一定溫度下培養(yǎng)5～7d或7d以上。為獲得更多數(shù)量的孢子以供生產(chǎn)需要，必要時(shí)可在固體培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。

（3）種子制備

其目的是使孢子萌發(fā)、生長繁殖以獲得足夠數(shù)量的菌絲，后再逐級擴(kuò)大培養(yǎng)。種子擴(kuò)大培養(yǎng)級數(shù)的多少，決定于菌種的性質(zhì)、生產(chǎn)規(guī)模的大小和生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)。擴(kuò)大培養(yǎng)級數(shù)通常為二級。搖瓶培養(yǎng)是在錐形瓶內(nèi)裝入一定數(shù)量的液體培養(yǎng)基，滅菌后以無菌操作接入孢子，放在搖床上恒溫培養(yǎng)。在一級種子罐中培養(yǎng)時(shí)，接種材料為孢子懸浮液或搖瓶的菌絲，接種量一般為1%～5%。從一級種子罐接入二級種子罐接種量一般為5%～20%。在罐內(nèi)培養(yǎng)過程中，需要攪拌和通入無菌空氣，控制罐溫、罐壓，并定時(shí)取樣作無菌試驗(yàn)，觀察菌絲形態(tài)，測定發(fā)酵單位和進(jìn)行生化分析等，并觀察是否有雜菌情況。

（4）培養(yǎng)基的配制

在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中，各菌種的特性不一樣，采用的工藝不同，所需的培養(yǎng)基組成亦有差異。同一菌種，在不同發(fā)酵階段，其營養(yǎng)要求也不完全一樣。因此需根據(jù)要求來調(diào)整培養(yǎng)基的成分與配比。其主要成分包括碳源、氮源、無機(jī)鹽類和前體等。

①碳源。

主要用以供給菌種生命活動(dòng)所需的能量，構(gòu)成菌體細(xì)胞及代謝產(chǎn)物。常用碳源包括淀粉、葡萄糖和油脂類。使用葡萄糖為碳源時(shí)，可采用流加工工藝，有利于提高抗生素產(chǎn)量。

②氮源。

主要用以構(gòu)成菌體細(xì)胞物質(zhì)（包括氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸）和含氮代謝物。常見的有機(jī)氮源有黃豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、尿素、酵母粉、魚粉、蠶蛹粉。常見的無機(jī)氮源包括氨水、硫酸銨、硝酸鹽和磷酸氫二氨等。放線菌在含有機(jī)氮源的培養(yǎng)基中菌絲生長速度較快，菌絲量也較多。

③無機(jī)鹽和微量元素。

抗生素產(chǎn)生菌和其他微生物一樣，在生長、繁殖和產(chǎn)生生物產(chǎn)品的過程中，需要某些無機(jī)鹽類和微量元素。如硫、磷、鎂、鐵、鉀、鈉、鋅、銅、鈷、錳等，其濃度對菌種的生理活性有一定影響。因此，應(yīng)選擇合適的配比和濃度。此外，在發(fā)酵過程中可加入碳酸鈣作為緩沖劑以調(diào)節(jié)pH。

④前體。

在抗生素生物合成中，抗生素生產(chǎn)菌可利用前體物質(zhì)構(gòu)成抗生素分子中的一部分而其本身又沒有顯著改變。前體除直接參與抗生素生物合成外，在一定條件下還能控制菌體合成抗生素的方向并增加抗生素的產(chǎn)量。如苯乙酸、成苯乙酰胺可作為青霉素發(fā)酵的前體。丙醇或丙酸可作為紅毒素發(fā)酵的前體。此外，有時(shí)還需根據(jù)抗生素的合成途徑加入某種促進(jìn)劑或抑制劑，如在四環(huán)素發(fā)酵中加入M-促進(jìn)劑和抑制劑溴化鈉，以抑制金霉素的生物合成并增加四環(huán)素的產(chǎn)量。

⑤培養(yǎng)基的質(zhì)量。

培養(yǎng)基的質(zhì)量應(yīng)予嚴(yán)格控制，以保證發(fā)酵水平?？梢酝ㄟ^化學(xué)分析，并在必要時(shí)作搖瓶試驗(yàn)以控制其質(zhì)量。同時(shí)需注意培養(yǎng)基的滅菌溫度和時(shí)間，若溫度過高、受熱時(shí)間過長亦能引起培養(yǎng)基成分的降解或變質(zhì)。

（5）發(fā)酵

發(fā)酵的目的是使微生物大量增殖并分泌所需的抗生素。發(fā)酵接種量一般為10%或10%以上。在整個(gè)發(fā)酵過程中，需不斷通無菌空氣并攪拌，以維持一定罐壓或溶氧，在罐的夾層或蛇形管中需通冷卻水以維持一定罐溫。同時(shí)，要加入消泡劑或安裝消泡裝置以控制泡沫，加入酸、堿以調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH。有的品種在發(fā)酵過程中還需加入葡萄糖、銨鹽或前體，以促進(jìn)抗生素的產(chǎn)生。

（6）發(fā)酵液的預(yù)處理和過濾

發(fā)酵液的過濾和預(yù)處理的目的不僅在于分離菌絲，還需將一些雜質(zhì)除去。

①發(fā)酵液的預(yù)處理。

發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價(jià)無機(jī)離子（Ca2＋、mg2＋、Fe3＋）和蛋白質(zhì)會(huì)對抗生素的分離純化影響較大，如離子交換的過程中不利于樹脂對抗生素的吸附。

對高價(jià)離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸，則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量；如加磷酸（或磷酸鹽），則既能降低鈣離子濃度，也易于去除鎂離子。

對于蛋白質(zhì)，可利用等電點(diǎn)沉淀的方法將其去除。蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中，屬于兩性物質(zhì)，在酸性溶液中帶正電荷，在堿性溶液中帶負(fù)電荷，而在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小。利用蛋白質(zhì)這一特性，將其從發(fā)酵液中去除。

