自組裝和化學(xué)成分對(duì)腐植酸礦化影響的比較

Moustafa M.R.Khalaf1，2　Gabriela Chilom1　James A.Rice1　著　張水勤3　袁亮3　譯

(1　南達(dá)科塔州立大學(xué)化學(xué)與和生物化學(xué)系　美國(guó)　57007　2　米尼亞大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系　埃及　61519　3　中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所　北京　100081)Comparison of the Effects of Self-assembly and Chemical Composition on Humic Acid Mineralization

摘　要：本研究的目的在于定量評(píng)估有機(jī)質(zhì)自組裝對(duì)其抗微生物礦化作用的影響。從風(fēng)化褐煤、兩種泥炭和一種礦質(zhì)土壤中分離出的腐植酸被用作有機(jī)質(zhì)樣品，因?yàn)槠鋪?lái)源和有機(jī)成分性質(zhì)提供了一個(gè)廣泛的變化范圍。以苯-甲醇為提取劑，將原始的腐植酸樣品分解成為腐植酸組分和腐植酸-脂質(zhì)復(fù)合物；用堿溶液從腐植酸-脂質(zhì)復(fù)合物中進(jìn)一步提取出兩性腐植酸組分和脂質(zhì)組分。根據(jù)以上各組分在腐植酸中的準(zhǔn)確比例，混合各自固體組分，制成與自組裝樣品化學(xué)成分一致的物理混合物。添加原始的腐植酸及其相應(yīng)的混合物為唯一的碳源，使用礦質(zhì)土壤中分離出的菌株開(kāi)展獨(dú)立的有氧培養(yǎng)試驗(yàn)。礦化培養(yǎng)125天后，自組裝樣品礦化量比相應(yīng)的物理混合物高70%。13C固態(tài)核磁共振光譜所得的碳類(lèi)型分布和疏水性指數(shù)結(jié)果表明，自組裝樣品的礦化程度與其化學(xué)成分不相關(guān)。物理混合物和組分的礦化程度因化學(xué)成分而不同，且存在著烷基碳優(yōu)先礦化的現(xiàn)象。以上研究結(jié)果表明，腐植酸的微生物礦化與其自組裝程度有關(guān)。

關(guān)鍵詞：土壤有機(jī)質(zhì)　腐植酸　自組裝　礦化　熱容量　核磁共振　測(cè)熱法

Moustafa M.R.Khalaf1,2,  Gabriela Chilom1 , James A.Rice1 write,  Zhang Shuiqin3 , Yuan Liang3 translate

(1　Department of Chemistry and Biochemistry, South Dakota State University, Brookings, SD 57007, USA　2 Department of Chemistry, Faculty of Science, Minia University, Minia 61519, Egypt　3 Institute of Agricultural Resources and Regional Planning, CAAS, Beijing, 100081)

Abstract: The purpose of this study was to quantitatively assess the effect of organic matter self-assembly on its resistance to microbial mineralization.Humic acids isolated from leonardite, two peats and a mineral soil were used as organic matter samples because they provide a broad range of variability in terms of origin and the nature of their organic components.Using a benzene-methanol extraction the original humic acid samples were disassembled into humic components and a humic-lipid composite.The composite was further disassembled by using an alkaline aqueous extraction into humic amphiphilic and lipid components.Mixtures that reproduced the composition of self-assembled samples were prepared by mixing the solid individual fractions in the exact proportions that they were present in the original material.The original humic acid and their corresponding mixtures were added as the sole carbon source in separate aerobic cultures containing a microbial consortium isolated from a mineral soil.After incubation for 125 days mineralization of the self-assembled samples was shown to be higher by as much as 70% compared to their corresponding physical mixtures.The extent of mineralization of the selfassembled samples was not correlated to chemical composition base on the carbon-type distribution or hydrophobicity index derived from 13C solid-state NMR spectra.Mineralization of the physical mixtures and fractions did vary with chemical composition and was accompanied by preferential mineralization of alkyl carbon.These results suggest the microbial mineralization of humic acids is related to their self-assembly.Key words: soil organic matter; humic acid; self-assembly; mineralization; heat capacity; nuclear magnetic resonance; calorimetry

