18．4．2　轉(zhuǎn)基因植物SOD的制備方法

目前，從植物體內(nèi)提取純化SOD已有一些成熟方法，基本工藝如下：破碎植物組織；制備粗酶液；硫酸銨分級(jí)沉淀除雜蛋白；超濾濃縮，柱層析得純品。吳丹奇等用硫酸銨分級(jí)沉淀、Sephadex G－100柱層析、DEAE－52柱層析的方法從芥藍(lán)葉中提取純化了超氧化物歧化酶，最高純化倍數(shù)為45．2，比活性為97．3u/mg蛋白（腎上腺素法測(cè)定），獲得的SOD經(jīng)SDS－PAGE呈現(xiàn)單一條帶。曾仕廉等采用硫酸銨沉淀和柱層析法從辣椒提取純化出了Cu，Zn－SOD，1kg辣椒制得166．96mg SOD，比活為328．84u/mg蛋白。俞純方等用丙酮處理、硫酸銨沉淀和柱層析法提取了萵苣中的SOD。

但是要從野生植物中得到SOD，因受來(lái)源影響，非常有限。因此，人們希望通過(guò)轉(zhuǎn)基因手段在植物中大量表達(dá)SOD，進(jìn)而分離純化，豐富SOD生產(chǎn)數(shù)量，降低生產(chǎn)成本，從而使其在醫(yī)藥、食品及日用化工方面得到更為廣泛的應(yīng)用。利用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)是經(jīng)濟(jì)實(shí)用、安全可靠、優(yōu)秀的蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)。利用轉(zhuǎn)基因植物已成功地表達(dá)了多種外源蛋白，對(duì)植物表達(dá)的外源蛋白的理化性質(zhì)、生物活性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及人體實(shí)驗(yàn)方面也取得了重要進(jìn)展。劉曉鵬、袁勤生等利用克隆人的銅鋅超氧化物歧化酶（hCu，Zn－SOD）基因，構(gòu)建了馬鈴薯塊莖特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)hCu，Zn－SOD基因的植物表達(dá)載體pPSCu－SOD；用三親交配法將重組質(zhì)粒pPSCu－SOD轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404，轉(zhuǎn)化馬鈴薯基因得到了轉(zhuǎn)基因植株。PCR和PCR－Southern分析證明，hCu，Zn－SOD基因已整合到馬鈴薯基因組中，Western blot分析表明，hCu，Zn－SOD基因在轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株的塊莖中得到表達(dá)，用NBT光還原法測(cè)定轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖的SOD活性并對(duì)該轉(zhuǎn)基因植物中特異表達(dá)的SOD進(jìn)行了分離純化及性質(zhì)研究，經(jīng)硫酸銨沉淀、Sephadex G－100凝膠過(guò)濾和DEAE－52層析，從200g轉(zhuǎn)基因馬鈴薯塊莖中純化得到15．2mg酶，酶比活達(dá)3　595u/mg蛋白；SOD－PAGE法測(cè)得其亞基相對(duì)分子質(zhì)量為18．8kD。