10．2．2　重要的天然抗氧劑

目前研究涉及的天然抗氧劑種類十分繁多，選擇其比較成熟的品種介紹如下。

10．2．2．1　維生素C與維生素E

維生素C和維生素E在體內(nèi)和體外都可參與自氧化的氧化還原反應(yīng)。大量實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明脂類自氧化產(chǎn)生的自由基在均勻的脂相和脂水非均相中交換這兩種維生素。在脂自由基、維生素C和維生素E之間自由基的交換反應(yīng)是很多用維生素C和維生素E混合物保護(hù)食油和食物的方法為基礎(chǔ)。但是應(yīng)當(dāng)注意，脂相是最容易氧化的，也是維生素E的最好溶劑，而維生素C則進(jìn)不去，這就是為什么要制備抗壞血酸脂，即抗壞血棕櫚酸的原因，因?yàn)樗梢圆糠秩茉谥嘀小?/p>

抗壞血棕櫚酸可以非常有效地保護(hù)食物不受氧化變性，特別是有維生素E存在的食物油的保護(hù)效果（見(jiàn)表10－6）。對(duì)豬油的保護(hù)效果只有在很高濃度才表現(xiàn)出來(lái)，因?yàn)樨i油中幾乎不含維生素E。從生理的觀點(diǎn)十分容易理解，抗壞血棕櫚酸很容易模擬抗壞血酸和棕櫚酸，在胃腸道中這個(gè)脂鍵被水解正好是人類飲食的正常反應(yīng)。

表10－6　抗壞血棕櫚酸在80℃的抗氧化作用（x天后的過(guò)氧化值/（μmol/L））

人們利用EPR研究了水溶性維生素C和脂溶性維生素E之間的作用，證明了抗壞血棕櫚酸在第一相中有效地保護(hù)了食物的氧化變性，抗壞血棕櫚酸被氧化，同時(shí)還原了維生素E自由基。在第二相中只有所有的抗壞血棕櫚酸被氧化后，維生素E自由基才能被檢測(cè)到。根據(jù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)，有可能用各種不同卵磷脂將維生素C和維生素E融合在一個(gè)親脂相中。

10．2．2．2　β－胡蘿卜素

許多植物含有胡蘿卜素，它包括α，β，γ－胡蘿卜素及玉米黃素。胡蘿卜素是維生素A的前體，在β－胡蘿卜素15－15′加二氧酶參與下，β－胡蘿卜素中心部位2個(gè)碳原子與氧作用生成視黃醛。維生素A包括視黃醇（retinol）、視黃醛（retinal）和視黃酸酯（retinyl ester）。維生素A分為A₁和A₂兩種。

維生素A是視覺(jué)、生殖、維持細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育等正常功能所必需的。此外，它可調(diào)節(jié)銅藍(lán)蛋白和血液中的銅，是一種抗氧劑。

β－胡蘿卜素的抗氧化作用主要表現(xiàn)為能猝滅單線態(tài)氧，也可作為一種自由基捕捉抗氧劑發(fā)揮其抗氧化作用。它既可釋放能量，又能吸收能量，以此來(lái)使其構(gòu)型發(fā)生變化。

β－胡蘿卜素在正常攝取量和低于2×10⁴Pa氧壓或正常氧壓條件下通過(guò)共價(jià)結(jié)合而產(chǎn)生酮或過(guò)氧化物并和單線態(tài)氧反應(yīng)；相反在高壓氧的條件下則表現(xiàn)出氧化增強(qiáng)作用，產(chǎn)生一系列副作用或毒性，這就是臨床上所見(jiàn)服用過(guò)量維生素所產(chǎn)生的副反應(yīng)。如使體內(nèi)維生素E的氧化加速，則維生素C在體內(nèi)減少，SOD、GSH含量下降。

目前，由β－胡蘿卜素對(duì)細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)功能而表現(xiàn)出的抗癌作用，已在臨床上受到重視。

10．2．2．3　谷胱甘肽

谷胱甘肽是一種由甘氨酸、半胱氨酸和γ－谷氨酸組成的含巰基的非蛋白抗氧劑。GSH是機(jī)體內(nèi)所含的非蛋白巰基化合物數(shù)量最多和巰基數(shù)最高的化合物，高達(dá)500×10^－9mol/g～1　000×10^－9mol/g組織，而氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量較少，正常情況下GSH/GSSG為500（見(jiàn)表10－7）。

