低溫與其他外界因素一樣對(duì)組織細(xì)胞有一定的刺激作用。研究表明，低溫同樣可以引起組織細(xì)胞發(fā)生各種各樣的變化包括細(xì)胞膜、細(xì)胞器甚至細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)變化以及生物大分子如蛋白質(zhì)、核酸的改變，從而對(duì)其功能造成一定程度的影響?？乖詠?lái)源于細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)上的抗原決定簇，一旦蛋白質(zhì)各級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，其抗原性勢(shì)必受到影響。有研究證實(shí)，皮膚在低溫儲(chǔ)存后，在異體上存活的時(shí)間較新鮮異體皮膚長(zhǎng)，其主要原因與經(jīng)低溫保存后皮膚抗原性的降低有關(guān)，而抗原性的降低與蛋白質(zhì)的變化關(guān)系密切。

一、皮膚經(jīng)不同溫度低溫儲(chǔ)存后異體移植的比較

皮膚經(jīng)低溫儲(chǔ)存后抗原性發(fā)生變化可以由動(dòng)物移植皮片實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)，將不同溫度儲(chǔ)存的豚鼠皮片移植到小鼠身上，觀察皮片存活日數(shù)（表6-1）。

結(jié)果顯示存活日數(shù)由長(zhǎng)到短依次為-196℃>-80℃>-20℃>-4℃>新鮮皮片，即保存的溫度越低，皮片存活時(shí)間越長(zhǎng)。另外病理組織學(xué)檢查證實(shí)，在皮片移植早期對(duì)植皮床組織的炎性浸潤(rùn)，凡經(jīng)低溫保存的皮片移植組均較新鮮組輕，而且形態(tài)保持也較好。以上結(jié)果說(shuō)明經(jīng)低溫保存后皮片的抗原性降低，保存溫度越低抗原性越弱，移植后存活時(shí)間越長(zhǎng)。

二、不同溫度儲(chǔ)存后皮膚蛋白質(zhì)的變化

低溫生物學(xué)認(rèn)為，生物組織在<0℃環(huán)境中所受到的損傷主要來(lái)自水凍結(jié)后形成的冰晶引起的損害，低溫本身的影響也不能排除。一方面由于水分凍結(jié)為冰晶，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高引起細(xì)胞的脫水，細(xì)胞發(fā)生皺縮造成細(xì)胞膜的損害，細(xì)胞內(nèi)成分發(fā)生泄漏；另一方面，冰晶體是具有幾何形狀的結(jié)構(gòu)，可以刺破細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)成分的泄漏和細(xì)胞膜成分的丟失。另外低溫可造成蛋白質(zhì)超級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)離子鍵的斷裂，引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化以至活性的喪失。

研究已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)，皮膚低溫儲(chǔ)存后其蛋白質(zhì)的成分、含量均有不同程度的降低，改變的程度與保存的方法有明顯的關(guān)系。賈曉明等將人和豚鼠皮片分別用不同方法保存（4℃、-20℃、-80℃、-196℃），復(fù)溫后制成勻漿，進(jìn)行酯酶電泳分析和聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（PAGE）。發(fā)現(xiàn)皮片經(jīng)冷凍保存后，酯酶活性均有所降低，其中4℃保存的皮片酯酶峰值基本消失，-196℃降低程度最??；PAGE的結(jié)果與酯酶分析結(jié)果類(lèi)似，低溫保存的皮片蛋白成分均有變化，-196℃保存的皮片變化最小。考慮到經(jīng)-196℃保存的方法是采用速凍玻璃化的方法，該法可避免在保存過(guò)程中組織細(xì)胞內(nèi)水分的結(jié)晶，因此組織細(xì)胞可以免受冰晶形成所引起的一系列損害。因此，以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明皮膚經(jīng)低溫保存后蛋白質(zhì)成分和活性均有所降低，其原因與冰晶的形成有直接關(guān)系。

