以酶為例，發(fā)酵產(chǎn)物的提取過程一般需經(jīng)歷發(fā)酵液的預(yù)處理、固液分離、酶液濃縮、酶的純化、酶成品的制備等過程。酶是比較脆弱的物質(zhì)，如果處理條件不當(dāng)，容易變性失活。在酶提取之前應(yīng)對目的酶的基本性質(zhì)有所了解，如等電點、pH和熱穩(wěn)定性、氧化還原劑對其影響等。

1.發(fā)酵液預(yù)處理

為了防止不完全澄清導(dǎo)致的酶活性損失或防止濾器堵塞，在開始分離之前有必要對發(fā)酵液進行預(yù)處理。發(fā)酵液通常使用絮凝劑以產(chǎn)生較大的絮凝物或凝聚物，進而加速固液分離。

凝聚是指向膠體懸浮液中加入某種電解質(zhì)，在電解質(zhì)中異電離子作用下，膠粒的雙電層電位降低，從而使膠體脫穩(wěn)并使粒子相互聚集成直徑1mm左右塊狀凝聚體的過程。電解質(zhì)的凝聚能力可用凝聚值來表示，使膠粒發(fā)生凝聚作用的最小電解質(zhì)濃度（mmol/L）稱為凝聚值。根據(jù)Schuze-Hardy法則，反離子的價數(shù)越高，該值就越小，即凝聚能力越強。應(yīng)用較廣泛的凝聚劑有Al2（SO4）3·18H2O（明礬）、AlCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、FeCl3和ZnSO4等。

絮凝是指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大相對分子質(zhì)量聚合物）將膠體粒子交聯(lián)成網(wǎng)，形成10mm左右絮凝團的過程。其中絮凝劑主要起架橋作用。絮凝劑是一種能融入水的高分子聚合物，其相對分子質(zhì)量甚至大于一千萬，它們具有長鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團，包括帶電荷的陰離子（如－COOH）或陽離子（如－NH2）基團以及不帶電荷的非離子基團。它們通過靜電引力、范德華力或氫鍵的作用，強烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋連接時，就形成了較大的絮團，這就是絮凝作用。對絮凝劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)一般有兩方面的要求：一方面要求其分子必須含有相當(dāng)多的活性官能團，使之能和膠粒表面結(jié)合；另一方面要求必須具有長鏈的線性結(jié)構(gòu)，以便同時與多個膠粒吸附形成較大的絮凝團，但相對分子質(zhì)量不能超過一定限度，以使其具有良好的溶解性。根據(jù)活性基團在水中解離情況的不同，絮凝劑可分為非離子型、陰離子型和陽離子型三類。根據(jù)其來源不同，工業(yè)上使用的絮凝劑又可分為如下三類：① 有機高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物和聚苯乙烯類衍生物等；②無機高分子聚合物，如聚合鋁鹽和聚合鐵鹽等；③ 天然有機高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖和脫乙酰殼多糖等。

2.固液分離

通常使用真空轉(zhuǎn)筒過濾機和碟片式離心機從發(fā)酵液中去除細(xì)胞、固體或膠體。真空轉(zhuǎn)筒過濾機是一種連續(xù)操作的過濾設(shè)備，其操作流程如圖2-4所示。設(shè)備的主體是一個由篩板組成能轉(zhuǎn)動的水平圓筒（圖2-5），表面有一層金屬絲網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布。圓筒內(nèi)沿徑向被筋板分割成若干個空間，每個空間都以單獨孔道通至筒軸頸端面的分配頭上，分配頭內(nèi)沿徑向隔離成3個室，它們分別與真空和壓縮空氣管路相通。

圖2-4　轉(zhuǎn)筒真空過濾機流程圖

圖2-5　轉(zhuǎn)筒真空過濾機的結(jié)構(gòu)

1—轉(zhuǎn)鼓；2—濾布；3—金屬網(wǎng)；4—攪拌器傳動裝置；5—搖擺式傳動裝置；6—傳動裝置；7—手孔；8—過濾室；9—刮刀；10—分配閥；11—濾液管路

轉(zhuǎn)筒下部浸沒在發(fā)酵液中，圓筒緩慢旋轉(zhuǎn)時（轉(zhuǎn)速0.5～ 2r/min），可順序進行過濾、洗滌、吸干、吹松、卸餅等項操作。即整個圓筒分為過濾區(qū)、洗滌及脫水區(qū)、卸渣及再生區(qū)3個區(qū)域。

過濾區(qū)：圓筒下部的空間與發(fā)酵液相接觸，由于在這個區(qū)的空間與真空管聯(lián)通，于是濾液透過濾布被吸入筒內(nèi)并經(jīng)導(dǎo)管和分配頭排至濾液貯罐中，濾渣則滯留在濾布的表面形成濾餅。為防止發(fā)酵液中固體沉降，在發(fā)酵液槽中安裝搖擺式攪拌器。