對熱穩(wěn)定的抗生素發(fā)酵液還可用加熱法預(yù)處理。使蛋白質(zhì)變性、發(fā)酵液黏度降低、加快濾速。

②發(fā)酵液的過濾。

含有抗生素產(chǎn)生菌的發(fā)酵液一般為非牛頓型液體、很難過濾。一般采用鼓式真空過濾機(jī)實(shí)現(xiàn)連續(xù)過濾操作。為加強(qiáng)過濾效果，可在轉(zhuǎn)鼓表層涂以助濾劑硅藻土。當(dāng)轉(zhuǎn)鼓旋轉(zhuǎn)到卸渣區(qū)時(shí)，過濾機(jī)上的刮刀會(huì)將助濾劑及菌體層刮去，以使過濾面不斷更新，達(dá)到連續(xù)過濾的目的。

（7）抗生素的提取

提取的目的是制取高純度的符合藥典規(guī)定的抗生素成品。由于多數(shù)抗生素不穩(wěn)定，故整個(gè)提取過程要求時(shí)間短、溫度低、pH宜選擇對抗生素較穩(wěn)定的范圍。

常用的抗生素提取方法包括溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。

（8）抗生素的精制

這是抗生素生產(chǎn)的最后工序。對產(chǎn)品進(jìn)行精制、烘干和包裝的階段要符合《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》（GMP）的規(guī)定。

2.抗生素的種類

自1940年以來，已發(fā)現(xiàn)的抗生素種類達(dá)幾千種，但在臨床上能應(yīng)用的僅幾百種。隨著新抗生素的不斷涌現(xiàn)，需要將抗生素進(jìn)行分類，以便于研究?，F(xiàn)將常見的分類方法列述如下。

（1）根據(jù)抗生素的生物來源分類

微生物是產(chǎn)生抗生素的主要來源，其中以放線菌產(chǎn)生的為最多，真菌次之，細(xì)菌再次之，而來源于動(dòng)植物的較少。

①放線菌產(chǎn)生的抗生素。

在所有已發(fā)現(xiàn)的抗生素中，由它產(chǎn)生的抗生素占一半以上。其中又以鏈霉菌屬產(chǎn)生的抗生素為最多，諾卡氏菌屬、小單孢菌屬次之。放線菌產(chǎn)生的抗生素主要有氨基糖苷類（如鏈霉素）、四環(huán)類（如四環(huán)素）、大環(huán)內(nèi)酯類（如紅霉素）、多烯類（如制霉菌素）、放線菌素類（如放線菌素D）等。

②真菌產(chǎn)生的抗生素。

在真菌的四個(gè)綱中，不完全菌綱的青霉菌屬和頭孢菌屬的微生物能分泌一些重要的抗生素，如青霉素、頭孢菌素。其次為擔(dān)子菌綱，藻菌綱和子囊菌綱產(chǎn)生的抗生素種類很少。

③細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素。

能產(chǎn)生抗生素的細(xì)菌主要有多黏桿菌、枯草桿菌、芽孢桿菌等。如由多黏桿菌產(chǎn)生的多黏菌素等。

④植物或動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素。

由植物或動(dòng)物產(chǎn)生的抗生素較少，如從大蒜中可提取得到蒜素，從動(dòng)物臟器中能提取得到魚素等。

（2）根據(jù)抗生素的作用分類

按照抗生素的作用，可以分為6個(gè)類別：

①廣譜抗生素。如氨芐青霉素，它既能抑制革蘭氏陽性菌，又能抑制革蘭氏陰性菌。

②抗革蘭氏陽性菌的抗生素。如青霉素等。

③抗革蘭氏陰性菌的抗生素。如鏈霉素等。

④抗真菌抗生素。如制霉菌素等。

⑤抗病毒抗生素。如四環(huán)類抗生素，它對立克次體及較大病毒有一定作用。

⑥抗癌抗生素。如阿霉素等。

（3）根據(jù)抗生素的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類

由于化學(xué)結(jié)構(gòu)決定抗生素的理化性質(zhì)、作用機(jī)制和療效，故按此法分類具有重大意義。但是，許多抗生素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，而且有些抗生素的分子中還含有幾種結(jié)構(gòu)。故按此法分類時(shí)，不僅應(yīng)考慮其整個(gè)化學(xué)結(jié)構(gòu)，還應(yīng)著重考慮其活性部分的化學(xué)構(gòu)造，現(xiàn)按習(xí)慣法分類如下：

①β-內(nèi)酰胺類抗生素。包括青霉素類、頭孢菌素類等，它們都包含一個(gè)四元內(nèi)酰胺環(huán)。

②氨基糖苷類抗生素。包括鏈霉素、慶大霉素等，它們既含有氨基糖苷，也含有氨基環(huán)醇的結(jié)構(gòu)。

③大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。如紅霉素、麥迪霉素（Medicamycin），它們含有一個(gè)大環(huán)內(nèi)酯作配糖體，以苷健和1～3個(gè)分子的糖相連。

④四環(huán)類抗生素。如四環(huán)素、土霉素等，它們以四并苯為母核。

⑤多肽類抗生素。如多黏菌素、桿菌肽等，它們多由細(xì)菌特別是由產(chǎn)孢子的桿菌產(chǎn)生，并含有多種氨基酸，經(jīng)肽鍵縮合成線狀、環(huán)狀或帶側(cè)鏈的環(huán)狀多肽。

（4）根據(jù)抗生素的作用機(jī)制分類

根據(jù)抗生素對致病菌作用的機(jī)制，可分成五類：

①抑制細(xì)胞壁合成的抗生素。如青霉素、頭孢菌素。

②影響細(xì)胞膜功能的抗生素。如多烯類抗生素。

③抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素。如四環(huán)素。

④抑制核酸合成的抗生素。如影響DNA結(jié)構(gòu)和功能的絲裂霉素C。

⑤抑制生物能作用的抗生素。如抑制電子轉(zhuǎn)移的抗霉素。

（5）根據(jù)抗生素的生物合成途徑分類

①氨基酸、肽類衍生物。如青霉素、頭孢菌素等寡肽抗生素。

②糖類衍生物。如鏈霉素糖苷類抗生素。

③乙酸、丙酸衍生物。如紅霉素等丙酸衍生物。

（三）抗生素的作用機(jī)理

抗生素等抗菌劑的抑菌或殺菌作用，主要是針對“細(xì)菌有而人（或其他高等動(dòng)植物）沒有”的機(jī)制進(jìn)行殺傷。主要有4大類作用機(jī)理，分別是抑制核酸合成、蛋白質(zhì)合成、改變細(xì)胞膜的透性和干擾細(xì)胞壁的合成。此外，還可以通過作用于細(xì)胞內(nèi)陽離子、抑制能量代謝等機(jī)制達(dá)到抗菌的效果。