表10－7　某些組織中SH基化合物的含量

圖10－6　抗壞血酸和α－生育酚的往返機(jī)制及其在體內(nèi)的氧化還原鏈

GSH在整個(gè)機(jī)體氧化還原鏈中和維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于自穩(wěn)態(tài)方面起著關(guān)鍵性作用，這是由其本身的結(jié)構(gòu)和生化性質(zhì)所決定的。

GSH在抗壞血酸和α－生育酚氧化還原鏈中可使脫氫抗壞血酸在抗壞血酸還原酶作用下還原成抗壞血酸，最新報(bào)道已用實(shí)驗(yàn)證實(shí)人紅血球可攝取細(xì)胞外之DHA（甘二碳六烯酸）在細(xì)胞內(nèi)還原成抗壞血酸，以維持細(xì)胞內(nèi)的自穩(wěn)態(tài)。在紅血球內(nèi)還原型抗壞血酸的再生是依賴于大量的GSH。而GSH可通過(guò)化學(xué)的或酶促反應(yīng)極為迅速地直接將DHA還原成抗壞血酸。此報(bào)道并認(rèn)為此還原途徑不包括抗壞血酸自由基。

此外，GSH和NADPH偶聯(lián)使細(xì)胞內(nèi)之LOOH還原成LOH。

總之GSH是一個(gè)極為重要的抗氧劑，可清除自由基。GSSG/GSH的比值反映了體內(nèi)的氧化還原水平。

10．2．2．4　金屬硫蛋白

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是指一類低相對(duì)分子質(zhì)量、高巰基含量、能大量結(jié)合重金屬離子、性能獨(dú)特的蛋白質(zhì)。由于含半胱氨酸（25%～30%）且能結(jié)合重金屬（Zn，Cr，Ag，Hg等），故稱為金屬硫蛋白。

MT具有的結(jié)構(gòu)特征決定了它具有的及其重要的生理功能：①清除自由基及抗輻射作用，保護(hù)細(xì)胞損傷，防止細(xì)胞衰老；②參與金屬代謝調(diào)節(jié)，具有重金屬解毒作用；③MT是“看家”基因編碼的蛋白質(zhì)，在胚胎發(fā)育、生長(zhǎng)、分化過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用。

特別是MT具有清除自由基能力，故是有效的細(xì)胞保護(hù)劑。實(shí)驗(yàn)表明，MT能顯著減輕細(xì)胞缺氧/高氧的損傷，增加細(xì)胞的存活率，降低細(xì)胞內(nèi)Ca^2＋的積累，抑制膜脂過(guò)氧化。用馬來(lái)酰亞胺作為自旋標(biāo)記紅細(xì)胞膜來(lái)研究MT的抗輻射和抗自由基的作用，當(dāng)引入自由基或γ－射線作用于紅細(xì)胞膜時(shí)，結(jié)果表明含有MT的基質(zhì)紅細(xì)胞膜比對(duì)照組受損傷程度要小得多，過(guò)氧化程度明顯低，紅細(xì)胞膜構(gòu)象沒(méi)有受到破壞。

目前，從研究小分子含硫化合物發(fā)展到含硫蛋白等大分子化合物，從植物中分離出植物含硫蛋白，用基因工程技術(shù)制備較大量的富硫蛋白供研究和應(yīng)用。給家兔注射大劑量硫酸鋅可誘導(dǎo)體內(nèi)合成大量的金屬硫蛋白，用轉(zhuǎn)基因海藻細(xì)胞合成MT。同時(shí)，還純化出ZnMT₁和ZnMT₂。通過(guò)可見(jiàn)吸收光譜和熒光發(fā)射光譜法發(fā)現(xiàn)MT尚可對(duì)自由基損傷有修復(fù)作用。最新研究結(jié)果表明MT可使紅血球溶血減少，且ZnMT₁比ZnMT₂作用明顯。用EPR波譜和自旋標(biāo)記法證明MT有清除羥自由基和拮抗電離輻射的能力，其清除羥自由基的能力次序?yàn)閆nMT₂＞ZnMT₁＞CdMT₂＞CdMT₁。最新研究結(jié)果證明ZnMT₂基因可在各種類型細(xì)胞和器官中表達(dá)，而MT₁基因表達(dá)的專一性更強(qiáng)。據(jù)此可解釋，不同亞型MT基因非等同表達(dá)而產(chǎn)生生理功能的差異。此外，還要特別注意研究含硫化合物的免疫增強(qiáng)作用與抗氧化作用的關(guān)系。