天然的有機(jī)質(zhì)是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最大的碳庫(kù)；土壤有機(jī)質(zhì)(SOM)是生物碳庫(kù)的4倍之大。SOM礦化向大氣中排放的CO2比人為活動(dòng)的排放量高一個(gè)數(shù)量級(jí)，這使得人們對(duì)SOM持久性的研究興趣增加，并使通過(guò)土壤碳循環(huán)模型預(yù)測(cè)土壤及地表環(huán)境中SOM持久性方面的研究得到了長(zhǎng)足的發(fā)展；而目前對(duì)調(diào)控SOM持久性分子過(guò)程的理解水平卻限制了這些模型預(yù)測(cè)SOM對(duì)環(huán)境變化的長(zhǎng)期響應(yīng)能力。這些模型大部分通過(guò)用生物學(xué)穩(wěn)定性(不穩(wěn)定、穩(wěn)定、難破壞和惰性)、分解速率(快速、中速和慢速)和周轉(zhuǎn)時(shí)間(短、長(zhǎng)、很長(zhǎng))定義的碳庫(kù)中的至少3個(gè)來(lái)描述SOM參與碳循環(huán)的過(guò)程。以上模型基于有機(jī)組分抗分解的主要原因是其化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗性作用機(jī)制。最近的研究挑戰(zhàn)了抗性的概念且引入了一個(gè)新的基本概念來(lái)解釋有機(jī)質(zhì)存在的持久性，這種新興的觀點(diǎn)強(qiáng)調(diào)了僅有分子結(jié)構(gòu)不能解釋SOM的持久性，還需要考慮有機(jī)質(zhì)與環(huán)境之間的交互作用。

最新的SOM分子集合模型也是基礎(chǔ)概念的一部分，其強(qiáng)調(diào)了有機(jī)質(zhì)組分之間及其與礦物質(zhì)的交互作用而非這些組分的自身化學(xué)組成特性。Wershaw(1994)認(rèn)為SOM是“膜模型”中以溶液中的微團(tuán)形式、土壤和沉積物中的包裹礦物顆粒雙層膜形式存在的有序集；Piccolo(2001)提出了“超分子”模型，認(rèn)為SOM是因分子間作用力和多分子間復(fù)雜性而異的較小分子聚集的超分子集合構(gòu)造；Kleber等(2007)引入了“帶狀模型”，即SOM是多種以離散序列吸附在礦物表面的兩性分子構(gòu)成的混合物；Chilom和Rice(2009)認(rèn)為SOM具有自然分層自組裝或自組織的系統(tǒng)，該系統(tǒng)中各組分通過(guò)范德華力、氫鍵和疏水性等相互作用，以及以非共價(jià)或弱的交互作用有序排列。通過(guò)改變各組分之間的交互作用環(huán)境條件能夠影響自組裝過(guò)程。自組裝和非自組裝腐植酸熱容量之間的比較，能夠?yàn)镾OM的自身組成提供直接依據(jù)。

組裝材料的特性差異和其不同于原材料的行為能力是自組裝的特征之一。例如，Salloum等 (2001)對(duì)天然有機(jī)質(zhì)樣品進(jìn)行分級(jí)結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)有機(jī)碳1-萘酚的吸附系數(shù)(K0C)不同于其原材料。在SOM組織狀態(tài)和微生物降解持久性方面數(shù)據(jù)的缺乏可能是決定環(huán)境中有機(jī)質(zhì)穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。