（四）抗生素的應(yīng)用

1.抗生素在醫(yī)療上的應(yīng)用

抗生素在臨床治療中占有重要地位。自發(fā)現(xiàn)抗生素并將其應(yīng)用于臨床上以來，很多感染性疾病的死亡率大幅度下降。但抗生素如使用不當(dāng)，會(huì)帶來許多不良后果，例如細(xì)菌耐藥性逐漸普遍、產(chǎn)生過敏反應(yīng)和由于體內(nèi)菌群失調(diào)而引起的雙重感染等。因此，應(yīng)嚴(yán)防濫用，要嚴(yán)格掌握抗生素的適應(yīng)癥和劑量，并注意用藥時(shí)的配伍禁忌。

2.抗生素在農(nóng)牧業(yè)中的應(yīng)用

不少農(nóng)用抗生素作用強(qiáng)、劑量小，且不易引起環(huán)境污染，故受到歡迎。如春日霉素（Kasugamycin）對防治稻瘟病很有效。在畜牧業(yè)中可用以治療和預(yù)防牲畜的疾病，以及作為幼畜、幼禽的生長刺激劑。在獸醫(yī)臨床上已使用的抗生素有四環(huán)類、桿菌肽等。

（五）抗生素的發(fā)展

1.我國抗生素的發(fā)展

我國抗生素類藥物應(yīng)用極其廣泛，抗生素原料藥企業(yè)的產(chǎn)能和產(chǎn)量已達(dá)世界第一。在2007年，我國抗生素原料藥銷售收入超過350億元人民幣，出口約為22億美元，占所有原料藥出口總額的25%。其中，半合成和頭孢類抗生素占全球市場份額的50%以上。6-氨芐青霉素、烷酸（APA）、土霉素、阿莫西林和頭孢類中間體與原料藥等總量過萬噸，青霉素工業(yè)鹽潛在產(chǎn)能接近10萬噸，市場集中度達(dá)80%。

國內(nèi)抗生素生產(chǎn)企業(yè)積極參與國外高端規(guī)范市場的認(rèn)證。認(rèn)證范圍涵蓋產(chǎn)品質(zhì)量、環(huán)保、職業(yè)健康安全等。企業(yè)仿中有創(chuàng)，在工藝創(chuàng)新上有長足發(fā)展，原料藥生產(chǎn)從低端價(jià)值向高端價(jià)值攀升，不斷提高企業(yè)的綜合競爭優(yōu)勢。同時(shí)我國企業(yè)還積極在技術(shù)、工藝、管理和市場營銷等方面與知名跨國藥企展開合作。

2.國際抗生素的發(fā)展現(xiàn)狀

現(xiàn)在，抗生素類藥物應(yīng)用越來越廣泛，抗生素進(jìn)入了全盛時(shí)代。國際抗生素市場的平均年增長率在8%左右，抗生素市場份額為250～260億美元。各種藥企業(yè)紛紛投入巨資進(jìn)行抗生素藥物的研發(fā)，使抗生素新品不斷涌現(xiàn)。國外通過抗生素生物合成基因的克隆來提高抗生素產(chǎn)量，也是近年來研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

二、實(shí)驗(yàn)簡介

本實(shí)驗(yàn)分為兩部分，第一部分為利用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)抗生素實(shí)驗(yàn)，第二部分為利用放線菌發(fā)酵生產(chǎn)抗生素實(shí)驗(yàn)。通過這兩部分內(nèi)容的學(xué)習(xí)和實(shí)踐，可為今后從事抗生素的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)奠定理論和實(shí)踐基礎(chǔ)。

實(shí)驗(yàn)8-1　多黏菌素E的發(fā)酵

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)細(xì)菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法，熟悉和掌握細(xì)菌種子擴(kuò)培方法和機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的使用，熟悉和掌握多黏菌素E發(fā)酵工藝過程及活性測定方法，熟悉和掌握多黏菌素E發(fā)酵過程中代謝參數(shù)的測定方法。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

多黏菌素是（Polymy xin）最早是1946年由日本小山康夫發(fā)現(xiàn)的一株多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa Var koyama）產(chǎn)生的一組多肽類抗生素。1947年，美國實(shí)驗(yàn)室將其從發(fā)酵液中分離并鑒定。隨著對多黏菌素研究的深入，根據(jù)其結(jié)構(gòu)上的差異，將其分為A、B、C、D、E、K、M、P等組分。在多黏菌素的各個(gè)組分中，由于A、C、D、M等組分存在較大的毒性，而多黏菌素B和E的毒性最小，療效最高，因此真正商品化生產(chǎn)的是多黏菌素B和多黏菌素E。多黏菌素B為人用藥，多黏菌素E為禽畜用藥。含有多黏菌素E的產(chǎn)品的商品名為硫粘菌素（Colistin），也有的稱之為黏桿菌素、抗敵素。多黏菌素E的毒性小、殘留低。大鼠和小鼠的口服LD50，均大于12g/kg，而且口服后有60%～80%從糞便中排出，故臟器中分布極少，屬于低殘留藥物。同時(shí)，多黏菌素E在土壤中極易分解，不易造成環(huán)境污染。

多黏菌素E的結(jié)構(gòu)是環(huán)狀多肽，由10個(gè)氨基酸和1個(gè)具有9個(gè)碳原子的脂肪酸連接而成，各種多黏菌素E的結(jié)構(gòu)差別不大，僅氨基酸的組成和排列略有不同而已，它們的堿性有所區(qū)別。多黏菌素E1和E2的結(jié)構(gòu)見圖1-8-1，兩組分的基團(tuán)差異主要在R基團(tuán)及第3、6、7位上的氨基酸組成上：

圖1-8-1　多黏菌素E1和E2的化學(xué)結(jié)構(gòu)

多黏菌素E1∶R-MOA（b-甲基辛酸）；X-Dab（二氨基丁酸）；Y-D-leu；Z-leu。
多黏菌素E2∶R-IOA（異辛酸）；X-Dab（二氨基丁酸）；Y-D-leu；Z-leu。