10．2．2．5　銀杏葉提取物

銀杏葉提取物作為藥物，始于20世紀(jì)70年代，這種藥物適用于冠心病，并取得了一些療效。當(dāng)時(shí)，德、法兩國(guó)將銀杏葉提取物用于治療腦血管疾病，取得較好療效。之后生產(chǎn)銀杏葉制劑的國(guó)家發(fā)展到美國(guó)、瑞士、日本、比利時(shí)等國(guó)。在我國(guó)有很多生產(chǎn)廠家，其中以天寶寧規(guī)模較大，銷(xiāo)售市場(chǎng)也從歐洲發(fā)展到美洲，近年又進(jìn)入香港和臺(tái)灣地區(qū)，年銷(xiāo)售額高達(dá)10億美元以上。

銀杏葉提取物臨床上主要用來(lái)治療腦供血不足和早期的神經(jīng)退行性病變，能緩解頭昏、頭痛、眩暈，改善和增強(qiáng)記憶力等。銀杏葉提取物的作用可能是單個(gè)活性成分或多種活性成分共同作用的結(jié)果，最重要的是黃酮類和萜類，而銀杏內(nèi)酯是其特有的。癡呆是由于神經(jīng)元的丟失，傳遞功能受損及產(chǎn)生自由基引起脂質(zhì)過(guò)氧化等原因造成的。銀杏葉提取物的不同組分通過(guò)不同機(jī)理作用于不同階段來(lái)減輕智力功能障礙。

（1）改善血液循環(huán)作用。腦缺血可以引起低氧、能量代謝障礙及代謝產(chǎn)物蓄積，實(shí)驗(yàn)證實(shí)EGb能增加腦血流及改善微循環(huán)，大鼠經(jīng)30min的EGb處理后，明顯延長(zhǎng)低氧狀態(tài)下的存活期，這主要由于它所含的銀杏內(nèi)酯（ginkgolides）具有抗血小板激活因子（PAF）的作用，能降低血液黏稠度和紅細(xì)胞聚集，從而改善血液的流變性，降低毛細(xì)血管的通透性。

（2）保護(hù)腦組織抗腦水腫的作用。腦水腫是由外傷或毒物引起神經(jīng)組織水潴留造成的，分為細(xì)胞毒性和血管源性兩種。在三乙基錫（triethyltin）細(xì)胞毒損傷的大鼠腦水腫模型中，EGb有對(duì)抗腦水腫的作用，它能防止缺血缺氧引起的氧化磷酸化脫偶聯(lián)反應(yīng)，保持線粒體的正常呼吸，維持鈉泵功能，防止水鈉潴留及其引起的一系列病理過(guò)程，其作用主要與銀杏內(nèi)酯有關(guān)。

（3）清除自由基保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。EGb有清除多種自由基的作用，是一種廣譜的自由基清除劑。我們的實(shí)驗(yàn)表明它具有清除羥自由基、超氧陰離子自由基和一氧化氮，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，其作用強(qiáng)度與自由的酚羥基數(shù)目有關(guān)，5OH（myricetin）＞4OH（quercetin）＞3OH（fisetin，kaempferol，rutin），其結(jié)構(gòu)中呋喃環(huán)上C2～C3位間雙鍵和B環(huán)兩個(gè)鄰位羥基基團(tuán)是作用所必需的。

10．2．2．6　不同結(jié)構(gòu)五味子素對(duì)氧自由基的清除作用鏈

五味子的有效成分包括一組五味子素，主要有五味子酚（Sal）、五味子醇甲（SolA）、五味子甲素（SinA）、五味子乙素（SinB），其結(jié)構(gòu)如圖10－7所示，這些結(jié)構(gòu)不同的五味子素具有不同的藥理作用。為了探討它們藥用作用不同的根源，我們用自旋捕集技術(shù)研究了不同結(jié)構(gòu)五味子素在不同體系中對(duì)氧自由基的清除作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)構(gòu)不同的五味子素對(duì)氧自由基的清除作用不同。

圖10－7　五味子素的分子結(jié)構(gòu)