本文的研究目的是通過(guò)區(qū)分有機(jī)質(zhì)化學(xué)成分中組織的影響，定量評(píng)估有機(jī)質(zhì)自組裝對(duì)其微生物礦化作用的影響。文中進(jìn)行了以下比較：1)樣品的礦化是在同一原材料下的具有相同化學(xué)成分的樣品進(jìn)行的物理混合，來(lái)確定對(duì)自組裝的影響；2)以化學(xué)成分和自組裝作為變量影響礦化的相對(duì)重要性。該方法為有機(jī)質(zhì)的組成狀況如何影響SOM的穩(wěn)定性和如何運(yùn)用以上影響增加有機(jī)質(zhì)在土壤中的殘留時(shí)間提供了信息與線索。

1　材料與方法

1.1 有機(jī)質(zhì)樣品

本研究中所使用的原材料分別為：國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)提供的風(fēng)化褐煤(Lot no.BS104L)；國(guó)際腐殖質(zhì)學(xué)會(huì)提供的Pahokee泥炭(Lot no.BS103P，采自美國(guó)科羅拉多中部的一種被歸類(lèi)為Cryohemist的泥炭土)；一種被歸類(lèi)為細(xì)粉質(zhì)的，混合了Udic Haploborolls的礦質(zhì)土。后兩種土壤分別代表了Guanella Pass(GP)泥炭和Poinsett粉壤土。以上材料提取的腐植酸化學(xué)成分(如，風(fēng)化褐煤的NMR光譜結(jié)果表明，其腐植酸中幾乎僅包含芳香族和脂肪族碳成分，而Poinsett 粉壤土的腐植酸具有典型的腐植酸碳類(lèi)型分布)變化較大，這也是選取其作為研究材料的原因。

通過(guò)傳統(tǒng)的堿提取方法從以上材料中提取自組裝有機(jī)質(zhì)。沒(méi)有進(jìn)一步處理的原始腐植酸樣品為HA0。根據(jù)Chiolom等(2009)的提取步驟，按Soxhlet提取法：用苯:甲醇共沸混合物(3:1，v:v)保持72 h，提取出組分L0；L0移除后，HA0提取后的組分為HA1。之后用堿浸提L0組分，以進(jìn)一步分離，獲得兩性組分HA2和脂質(zhì)組分L1。具體分級(jí)見(jiàn)圖1。

圖1　從原材料中分離腐植酸(HA0)及其組分(HA1, L0, HA2, L1)的步驟示意圖

Fig.1 Schematic diagram of the procedure to isolate humic acid (HA0)and its fractions (HA1, L0, HA2, L1)from source materials.

每個(gè)樣品的碳質(zhì)量平衡，計(jì)算初始物料中每種組分的豐度。根據(jù)碳質(zhì)量平衡，按嚴(yán)格的比例，混合各自最初狀態(tài)下的組分，從而分別得到HA0和L0的物理混合物。第一種混合物為與HA0相對(duì)應(yīng)的HA0/3，是HA1、HA2和L1的混合物；第二種混合物為與L0相對(duì)應(yīng)的L0/2，是HA1和L1的混合物。

運(yùn)用日本島津公司總有機(jī)碳分析儀測(cè)定所有樣品中有機(jī)碳含量。該儀器的工作原理是：自由CO2氣流作用下，有機(jī)質(zhì)催化氧化，通過(guò)紅外吸附測(cè)定CO2的量得到樣品中有機(jī)碳含量。

1.2　礦化試驗(yàn)

按以下方法配制營(yíng)養(yǎng)液：3 g NaNO3、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O和0.01 g FeSO4溶于1L無(wú)菌去離子水。按照先前步驟中所描述的以有機(jī)質(zhì)樣品充當(dāng)該試驗(yàn)的唯一碳源，即將70～100 mg干的有機(jī)質(zhì)樣品添加至裝有100 mL營(yíng)養(yǎng)液的250 mL玻璃瓶中。由于該溶液包含先前配好的0.1 M NaOH，因此該溶液最終pH為7.5。玻璃瓶旋蓋用硅/聚四氟乙烯材質(zhì)，氣體進(jìn)出口用聚四氟乙烯管填充。每天通過(guò)進(jìn)口管向玻璃瓶通入CO2自由氣體15 min，而此時(shí)出口管保持打開(kāi)狀態(tài)以維持培養(yǎng)試驗(yàn)期間的有氧環(huán)境。其他時(shí)間，通過(guò)兩個(gè)方向的真空關(guān)閉該系統(tǒng)。