多黏菌素E對革蘭氏陰性桿菌有很強(qiáng)的殺菌作用，無論生長期還是靜止期的細(xì)胞均能很快被殺死。它可以治療由志賀氏痢疾桿菌（Shigella dysenteriae）、大腸桿菌（Escherichia coli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aaeruginosa）、沙門氏菌（Salmonella）和普通變形桿菌（Proteus vulgaris）引起的感染。并對霍亂弧菌（Vibro cholerae）、鼠疫桿菌（Yersinia pestis）等也有良好的作用，但對革蘭氏陰性球菌和革蘭氏陽性球菌無作用。它與桿菌肽一同使用時(shí)，較少劑量就可以獲得相同的殺菌效果，即具有良好的協(xié)同作用。由于多黏菌素E具有良好的抗菌效果和低毒、殘留少的特性，可用于飼料添加劑，促使禽畜生長和提高飼料利用率，并且可以防止飼料大規(guī)模生產(chǎn)中常出現(xiàn)的由大腸埃希氏菌和沙門氏菌污染引起的疾病。臨床上常用其硫酸鹽或磺酸鹽，多黏菌素E硫酸鹽用得較多，而其磺酸鹽多用于非腸道給藥途徑，在組織中水解出多黏菌素E起作用。

多黏菌素E的生產(chǎn)菌株——多黏芽孢桿菌，屬于類芽孢桿菌屬。菌體大小為（0.6～0.8）μm×（2.0～5.0）μm，革蘭氏陽性、陰性或可變，兼性厭氧，桿狀，產(chǎn)芽孢。芽孢端生，產(chǎn)莢膜，周生或側(cè)生鞭毛。多黏芽孢桿菌的菌落為白色，圓形，表面濕潤光滑。

多黏菌素E是多黏芽孢桿菌的次級代謝產(chǎn)物，它的生物合成和多黏芽孢桿菌的生長受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵pH值、溶氧、黏度等。同時(shí)還受到一些代謝調(diào)控機(jī)制的控制：磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)和產(chǎn)生菌生長速率的調(diào)節(jié)等。

（三）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種

（1）多黏類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa 1.548），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCCC）。

（2）大腸埃希氏桿菌［Escherichia colicmCC（B）44103］。

2.主要設(shè)備

三角瓶、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、滅菌設(shè)備、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、電子分析天平、電爐、移液槍、試管、溫度計(jì)、不銹鋼鍋、干燥箱、冷凍離心機(jī)、pH計(jì)、磁力攪拌器、滴定管、顯微鏡、10L發(fā)酵罐、多功能微生物自動(dòng)測量分析儀。

3.主要試劑

NaCl、葡萄糖、碳酸鈣、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉，AR級；

牛肉膏、瓊脂、蛋白胨，BR級；

玉米漿干粉、黃豆粉、泡敵，市售。

4.培養(yǎng)基及其制備

（1）斜面試管培養(yǎng)基

①LBG培養(yǎng)基。蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

②LB培養(yǎng)基。蛋白胨1.0%，牛肉膏0.5%，NaCl 0.5%，pH 7.0，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（2）種子培養(yǎng)基

葡萄糖3.0%，蛋白胨1.5%，NaCl 0.3%，CaCO30.4%，pH 7.0，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖5.0%，玉米漿干粉2.0%，氯化鈉0.5%，碳酸鈣1.0%，（NH4）2SO42.0%，黃豆粉2.0%，泡敵0.3%，pH 6.8，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1.發(fā)酵液pH的測定方法

發(fā)酵液經(jīng)離心后取上清液，pH計(jì)直接讀取發(fā)酵液的pH值。

2.發(fā)酵液中還原糖含量測定

發(fā)酵液中還原糖含量方法見附錄2-4。

3.總糖測定方法

總糖測定方法見附錄2-8。

4.發(fā)酵液中氨態(tài)氮含量的測定方法

（1）測定原理

采用甲醛滴定法測定。利用氨基酸的兩性作用，加入甲醛以固定氨基的堿性，使羧基顯示出酸性，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定后定量，以酸度計(jì)測定終點(diǎn)。

（2）測定步驟

吸取5mL樣品，置于100mL容量瓶中，加水至100mL刻度，混勻后吸取20.0mL，置于200mL燒杯中，加60mL水，開動(dòng)磁力攪拌器，用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液［c（NaOH）＝0.05mol/L］滴定至酸度計(jì)指示pH＝8.2，記下消耗體積V1，加入10mL甲醛溶液，混勻。再用氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液滴定至pH＝9.2，記下消耗體積為V2，同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)，記消耗體積為V0。

（3）計(jì)算公式

式中：X—樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/L；

　V1—測定用樣品稀釋液加入甲醛前消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

　V2—測定用樣品稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

　V0—試劑空白試驗(yàn)加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，mL；

　V3—樣品稀釋液取用量，mL；

　c1—?dú)溲趸c標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，mol/L；

　0.014—與1mLNaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液［c（NaOH）＝1mol/L］相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

　c（NaOH）＝0.05mol/L，使用前需要標(biāo)定。

5.發(fā)酵液菌重變化估測方法（濕菌比，%）

取一定體積的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心5min后，量取上清液體積。

6.菌絲體干重的測定方法

取發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心5min后，傾去上清液。底部菌體用去離子水在布氏漏斗中洗滌1次。洗滌后裝入稱量瓶中，在80℃烘箱中烘干至恒重，分析天平稱重。計(jì)算菌絲干重（g/100mL）。

7.發(fā)酵液中磷的測定方法

微量磷的測定一般皆用鉬藍(lán)比色。將磷酸或磷酸鹽在酸性溶液中，加入鉬酸銨使生成黃色磷鉬酸，再加入還原劑，使磷鉬酸還原成鉬酸。與標(biāo)準(zhǔn)磷溶液的顯色作比較，測定含量。

發(fā)酵液中主要含磷原材料，除磷酸二氫鉀為無機(jī)磷外，其他如花生餅粉、蛋白胨等，均由動(dòng)植物有機(jī)體組成，以有機(jī)化合物的狀態(tài)存在。在測定無機(jī)磷時(shí)，為避免有機(jī)磷的干擾，先以正丁醇萃取，再以對二苯酚作還原劑，使顯藍(lán)色。

將發(fā)酵液經(jīng)過濕法氧化處理，發(fā)酵液中的有機(jī)磷被氧化成為磷酸，同樣以鉬酸銨和對二苯酚使顯藍(lán)色，直接測定。由全磷中減去無機(jī)磷，即為有機(jī)磷。