表10－8　五味子素對(duì)氧自由基的清除率/%

由表10－8中的數(shù)據(jù)可以看出五味子素SolA和SinB對(duì)Fenton反應(yīng)的羥基自由基的清除作用都是很強(qiáng)的，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)維生素E，甚至超過(guò)維生素C。在光照核黃素體系五味子素SinB對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力比對(duì)超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)。

五味子素對(duì)羥基自由基的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力說(shuō)明，五味子素對(duì)細(xì)胞和組織的保護(hù)作用可能是通過(guò)清除體內(nèi)產(chǎn)生的羥基自由基起作用的。

比較五味子醇甲和五味子乙素的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，它們的結(jié)構(gòu)很類似，唯一的區(qū)別是五味子乙素上有一個(gè)二氧甲基基團(tuán)少了兩個(gè)甲氧基。我們知道甲氧基是斥電子基團(tuán)，而二氧甲基基團(tuán)是吸電子基團(tuán)。在一個(gè)分子同時(shí)存在一個(gè)斥電子基團(tuán)和一個(gè)吸電子基團(tuán)時(shí)，必然導(dǎo)致分子在某個(gè)區(qū)域缺電子，這個(gè)區(qū)域正好是自由基進(jìn)攻的位點(diǎn)，這可能是造成SinB比SolA清除氧自由基效果好的原因。

（2）不同構(gòu)型五味子素對(duì)氧自由基的清除作用。生物合成和酶的催化反應(yīng)，不僅對(duì)底物和反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)有特異的要求，而且還常常有異構(gòu)體的要求，例如生物合成幾乎都要求L－構(gòu)型的氨基酸。藥物分子也是如此，結(jié)構(gòu)相同，構(gòu)型不同，其藥效可能相差很遠(yuǎn)。在分離五味子有效成分時(shí)發(fā)現(xiàn)每種結(jié)構(gòu)的五味子素還具有不同異構(gòu)體，它們的藥理作用也可能有所不同，因此本節(jié)討論這一問(wèn)題。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相同結(jié)構(gòu)而構(gòu)型不同的五味子素其清除氧自由基的能力也有區(qū)別。

圖10－8　幾種五味子素的異構(gòu)體

10．2．2．7　茶多酚

茶多酚占茶葉干重的30%左右?？茖W(xué)實(shí)驗(yàn)表明，茶多酚能有效地清除氧自由基和脂類自由基，預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化、延緩機(jī)體衰老等。這里重點(diǎn)介紹茶多酚對(duì)不同體系氧自由基的清除作用。

（1）茶多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。為了定量測(cè)定茶多酚對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用，利用光照核黃素/EDTA體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基。當(dāng)把茶多酚和其他抗氧劑加入這一體系后，超氧陰離子自由基被不同程度地清除。表10－9列出了茶多酚和其他幾種抗氧劑對(duì)超氧陰離子自由基的清除率，由表10－9中的數(shù)據(jù)可以看出，維生素C對(duì)這一光照體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的清除率最大，其次是兩種茶多酚，再其次是玫瑰香精和維生素E，姜黃素的清除率最低。

表10－9　茶多酚等天然抗氧劑對(duì)光照核黃素/EDTA體系產(chǎn)生超氧陰離子自由基的清除作用/%

（2）茶多酚對(duì)羥基自由基的清除作用。為了定量測(cè)定茶多酚對(duì)羥基自由基的清除作用，利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基。當(dāng)把茶多酚和其他抗氧劑加入這一體系后，羥基自由基被不同程度地清除。表10－10列出了茶多酚和這幾種抗氧劑對(duì)羥基自由基的清除率。由表10－10中的數(shù)據(jù)可以看出姜黃素對(duì)這一體系中產(chǎn)生的羥基自由基的清除率最大，其次是維生素C和維生素E，兩種茶多酚和玫瑰香精對(duì)這一體系產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用不明顯。

表10－10　茶多酚對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基的清除作用/%

（3）茶多酚清除氧自由基的協(xié)同作用。茶多酚是一種多酚類物質(zhì)，它包含四種單體成分，其結(jié)構(gòu)如圖10－9所示。這四種單體對(duì)氧自由基的清除作用也是不同的，它們混合在一起對(duì)氧自由基的清除有協(xié)同作用和最佳清除比例。