從新鮮的Poinsett土樣中獲得菌劑，4 ℃保存，備用。土壤樣品中加100 mL無(wú)菌去離子水，制成懸液，往復(fù)式振蕩機(jī)劇烈過(guò)夜振蕩。該懸浮液用微量的葡萄糖(0.5 g/L)濃縮，置于暗處，37℃條件下保存24 h。用一次性的無(wú)菌注射器分取0.5 mL該懸浮液，通過(guò)硅/聚四氟乙烯管分別加入每個(gè)含有SOM和營(yíng)養(yǎng)液的玻璃瓶中。每個(gè)有機(jī)質(zhì)樣品和對(duì)照(對(duì)照僅有營(yíng)養(yǎng)液和SOM溶液)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，暗處將其置于回旋式振蕩器室溫下振蕩125天。通過(guò)瓶蓋封口片用無(wú)菌注射器定期從瓶中移出少量的培養(yǎng)液以測(cè)定pH，保證試驗(yàn)處于恒定的環(huán)境；同時(shí)，運(yùn)用連續(xù)的稀釋和Czapek-Dox瓊脂板固定檢測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。

培養(yǎng)后期，3個(gè)重復(fù)的溶液合成1個(gè)，并用HCl酸化。將上述溶液離心過(guò)濾以分離出沉淀中的有機(jī)質(zhì)，45 ℃下真空電爐干燥后，研成粉末，稱(chēng)重并測(cè)定其有機(jī)碳含量。通過(guò)計(jì)算有機(jī)碳初始量和培養(yǎng)后的量的差別，得出礦化量，以初始有機(jī)碳含量的百分?jǐn)?shù)表示。根據(jù)初步短期礦化試驗(yàn)結(jié)果，風(fēng)化褐煤和GP泥炭的標(biāo)準(zhǔn)偏差低于10%。由于以上樣品不進(jìn)行其他的分析，因此，分別對(duì)每個(gè)樣品短期礦化試驗(yàn)碳含量進(jìn)行了3次測(cè)定。

1.3　13C固態(tài)核磁共振光譜

主要碳組分的相對(duì)豐度用13C固態(tài)核磁共振光譜檢測(cè)，從而了解培養(yǎng)前后有機(jī)質(zhì)樣品的化學(xué)構(gòu)造。檢測(cè)儀器為布魯克公司的Avance 300光譜儀，在頻率為75 MHz和高速旋轉(zhuǎn)(13 kHz)條件下，與通過(guò)TOSS試驗(yàn)中CP/T1獲得的T1C修正相結(jié)合，用直接偏振魔角旋轉(zhuǎn)(DPMAS)記錄13C核磁共振光譜結(jié)果。有機(jī)質(zhì)樣品直接決定了DPMAS的循環(huán)延遲時(shí)間，在3～6 s之間。將樣品塞入聚三氟氯化乙烯蓋子、直徑為4 mm的氧化鋯轉(zhuǎn)子里，如果樣品量有限，可向轉(zhuǎn)子中加入鋁土等惰性材料以確保樣品位于探測(cè)器線圈之內(nèi)。通過(guò)以下化學(xué)位移區(qū)域整合13C核磁共振光譜以確定碳組分含量：0～50 ppm，烷基碳；50～108 ppm，氧烷基碳；108～160 ppm，芳香碳；160～212 ppm，羧基/羰基碳(運(yùn)用軟件擴(kuò)充光譜儀操作系統(tǒng))。有機(jī)質(zhì)的疏水性指數(shù)以(烷基碳+芳香碳)與(烷氧基碳+羧基碳)的比率計(jì)算。