（1）所需試劑

鉬酸銨溶液5%，H2O2溶液30%，H2SO4溶液6mol/L，正丁醇0.2mol/L，對苯二酚，2%水溶液，使用前配制。

混合還原液：95mL亞硫酸氫鈉溶液（15%）和5mL亞硫酸溶液（5%）相混合。

標(biāo)準(zhǔn)磷基準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取分析純磷酸二氫鉀1.0967g，加水溶解，加入氯仿數(shù)滴，用水稀釋至250mL，置冰箱中，在0℃下可保存較長時(shí)間。

標(biāo)準(zhǔn)磷工作溶液：將上述標(biāo)準(zhǔn)磷基準(zhǔn)溶液用水稀釋100倍，當(dāng)日配制。

（2）測定方法

①無機(jī)磷。量取發(fā)酵液10mL于刻度離心管中，滴加硫酸溶液（6mol/L）至呈酸性，加水至準(zhǔn)確20mL，混勻后，離心分離。待上層清澈，量取10mL（相當(dāng)于原發(fā)酵液5mL）加水稀釋成50mL，作為試液。［如無離心機(jī)，可將發(fā)酵液以硫酸溶液（6mol/L）酸化后，用快速濾紙過濾，取濾液稀釋后作試液。］

由試液中量取10～20mL（相當(dāng)于原發(fā)酵液1～2mL）置小型分液漏斗中，加入5mLH2SO4溶液（0.2mol/L）及2mL鉬酸銨溶液，充分混合數(shù)秒鐘，在室溫下放置1min后，加入8mL正丁醇，搖約1min，待分層清晰后，將水層放出棄去。再加15mL水和1mL對苯二酚溶液，混合后放置5～6min，繼續(xù)加入1mL混合還原液，搖勻至正丁醇無色，再放置5～6min，將藍(lán)色水溶液移入量筒，加水稀釋成25mL，在720nm處測定吸收度。同時(shí)作空白試驗(yàn)。

②有機(jī)磷。量取發(fā)酵液5～10mL于小型凱氏瓶中，加入15～30mLH2SO4溶液（6mol/L），置石棉鐵絲網(wǎng)上小心用小火加熱蒸發(fā)，不使劇烈沸騰。待泡沫消失后，改用直接火加熱，至溶液呈褐色時(shí)，放冷，加入30%過氧化氫1～2滴，繼續(xù)加熱，若溶液仍為黃色，再滴加過氧化氫。如此反復(fù)處理至發(fā)生濃白煙，冷卻后溶液清晰無色為止。加水溶解，移入量瓶并稀釋至100mL，作為試液（如溶液渾濁，可用干燥濾紙過濾）。

量取5～10mL試液于量筒中，加水至約15mL，再加2mL鉬酸銨溶液及1mL對苯二酚溶液，混合后，在室溫下放置約20min，再加1mL混合還原液，加水稀釋至25mL，同樣在720nm處測定吸收度。同時(shí)作空白試驗(yàn)。由此法測得的為全磷量，減去無機(jī)磷，即為有機(jī)磷量。

注：發(fā)酵液經(jīng)濕法氧化后，已有相當(dāng)?shù)乃岫?，不必再加硫酸，若系?biāo)準(zhǔn)磷溶液，須加入5mL硫酸銨溶液（0.2mol/L）。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取標(biāo)準(zhǔn)磷工作溶液，分別量取使含磷量為10，20，…，120μg，按照上述操作，用正丁醇萃取和直接用鉬藍(lán)比色，于720nm處測定吸收度，繪制兩種標(biāo)準(zhǔn)曲線。

8.多黏菌素E效價(jià)的測定方法

微生物檢定法（管碟法）測多黏菌素E效價(jià)單位。

（1）樣品處理

取樣，將發(fā)酵液在4℃，8000r/min條件下離心5min后，取上清液。將上清液用磷酸緩沖液適當(dāng)稀釋后，用管碟法測得其發(fā)酵單位。

（2）管碟的制作

將大腸桿菌［CMCC（B）44103］接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)24h后備用。取滅菌并冷卻到50～60℃的LB固體培養(yǎng)基，加入培養(yǎng)皿中，凝固后形成下層培養(yǎng)基。再取1mL大腸桿菌［CMCC（B）44103］菌懸液加到9mL滅菌并冷卻到50～60℃的LB固體培養(yǎng)基中，混勻后倒入培養(yǎng)皿中下層培養(yǎng)基上，凝固。在超凈工作臺(tái)中，向雙層平板中以等距離均勻放置牛津杯（不銹鋼，內(nèi)徑6.0±0.1mm，外徑8.0±0.1mm，高1.0±0.1mm）五個(gè)。向每個(gè)杯中準(zhǔn)確加入250μL（此時(shí)液面與牛津杯高度持平，符合測量要求）左右、用磷酸鹽緩沖液配制的不同濃度的多黏菌素E的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在4℃冰箱中放置4h擴(kuò)散，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

使用ZY-300IV多功能微生物自動(dòng)檢測分析儀或游標(biāo)卡尺測得抑菌圈的直徑，工作站自動(dòng)生成以效價(jià)單位的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑的平方為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。（或用游標(biāo)卡尺測量，以效價(jià)單位的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以抑菌圈直徑的平方為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。）

根據(jù)《中華人民共和國藥典》規(guī)定，利用管碟法測定粘桿菌素效價(jià)，利用E.coli ［CMCC（B）44103］為指示菌時(shí)，其濃度應(yīng)該控制在614～2344U/mL。

（五）實(shí)驗(yàn)步驟

1.實(shí)驗(yàn)流程

圖1-8-2　多黏菌素E硫酸鹽生產(chǎn)流程

2.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）菌種試管活化

將菌種接于液體LBG試管培養(yǎng)基中，37℃，200r/min培養(yǎng)24h。

（2）種子擴(kuò)培

搖瓶種子培養(yǎng)基的配制：按種子培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)基，包裝滅菌。

接種：在超凈工作臺(tái)上，將試管菌種擴(kuò)培后的菌種，以10%的接種量接到種子培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)：將接種好的種子搖瓶放于30℃恒溫?fù)u床上，在轉(zhuǎn)速200r/min，37℃條件下發(fā)酵36h。當(dāng)種子培養(yǎng)液呈稠厚狀，菌體形態(tài)粗壯，即可接入發(fā)酵液。