圖10－9　茶多酚的四個(gè)單體的結(jié)構(gòu)式

（4）四種兒茶素對(duì)氧自由基的清除效率。由于這四種兒茶素的結(jié)構(gòu)不同，它們對(duì)氧自由基的清除效率也不一樣，表10－11給出了用化學(xué)發(fā)光法和ESR技術(shù)測(cè)量的結(jié)果。

表10－11　茶多酚四種單體對(duì)超氧陰離子自由基的清除率/（nmol/L）

由表中的數(shù)據(jù)可以看出具有較多酚羥基的兒茶素具有較強(qiáng)的抗氧化能力。這幾種兒茶素對(duì)氧自由基的清除能力按以下關(guān)系遞減：EGCG＞ECG＞EC＞EGC。

10．2．2．8　丹參酮對(duì)氧自由基的清除作用

丹參的有效成分包括丹參酮（tanshinone）、隱丹參酮（cryptotanshinone）、二氫丹參酮（dihydrotanshenone）、丹參素（danshensu）、丹參酸（danshensuan）等。丹參酮是脂溶性的，丹參素是水溶性的。臨床應(yīng)用較多的還是丹參提取液，其中包括各種有效成分。丹參酮及其磺酸化的水溶性衍生物也被用于臨床。

圖10－10　丹參酮和丹參素的分子結(jié)構(gòu)

（1）丹參素對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。用DMPO捕集的黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基的ESR波譜，在反應(yīng)體系中加入不同濃度的丹參素，就會(huì)對(duì)超氧陰離子自由基產(chǎn)生不同的清除作用。實(shí)驗(yàn)表明，2×10^－5mol/L丹參素可以清除大約57%的超氧陰離子自由基，2×10^－4mol/L丹參素幾乎清除了所有的超氧陰離子自由基，IC₅₀大約為1．5×10^－5mol/L。在這一濃度范圍內(nèi)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)丹參酮對(duì)這一體系產(chǎn)生的超氧陰離子自由基有任何清除作用，只有當(dāng)?shù)⑼獫舛雀哌_(dá)2．3×10^－3mol/L時(shí)，才能清除大約27%的超氧陰離子自由基。

（2）丹參對(duì)心肌缺血再灌流損傷產(chǎn)生氧自由基的清除作用。圖10－11為家兔缺血再灌流心肌在低溫的ESR波譜及在灌流液中加入SOD，過(guò)氧化氫酶或丹參注射液對(duì)ESR波譜的影響。由圖可以看出，在缺血再灌流心肌中有一個(gè)g＝2．004　5和g＝2．040　0的氧自由基信號(hào)，加入SOD以后，這一信號(hào)幾乎完全清除，加入過(guò)氧化氫酶只能部分清除這一信號(hào)，加入丹參注射液可以和加入SOD一樣完全清除氧自由基信號(hào)。

圖10－11　丹參酮對(duì)心肌缺血再灌流損傷產(chǎn)生自由基的清除作用

a．缺血再灌流心肌；b．缺血再灌流加SOD心肌；c．缺血再灌流加過(guò)氧化氫酶心??；d．缺血再灌流加丹參心肌

（3）丹參素對(duì)大鼠心肌缺血再灌流致線粒體變化的影響。離體大鼠心臟隨機(jī)分為四組：分別為對(duì)照組，有氧灌流40分鐘；缺血組，停止灌流40分鐘；再灌流組，停止灌流40分鐘后再有氧灌流20分鐘；丹參素組，預(yù)先用含有4×10^－6mol/mL丹參素灌流液灌流后再進(jìn)行缺血再灌流。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，線粒體膜脂質(zhì)過(guò)氧化物含量，缺血組為2．51±0．48nmol/mg蛋白，缺血再灌流組為3．02±0．63nmol/mg蛋白，都明顯高于對(duì)照組的1．94±0．35nmol/mg蛋白，P值小于0．01。而丹參素組為1．66±0．56nmol/mg蛋白，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。利用ESR自旋標(biāo)記技術(shù)研究線粒體膜流動(dòng)性發(fā)現(xiàn)，在線粒體膜深層，缺血再灌流組的序參數(shù)和旋轉(zhuǎn)相關(guān)時(shí)間分別為S＝0．112±0．006和τc＝（7．13±0．09）×10^－10s，比對(duì)照組的S＝0．103±0．007和τc＝（6．86±0．20）×10^－10s顯著降低，而丹參素組的S＝0．109±0．005和τc＝（6．94±0．12）×10^－10s與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。