1.4　差示掃描量熱法

用裝有LTC-50低溫冷卻組件的日本島津公司DSC-50差示掃描量熱儀開(kāi)展差示掃描量熱法試驗(yàn)，用銦和鋅標(biāo)準(zhǔn)物的熔解溫度和人造藍(lán)寶石(NISST SRM 720)的熱容量校準(zhǔn)儀器。通過(guò)三次連續(xù)的測(cè)定結(jié)果得到樣品的熱容量，其中，第一次測(cè)量池為空，第二次用參考材料(人造藍(lán)寶石)充滿(mǎn)，第三次用需要檢測(cè)的樣品充滿(mǎn)，整個(gè)測(cè)定過(guò)程中參比池均為空。每個(gè)試驗(yàn)從測(cè)定開(kāi)始到最終結(jié)束溫度，加熱速度為5 ℃/min，從10℃升至70℃，且保持等溫時(shí)間5 min。為確保痕量水分或有機(jī)溶劑的移除，所有樣品均置于60 ℃真空電爐中保存24 h，稱(chēng)重，預(yù)熱(以20 ℃/min的速度將溫度從室溫升到100 ℃，并保持30 min)。所有的試驗(yàn)均用未封口的標(biāo)準(zhǔn)鋁池。

2　結(jié)果

2.1　有機(jī)質(zhì)樣品的組成

每個(gè)HA0及其組分的13C DPMAS固態(tài)核磁共振光譜如圖2所示。烷基(0～50 ppm)、氧烷基(50～108 ppm)、芳香族(110～160 ppm)和羧基/羰基(160～220 ppm)的光譜區(qū)域均出現(xiàn)了寬且明顯的碳峰。烷基區(qū)域的面積受29 ppm處的峰所控制，表明長(zhǎng)鏈聚亞甲基結(jié)構(gòu)的存在。此外，在15和20 ppm處還出現(xiàn)了其他雙峰，這是由于短鏈碳?xì)浠衔锖烷L(zhǎng)鏈烷類(lèi)聚合物的末端碳原子存在的緣故。在氧烷基區(qū)域72 ppm處出現(xiàn)了共振現(xiàn)象，表明了糖類(lèi)、纖維素、乙醇和(或)醚的存在；50～60 ppm處是甲氧基、次甲基和季碳的特征峰；肩峰的存在通常歸因于陸生材料中木質(zhì)素的存在。芳香碳共振區(qū)域主要受129 ppm處峰值的影響，該峰值的出現(xiàn)表明未被取代的和被烷基取代的芳香碳的存在。145～162 ppm化學(xué)位移處的共振說(shuō)明了酚碳的存在。羧基碳區(qū)域的主要峰值位于172 ppm處，表明了羧基、酯和氨基化合物碳的存在。

原始腐植酸樣品(HA0)中，不同的碳類(lèi)型分布規(guī)律揭示了樣品之間的異同之處。四種原始HA0樣品除風(fēng)化褐煤外其他樣品中羧基/羰基碳相對(duì)含量相似，氧烷基碳含量的情況與此規(guī)律一致。Guanella腐植酸中的烷基碳含量最高，為41%；而其他HA0樣品中烷基碳含量相似，約為15%～20%。風(fēng)化褐煤腐植酸中芳香碳含量最高，為56%；而Pahokee泥炭、Poinsett土壤和Guanella泥炭中芳香族碳的含量依次降低，分別為43%、34%和19%。