（3）上罐發(fā)酵（以裝液系數(shù)70%）

發(fā)酵培養(yǎng)基的配制：以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，將除CaCO3和泡敵之外的物料加入罐中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8，加入CaCO3和泡敵，121℃滅菌20min。

火焰保護(hù)接種：將培養(yǎng)36h的搖瓶種子按10%的接種量接種于發(fā)酵罐中。

培養(yǎng)：將接種后的發(fā)酵罐于30℃恒溫培養(yǎng)60h，轉(zhuǎn)速為250r/min。

發(fā)酵樣的測定：接種完畢后，取樣進(jìn)行初始測定。之后每隔6h，取樣測定發(fā)酵液中代謝參數(shù)及上清液效價(jià)。

發(fā)酵過程可能出現(xiàn)泡沫，需準(zhǔn)備滅過菌的泡敵，適時(shí)補(bǔ)加泡敵防止逃液。

發(fā)酵過程可分為三個(gè)不同的代謝期：

①菌體繁殖期。菌體粗壯，繁殖旺盛，菌量迅速增加，培養(yǎng)液外觀轉(zhuǎn)變成黏度很大的糊狀物。

②分泌期。菌體繁殖趨于減弱，培養(yǎng)基中碳源被利用的速度顯著下降，pH下降，多黏菌素E產(chǎn)量迅速上升。

③芽孢形成期。菌體漸老，芽孢數(shù)量逐漸增加，培養(yǎng)液外觀轉(zhuǎn)稀，多黏菌素E的積累量下降，此時(shí)應(yīng)收獲發(fā)酵液。

（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表1-8-1　多黏菌素E發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

（七）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.在投料前，氣路、料路、發(fā)酵罐必須用蒸汽進(jìn)行滅菌，消除所有死角的雜菌，保證系統(tǒng)處于無菌狀態(tài)。

2.培養(yǎng)基在進(jìn)罐之前，應(yīng)先糊化。一般培養(yǎng)基的配制量以罐體全容積的70%左右計(jì)算（泡沫多的培養(yǎng)基為65%左右，泡沫少的培養(yǎng)基可達(dá)75%～80%），考慮到在位滅菌過程會(huì)出現(xiàn)冷凝水，首次向培養(yǎng)基中補(bǔ)水至配制體積的50%左右，不足部分滅菌結(jié)束后補(bǔ)入。

3.滅菌初期應(yīng)只打開夾套蒸汽閥對罐內(nèi)培養(yǎng)基預(yù)熱，以避免產(chǎn)生過多冷凝水。當(dāng)罐內(nèi)溫度升到90℃時(shí)，打開罐上其他進(jìn)氣閥，通入蒸汽，使罐內(nèi)溫度迅速上升到121℃左右。

4.當(dāng)罐壓升至0.1MPa，溫度升到121～123℃時(shí)，控制蒸汽閥門開度，保持罐壓不變，20min后停止供汽。

5.發(fā)酵過程中取樣時(shí)應(yīng)對取樣管路進(jìn)行蒸汽消毒，取樣時(shí)先將發(fā)酵液排出一部分，防止發(fā)酵液與前次的混合，影響測量結(jié)果。

6.發(fā)酵過程中對發(fā)酵液的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確的測定，密切關(guān)注發(fā)酵條件的變化，注意環(huán)境衛(wèi)生及無菌操作，防止發(fā)酵過程染菌。

實(shí)驗(yàn)8-2　鏈霉素的發(fā)酵

（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

學(xué)習(xí)放線菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法，熟悉和掌握種子擴(kuò)培方法和機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐的使用，熟悉和掌握鏈霉素發(fā)酵工藝過程及抗菌活性測定方法，熟悉和掌握鏈霉素發(fā)酵過程中代謝參數(shù)的測定方法，熟悉和掌握鏈霉素的測定方法。

（二）實(shí)驗(yàn)原理

氨基糖苷類抗生素是由氨基環(huán)醇和氨基糖類以糖苷鍵形式結(jié)合而成的一族堿性水溶性廣譜抗生素，主要有鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、巴龍霉素等。近年來還出現(xiàn)了一些新品種，如丁胺菌霉素、妥布霉素、核糖霉素、青紫霉素等。

鏈霉素（Streptomycin）是一種氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12，分子量581.59。它由灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus）產(chǎn)生，能有效地抑制許多細(xì)菌，如結(jié)核桿菌、鼠疫桿菌、大腸桿菌等。目前主要用其鹽治療結(jié)核病、鼠疫、百日咳、細(xì)菌性痢疾、泌尿道感染和主要由革蘭氏陰性細(xì)菌引起的其他傳染病。

鏈霉素是由鏈霉胍、鏈霉糖和N-甲基-L-葡萄糖胺通過糖苷鍵裝配而成的化合物。鏈霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1-8-3。

圖1-8-3　鏈霉素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

鏈霉素游離堿為白色粉末，大多數(shù)鹽類也是白色粉末或結(jié)晶，無臭，味微苦。鏈霉素分子中有3個(gè)堿基基團(tuán)，其中2個(gè)是鏈霉胍上的強(qiáng)堿性胍基，第三個(gè)是葡萄糖胺上的弱堿性甲氨基。因此，鏈霉素在水溶液中隨著pH降低可能依次以4種不同的形式存在：鏈霉素游離堿、一價(jià)陽離子、二價(jià)陽離子和三價(jià)陽離子。鏈霉素分子中含有較多親水性基團(tuán)，易溶于水，難溶于有機(jī)溶劑。鏈霉素鹽酸鹽易溶于甲醇，難溶于乙醇，而硫酸鹽即使在甲醇中也很難溶解。鏈霉素比較穩(wěn)定，空氣和陽光對干燥粉末的影響不大。但鏈霉素的游離堿或鹽均易吸收空氣中的水分而潮解，潮解后含水量增加，易分解，穩(wěn)定性下降。鏈霉素的水溶液比較穩(wěn)定，但穩(wěn)定性受pH和溫度的影響較大。

鏈霉素的生產(chǎn)菌株——灰色鏈霉菌具有發(fā)育良好的菌絲體，菌絲體分支，無隔膜，直徑0.4～1.0μm，長短不一，多核。菌絲體有營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲和孢子絲之分。孢子絲中的分生孢子灰白色，柱形?；疑溍咕木浠野咨笃谏薨櫍奢椛錉?。