三、不同溫度儲(chǔ)存后皮膚抗原性的變化

組織細(xì)胞的抗原性來(lái)源于蛋白質(zhì)表面的抗原決定簇，蛋白質(zhì)的任何變化均可影響其抗原性，特別是蛋白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)的變化可能引起原有抗原決定簇的隱蔽，同時(shí)新的抗原決定簇也可能被暴露和出現(xiàn)；而蛋白質(zhì)的降解則使抗原性大大減弱。

皮膚經(jīng)低溫儲(chǔ)存后抗原性的變化與蛋白質(zhì)變化的規(guī)律是相似的，筆者用人和豚鼠的新鮮皮片以及分別經(jīng)4℃、-80℃、-196℃保存的皮片勻漿制成免疫血清，再分別用上述免疫血清與新鮮皮片勻漿，新鮮皮片免疫血清與各組皮片勻漿作火箭免疫電泳單相免疫擴(kuò)散以及免疫火箭電泳分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)說(shuō)明，經(jīng)不同低溫溫度處理的皮片勻漿抗原性和量均較新鮮皮片由不同程度的降低，其中經(jīng)-196℃保存的皮片降低程度最大，皮片抗原性降低的程度與儲(chǔ)存溫度是有直接關(guān)系的，其變化規(guī)律與蛋白質(zhì)的變化相一致（圖6-1，圖6-2）。

圖6-1　異體皮勻漿免疫火箭電泳圖

上為新鮮皮片勻漿電泳結(jié)果，下為液氮儲(chǔ)存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果

圖6-2　異體皮勻漿免疫擴(kuò)散電泳圖

右為新鮮皮勻漿電泳結(jié)果；左為液氮儲(chǔ)存48h后皮片勻漿電泳結(jié)果

四、不同溫度儲(chǔ)存后皮膚朗格漢斯細(xì)胞（LC）的變化

朗格漢斯細(xì)胞是皮膚內(nèi)介導(dǎo)免疫反應(yīng)，引起同種和異種移植排斥反應(yīng)的重要細(xì)胞。它的變化可以通過(guò)ATP酶染色計(jì)數(shù)法來(lái)觀察。新鮮皮片表皮朗格漢斯細(xì)胞在光鏡下清楚地顯示出樹(shù)突輪廓，胞體呈圓錐形或不規(guī)則形，每個(gè)細(xì)胞均有3～4個(gè)不同形態(tài)樹(shù)突突起。賈曉明等觀察了不同時(shí)間不同溫度儲(chǔ)存的異體皮內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞的變化（圖6-3，圖6-4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)了以下的變化規(guī)律：①在低溫下保存皮膚，朗格漢斯細(xì)胞計(jì)數(shù)均下降；②保存溫度越低，朗格漢斯細(xì)胞計(jì)數(shù)下降越顯著；③從朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量降低的速率來(lái)看，-196℃保存的皮膚朗格漢斯細(xì)胞數(shù)量下降快、4℃的下降慢；④低溫保存后皮片不僅朗格漢斯細(xì)胞的數(shù)量減少，而且形態(tài)結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化，殘存的朗格漢斯細(xì)胞樹(shù)突變短，消失，胞體變形。Abe等也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)深低溫儲(chǔ)存后的皮膚基底層細(xì)胞中的朗格漢斯細(xì)胞上S-100、CD1a等抗原的缺失，電鏡證實(shí)朗格漢斯細(xì)胞雖然存在，但發(fā)生變性，細(xì)胞膜部分缺陷，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)空泡形成。他們認(rèn)為低溫儲(chǔ)存后朗格漢斯細(xì)胞的變性是低溫儲(chǔ)存后皮膚移植物存活延長(zhǎng)的主要原因。

從以上的報(bào)道分析表明，朗格漢斯細(xì)胞對(duì)低溫的刺激較為敏感，低溫保存后皮膚抗原性的降低主要與朗格漢斯細(xì)胞的受損有密切的關(guān)系。