哺乳動物導(dǎo)入基因獲得表達(dá)是個(gè)非常有用的方法，通過表達(dá)一些細(xì)胞因子或其他功能基因，可研究該基因的功能及調(diào)控，還可用于基因治療。

一、目的基因的獲取

要克隆某一基因并將其導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞，首先必須分離并制備目的基因。目前獲取目的基因的方法主要有通過基因組文庫或cDNA文庫分離篩選基因、人工合成基因及應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase　chain　reaction，PCR）獲取目的基因。PCR技術(shù)將在第3章介紹，其他方法請參考分子克隆或基因工程有關(guān)專業(yè)書籍。

二、目的基因與載體的連接

利用DNA連接酶把目的基因片段和載體DNA連接在一起，成為一個(gè)新的重組分子，這就是DNA的體外連接。目的DNA片段被限制性酶消化后其末端只可能有3種形式：帶有相同的黏性末端、帶有非互補(bǔ)的黏端、帶有平末端。下面介紹他們與載體之間的兩種連接方式。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　移液器、Tip頭、Eppendof管、恒溫水浴箱。

2．試劑與材料　見操作步驟。

【操作步驟】

1．黏性末端連接　為防止載體DNA自身環(huán)化，在連接前需除去載體分子5′端磷酸，使之最大程度抑制載體環(huán)化現(xiàn)象。

（1）建立下列去磷酸基團(tuán)的反應(yīng)體系：線性化載體（已酶切）10μl、10×小牛腸堿性磷酸酶（calf　intestinal　alkaline　phosphatase，CIP）緩沖液2μl（與酶配套）、CIP0．5μl、雙蒸水7．5μl。37℃水浴15min。再加入CIP0．5μl，置55℃水浴45min。

（2）加入2μl　0．5mol／L　EDTA，65℃滅活15min。乙醇沉淀，TE（10mmol／L　pH8．0 Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA）溶解。

（3）0．5ml　Ep管中建立連接反應(yīng)體系：線性化目的基因（0．4μg）4μl、載體DNA（經(jīng)上述CIP處理）1μl、10×連接酶緩沖液1μl（與酶配套）、T4DNA連接酶1μl、加雙蒸水至10μl。16℃水浴12～16h。

2．平－黏端連接

（1）制備目的基因酶切片段（如二端均為EcoRⅠ黏端）。

（2）制備載體酶切片段（一端為EcoRⅠ黏端，一端為其他酶切的黏端）。

（3）用T4連接酶連接匹配的黏末端（見黏性末端連接（3），另一端不匹配，無法連接）。

（4）用Klenow補(bǔ)平不匹配的黏末端：目的DNA和（或）線性載體0．5μg、10×大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段1μl、2mmol／L　dNTP　2μl、加雙蒸水至20μl。37℃水浴1h。

（5）乙醇沉淀，溶于7μl　TE（10mmol／L pH8．0Tris－HCl、1mmol／L　pH8．0EDTA）。

（6）取上述5μlTE，加1μl連接緩沖液、1μl連接酶、雙蒸水13μl作用16～20h。

（7）電泳觀察連接效果（2μl　TE來自（5），作為連接前對照）并估計(jì)含量。

（8）取適量作轉(zhuǎn)化。

【注意事項(xiàng)】　反應(yīng)體系的微升數(shù)僅供參考，關(guān)鍵要定出目的基因和載體DNA的量，并要考慮最低消耗量，如電泳觀察連接效果所需量。

三、外源基因的導(dǎo)入方法

基因?qū)爰?xì)胞的方法主要有四種：磷酸鈣共轉(zhuǎn)染法、DEAE－葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電穿孔法。其中，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染效率較高，使用簡便，目前被多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用，這里對該法做一介紹。

現(xiàn)已有很多廠家可提供脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，其原理是：細(xì)胞膜表面是負(fù)電荷，脂質(zhì)顆粒帶正電荷，可通過電荷間的引力將DNA、mRNA或單股RNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。

【實(shí)驗(yàn)用品】

1．器材　超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、移液器、培養(yǎng)皿、試管、離心機(jī)。

2．試劑　培養(yǎng)基、血清、抗生素、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑如Gibico　BRL公司的Lipofectamine。

3．材料　質(zhì)粒DNA、培養(yǎng)的細(xì)胞。

【操作步驟】

1．貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法

（1）收獲細(xì)胞：將1×105～2×105細(xì)胞重懸于2ml完全培養(yǎng)基中，接種于35mm培養(yǎng)皿中。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，使細(xì)胞達(dá)到50%～80%融合。

（2）在12mm×75mm無菌玻璃試管中制備下列溶液：溶液A（將2～20μg質(zhì)粒DNA溶于100μl無血清培養(yǎng)中）、溶液B（20μl　Lipofectamine稀釋于80μl無血清培養(yǎng)基中）。

（3）合并溶液A和溶液B，輕輕混合。置于室溫15min。

（4）棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，并用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次。

（5）加0．8ml無血清培養(yǎng)基至Lipofectamine－DNA混合物中，混勻后，小心滴加至細(xì)胞上，輕輕混勻。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～24h。

（6）棄去轉(zhuǎn)染液，加2ml完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

（7）轉(zhuǎn)染后48～72h，測定細(xì)胞的瞬時(shí)表達(dá)情況，如用于穩(wěn)定表達(dá)，可于轉(zhuǎn)染48h后更換選擇培養(yǎng)基如G418進(jìn)行篩選。

2．懸浮細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法

（1）收獲細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次。將2×106～3×106細(xì)胞重懸于0．8ml無血清培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)種于35mm培養(yǎng)皿中。

（2）參照貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法制備Lipofectamine－DNA混合物，將制備的Lipofectamine－DNA混合物加至細(xì)胞懸液中，輕輕混勻，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～24h。

（3）加4ml完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

（4）轉(zhuǎn)染后48～72h，800g離心5min收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)情況。