鏈霉素是典型的次級代謝產(chǎn)物，其發(fā)酵過程分為菌體的生長期、產(chǎn)物合成期和菌體自溶期三個(gè)階段。灰色鏈霉菌的生長和鏈霉素的生物合成受到許多發(fā)酵條件的影響：溫度、發(fā)酵pH值、溶氧、接種量、泡沫等。同時(shí)還受到一些代謝調(diào)控機(jī)制的控制：磷酸鹽的調(diào)節(jié)作用、分解代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)和產(chǎn)生菌生長速率的調(diào)節(jié)等。

（三）實(shí)驗(yàn)材料

1.菌種

灰色鏈霉菌（Streptomyces griseus，CICC 11002），從中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CCICC）購得。

2.主要設(shè)備

三角瓶、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、滅菌設(shè)備、超凈工作臺(tái)、恒溫水浴鍋、電子分析天平、電爐、移液槍、試管、溫度計(jì)、不銹鋼鍋、干燥箱、冷凍離心機(jī)、pH計(jì)、磁力攪拌器、滴定管、顯微鏡、10L發(fā)酵罐、HPLC色譜儀。

3.主要試劑

硫酸鎂、葡萄糖、碳酸鈣、氫氧化鈉、碘化鉀、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀，AR級；

酵母膏、瓊脂，BR級；

黃豆餅粉、玉米漿干粉、α-淀粉酶，市售。

4.培養(yǎng)基及其制備

（1）斜面試管培養(yǎng)基

酵母膏2.0%，葡萄糖2.0%，K2HPO40.05%，mgSO40.05%，瓊脂2.0%，pH 7.8，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（2）種子培養(yǎng)基

酵母膏6.0%，葡萄糖4.0%，K2HPO41.0%，mgSO41.0%，pH 7.8，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖4.0%，黃豆餅粉0.8%，玉米漿1.5%，（NH4）2SO40.5%，泡敵0.05%，pH 7.2～7.4，在0.1MPa壓力下滅菌20min。

（四）實(shí)驗(yàn)方法

1.發(fā)酵液pH的測定方法

發(fā)酵液經(jīng)離心后取上清液，pH計(jì)直接讀取發(fā)酵液的pH值。

2.發(fā)酵液中還原糖含量測定

發(fā)酵液中還原糖含量方法見附錄2-4。

3.總糖測定方法

總糖測定方法見附錄2-8。

4.發(fā)酵液中氨態(tài)氮含量的測定方法

參見實(shí)驗(yàn)8-1“多黏菌素E的發(fā)酵”部分發(fā)酵液中氨態(tài)氮含量的測定方法。

5.發(fā)酵液菌重變化估測方法（濕菌比%）

取一定體積的發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心5min后，量取上清液體積。

濕菌比%＝（總體積—上清液體積）×100/總體積

6.菌絲體干重的測定方法

取發(fā)酵液經(jīng)8000r/min離心5min后，傾去上清液。底部菌體用去離子水在布氏漏斗中洗滌1次，洗滌后裝入稱量瓶中，在80℃烘箱中烘干至恒重，分析天平稱重。計(jì)算菌絲干重（g/100mL）。

7.發(fā)酵液中磷的測定方法

參見實(shí)驗(yàn)8-1“多黏菌素E的發(fā)酵”部分發(fā)酵液中磷的測定方法。

8.發(fā)酵液中鏈霉素效價(jià)的測定方法

（1）樣品處理

取樣，用草酸將發(fā)酵液酸化至pH 3左右，加熱至（70～75℃），維持2min，使蛋白凝固。之后迅速冷卻、過濾或離心分離。過濾后，所得的酸性濾液進(jìn)行堿液處理，用NaOH調(diào)pH至7.0，備用。

（2）紫外分光光度法

①鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5mg/mL）：準(zhǔn)確稱取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品500mg，加入少量的酸性甲醇溶液溶解，定容至100mL棕色容量瓶中，搖勻儲(chǔ)存在冰箱中。準(zhǔn)確移取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液1、2、3、4、5、6mL，分別置于100mL棕色容量瓶中，用水溶液稀釋至刻度，搖勻。系列中鏈霉素濃度分別為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mg/mL，在波長525nm處讀取吸光度，以水為空白。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

②樣品測定。取樣品處理液5mL，加0.2mol/L氫氧化鈉5mL，置水浴加熱10min。再置冰浴中冷卻5min，加入3mL的1.5%鐵試劑（1.5%鐵試劑的配制：稱取15g硫酸高鐵銨，用0.25mol/L硫酸溶液溶解，并稀釋至1000mL，搖勻即得）搖勻，再加水定容至25mL，放置20min后測定，檢測波長λ525nm。根據(jù)稀釋倍數(shù)，將所測吸光度值查標(biāo)準(zhǔn)曲線，即得樣品效價(jià)。

（3）高效液相色譜法

①色譜柱：C18柱；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈：0.1mol/L草酸（1∶1∶6）：檢測器：UV檢測器；檢測波長：365nm；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL。

②鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（8.0μg/mL）。準(zhǔn)確稱取8.0mg鏈霉素標(biāo)樣，加入少量的酸性甲醇溶液溶解，定容至1000mL棕色容量瓶中，搖勻，儲(chǔ)存在冰箱中。

③鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。準(zhǔn)確移取鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)貯備液2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL，分別置于100mL棕色容量瓶中，用酸性甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻。系列中鏈霉素的濃度分別為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0pg/mL的稀釋液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

④將樣品處理液經(jīng)0.45μm濾膜過濾，進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)峰面積，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得效價(jià)。

（五）實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.實(shí)驗(yàn)流程

圖1-8-4　鏈霉素生產(chǎn)流程

2.實(shí)驗(yàn)步驟

（1）菌種活化

無菌條件下，從甘油凍存管中取適量灰色鏈霉菌孢子涂布在孢子活化固體培養(yǎng)基上，然后置28℃，恒溫培養(yǎng)7～10d。

（2）種子制備

搖瓶種子培養(yǎng)基的配制：按種子培養(yǎng)基成分配比，配制培養(yǎng)基，包裝滅菌。

接種：在超凈工作臺(tái)上，刮取適量孢子于滅過菌的搖瓶種子培養(yǎng)基中。

培養(yǎng)：將接種好的種子搖瓶于28℃恒溫?fù)u床上，轉(zhuǎn)速為230r/min，培養(yǎng)48h左右。

（3）上罐發(fā)酵（以10L罐為例，裝液系數(shù)70%）

①發(fā)酵培養(yǎng)基的配制。

以發(fā)酵培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，將除CaCO3和泡敵之外的物料加入罐中，用NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0～7.2。121℃滅菌20min。