洗滌及脫水區(qū)： 當(dāng)圓筒從發(fā)酵液槽中轉(zhuǎn)出后，有噴嘴將洗滌水噴向圓筒面上的濾餅層進行洗滌，由于此區(qū)也與真空管路相通，于是洗滌水穿過濾餅層而被吸入筒內(nèi)，并經(jīng)分配頭引至洗水貯罐中。

卸渣及再生區(qū)：經(jīng)洗滌和脫水的濾餅層繼續(xù)旋轉(zhuǎn)進入此區(qū)，由于此區(qū)與壓縮空氣管路連通，于是壓縮空氣從圓筒內(nèi)向外穿過濾布面將濾餅吹松，隨后由刮刀將其刮除。刮掉濾餅的濾布通壓縮空氣繼續(xù)吹，吹凈殘余濾渣，使濾布再生。

碟片式離心機是目前生產(chǎn)中應(yīng)用最廣泛的離心機，它具有密閉的轉(zhuǎn)鼓，轉(zhuǎn)鼓內(nèi)設(shè)有數(shù)十個至上百個錐角為60° ～120°的錐形碟片，以縮短沉降與分離時間，碟片之間的間隙用碟片背面的狹條來控制，一般碟片間的間隙為0.5～2.5mm。當(dāng)?shù)g的懸浮液隨著碟片高速旋轉(zhuǎn)時，固體顆粒在離心力作用下沉降于碟片的內(nèi)腹面，并連續(xù)向鼓壁沉降，澄清液則被迫反方向移動至轉(zhuǎn)鼓中心的進液管周圍，并連續(xù)被排出。

3.酶液濃縮

常用超濾膜濃縮法。超濾（ultrafiltration）是在加壓的情況下（0.1～0.6MPa由外源氮氣等惰性氣體形成），使酶液通過超濾器，小分子的雜質(zhì)透過膜，而大分子的酶截留在膜腔內(nèi)，達(dá)到酶濃縮和純化的目的。聚丙烯腈、聚烯烴、聚砜、聚醚砜是常用的膜材料，其中聚砜膜和聚醚砜膜耐熱性和pH適應(yīng)性好。膜的孔徑為0.002～0.06μm，截留相對分子質(zhì)量為1000～500000的范圍?？梢愿鶕?jù)目的酶的相對分子質(zhì)量數(shù)量級范圍，選擇不同孔徑大小的超濾膜。膜分離設(shè)備主要有4種形式：板式、管式、中空纖維式和螺旋卷式。采用此法可使酶液濃縮到體積分?jǐn)?shù)為10%～50%，回收率高達(dá)90%。這種方法適用于酶液的濃縮和脫鹽，其優(yōu)點是成本低，操作方便，條件溫和，回收率高；缺點是超濾膜容易被污染，分離效果與物料處理及性質(zhì)密切相關(guān)，需精心保養(yǎng)、清洗。

4.鹽析分離

酶或蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì)，即蛋白質(zhì)在水中借助水化層和帶電荷等性質(zhì)能均勻分散而不凝聚，鹽是一種電解質(zhì)，由于中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)的親水性，當(dāng)加入大量的中性鹽如（NH4）2SO4時，酶表面的水分被脫去，使親水系統(tǒng)變?yōu)樵魉到y(tǒng)，電荷被中和，使酶表面的電荷下降，從而引起可見的凝聚或沉淀現(xiàn)象。使不同微生物的蛋白酶沉淀所加鹽析劑的量是不同的，需通過試驗來確定。有時候也可以利用有機溶劑沉淀的方法實現(xiàn)酶蛋白與液體的分離。

酶制劑干燥的方法較多：氣流干燥、噴霧干燥、沸騰干燥、振動干燥和真空冷凍干燥等。

5.發(fā)酵產(chǎn)物的精制與純化

經(jīng)濃縮、提取的酶液為粗酶液，可以直接應(yīng)用，或進一步處理制成干粉后使用。工業(yè)上可把濃縮后的酶液作為商品粗酶液，或者略濃縮后噴霧干燥，或者鹽析后制成干粉出售。這些粗酶中含有其他蛋白質(zhì)、多糖、脂類和核酸等雜質(zhì)，與目的酶相比，不純物質(zhì)含量很高，要得到較純制品還要去雜純化，大多數(shù)蛋白酶的純化方案是需要依據(jù)酶的性質(zhì)設(shè)計多步的分離程序。常用的純化技術(shù)包括離子交換層析、凝膠過濾、親和層析等。

【注釋】

[1]本章由牟海津、馮娟、孔青、馬悅欣編寫。