②火焰保護(hù)接種。

在發(fā)酵罐接種口，將搖瓶種子以10%的接種量接種于發(fā)酵罐中。

③培養(yǎng)。

將接種后的發(fā)酵罐于28℃恒溫培養(yǎng)10d，轉(zhuǎn)速為200r/min。

④發(fā)酵樣的測定。

每天需取樣測定pH、總糖、菌濃等指標(biāo)。

發(fā)酵72h后開始每天取樣測發(fā)酵液中鏈霉素的含量。

發(fā)酵過程可能出現(xiàn)泡沫，需準(zhǔn)備滅過菌的泡敵，適時(shí)補(bǔ)加泡敵防止逃液。

⑤第10d放罐。

發(fā)酵結(jié)束，用草酸將發(fā)酵液酸化至pH 3左右。然后通入蒸汽加熱至70～75℃，維持2min，迅速冷卻、過濾或離心分離。過濾后，用NaOH調(diào)濾液pH值至6.7～7.2，以備后續(xù)分離純化使用。

⑥發(fā)酵罐空消。

發(fā)酵罐徹底清洗后，打開排水閥，排盡夾套中的水。同時(shí)排盡蒸汽管中冷凝水后，先對空氣過濾器進(jìn)行滅菌，讓蒸汽徐徐進(jìn)入發(fā)酵罐；對發(fā)酵罐進(jìn)行空消。在滅菌過程中，應(yīng)時(shí)刻注意罐壓，并控制在（0.11～0.12）MPa，請勿超壓。罐壓的控制通過調(diào)節(jié)進(jìn)氣閥和排氣閥來實(shí)現(xiàn)。空消時(shí)間一般為30～50min。到規(guī)定時(shí)間后，關(guān)閉進(jìn)氣閥和排氣閥。當(dāng)罐溫降至80℃以下時(shí)排盡發(fā)酵罐內(nèi)的冷凝水。為防止發(fā)酵罐內(nèi)產(chǎn)生負(fù)壓，必須通入無菌空氣，使罐壓保持在（0.03～0.05）MPa。

（六）實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

表1-8-2　鏈霉素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果記錄

續(xù)　表

（七）實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1.在投料前，氣路、料路、發(fā)酵罐必須用蒸汽進(jìn)行滅菌，消除所有死角的雜菌，保證系統(tǒng)處于無菌狀態(tài)。

2.培養(yǎng)基在進(jìn)罐之前，應(yīng)先糊化。一般培養(yǎng)基的配制量以罐體全容積的70%左右計(jì)算（泡沫多的培養(yǎng)基為65%左右，泡沫少的培養(yǎng)基可達(dá)75%～80%），考慮到在位滅菌過程會(huì)出現(xiàn)冷凝水，首次向培養(yǎng)基中補(bǔ)水至配制體積的50%左右，不足部分滅菌結(jié)束后補(bǔ)入。

3.滅菌初期應(yīng)只打開夾套蒸汽閥對罐內(nèi)培養(yǎng)基預(yù)熱，以避免產(chǎn)生過多冷凝水。當(dāng)罐內(nèi)溫度升到90℃時(shí)，打開罐上其他進(jìn)汽閥，通入蒸汽，使罐內(nèi)溫度迅速上升到121℃左右。

4.當(dāng)罐壓升至0.1MPa，溫度升到121～123℃時(shí)，控制蒸汽閥門開度，保持罐壓不變，20min后停止供汽。

5.發(fā)酵過程中取樣時(shí)應(yīng)對取樣管路進(jìn)行蒸汽消毒，取樣時(shí)先將發(fā)酵液排出一部分，防止發(fā)酵液與前次的混合，影響測量結(jié)果。

6.發(fā)酵過程中對各項(xiàng)發(fā)酵液的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行準(zhǔn)確的測定，密切關(guān)注發(fā)酵條件的變化，注意環(huán)境衛(wèi)生及無菌操作，防止發(fā)酵過程染菌。

7.鏈霉菌是好氧性微生物，因此液態(tài)深層培養(yǎng)時(shí)必須供給足夠的氧氣。通風(fēng)量一般為理論計(jì)算需氧量的2.8～3.0倍，發(fā)酵前、中、后期可根據(jù)發(fā)酵實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，但絕不能中斷供氧，以免導(dǎo)致菌體死亡。

8.鏈霉素發(fā)酵過程中產(chǎn)生泡沫是正?，F(xiàn)象，或泡沫過多，造成溢罐?？墒褂蒙倭恐参镉突蛳輨┻M(jìn)行消泡。

參考文獻(xiàn)

［1］龜田邦明，八木澤守正.抗生素生產(chǎn)的科學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1994.

［2］陳鈞鴻，徐玲娣.抗生素工業(yè)分析［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，1988.

［3］鄒月利.高效液相色譜測定蜂蜜中鏈霉素含量［J］.食品科學(xué)，2006，27（5）.

［4］韓艷霞，占桂榮.灰色鏈霉菌產(chǎn)鏈霉素培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.中國釀造，2008，3（18）.

［5］劉祺，蔣忠科，郭連宏，等.鏈霉菌2754發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取及結(jié)構(gòu)鑒定［J］.中國抗生素雜志，2011，36（6）.

［6］耿予歡，李國基，姚汝華.鏈霉素發(fā)酵的代謝調(diào)控育種及研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22（4）.

［7］王普，張亞庭，王進(jìn)秋，等.鏈霉素發(fā)酵控制［J］.北京工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，19（3）.

［8］陳中碧，湯斌.提高多黏桿菌產(chǎn)硫酸粘桿菌素生物效價(jià)的研究［J］.安徽工程科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，22（3）.

［9］李德培.抗革蘭氏陰性菌促長藥物粘桿菌素［J］.獸藥與飼料添加劑，1999，4（1）.

［10］國家藥典委員會(huì).抗生素微生物檢定法［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［11］沈萍，范秀榮，李廣武.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)［M］.北京：高等教育出版社，1999.

（編者：陳　敏）