以有機(jī)溶劑和水為浸提劑，浸提得到HA0中不同碳類(lèi)型的分布，見(jiàn)表1。有機(jī)溶劑可浸提出16%～30%以有機(jī)酸脂質(zhì)混合物L(fēng)0形態(tài)存在的碳。該浸提過(guò)程提取了約一半的烷基碳和三分之一的其他類(lèi)型碳。因此，HA1的烷基碳有所減少，但芳香碳的相對(duì)含量高于原始HA0樣品。四種材料中HA1形態(tài)與HA0樣品具有變化趨勢(shì)一致的芳香性。用水浸提L0混合物能夠從兩性的腐植酸分子中分離出脂質(zhì)腐植酸組分。該脂質(zhì)組分含有特定的烷基碳(其主要光譜位于烷基峰處)，而HA2組分的光譜結(jié)果則表征了烷基、烷氧基和羥基/羧基碳的存在，且HA2組分中烷基碳的相對(duì)含量高于原始腐植酸樣品。

自組裝樣品(HA0和L0)及其相應(yīng)混合物(HA0/3和L0/2)的碳類(lèi)型分布見(jiàn)表2。試驗(yàn)結(jié)果表明，自組裝樣品及其相應(yīng)的物理混合物的試驗(yàn)誤差完全一致；它們化學(xué)成分相似，表明提取過(guò)程中其化學(xué)成分沒(méi)有發(fā)生大的變化，因此有機(jī)質(zhì)的化學(xué)改性使微生物降解行為出現(xiàn)差異的可能性極小。

2.2　有機(jī)質(zhì)樣品的自組裝

材料的比熱容與其結(jié)構(gòu)直接相關(guān)，因此，先前研究中，我們提出可運(yùn)用比熱容來(lái)獲取復(fù)雜的可溶性有機(jī)碳中的結(jié)構(gòu)信息。原始的自組裝腐植酸(HA0)及其對(duì)應(yīng)的物理混合物比熱容的比較測(cè)定結(jié)果表明腐植酸有連續(xù)兩個(gè)的組織結(jié)構(gòu)。L0是第一層次，其是兩性分子HA2和類(lèi)脂L1交互作用合成的材料。HA0是第二層次，其是L0和HA1交互作用的結(jié)果。第一層次的特征是比熱容增加，而第二層次的比熱容則降低(見(jiàn)表3)。熱容的減少被普遍認(rèn)為是分子間相互作用的增加或交聯(lián)，從而使結(jié)構(gòu)更加緊實(shí)、柔韌度變差。Larson等(1997)認(rèn)為，低品位煤暴露在溶脹溶劑中形成一個(gè)高度相關(guān)的結(jié)構(gòu)，其熱容量增加。與相對(duì)應(yīng)的擴(kuò)展部分(即體積)相比，納米晶體材料表面能部分對(duì)系統(tǒng)整體能量貢獻(xiàn)更大，因此，其被觀察到熱容量增加。Chilom和Rice(2009)認(rèn)為第一有機(jī)質(zhì)組織層次(L0的產(chǎn)物)熱能的增加是由于納米級(jí)結(jié)構(gòu)L0的形成，因此，L0和HA0的樣品測(cè)定結(jié)果均支持自組裝結(jié)構(gòu)的形成和比熱容變化。與HA0樣品相比，L0樣品的比熱容變化更大，表明這些樣品結(jié)構(gòu)組成更為廣泛。

圖2　腐植酸(HA0)及其組分(HA1, L0, HA2, L1)的13C DPMAS固態(tài)核磁共振光譜

Fig.2 13C DPMAS solid state NMR spectra of samples of humic acid (HA0)and its fractions (HA1, L0, HA2, L1)derived from Guanella peat (a), Poinsett soil (b), Pahokee peat (c)and leonardite (d)
注：腐植酸及其組分來(lái)源(a)Guanella泥炭，(b)Poinsett土壤，(c)Pahokee泥炭，(d)風(fēng)化褐煤。

表1　不同來(lái)源的腐植酸樣品中有機(jī)質(zhì)組分分布百分比*

注：*分布規(guī)律是根據(jù)分級(jí)提取步驟中每一步碳質(zhì)量平衡計(jì)算腐植酸中總有機(jī)碳百分比；a表示分級(jí)后腐植酸中總有機(jī)碳百分比。

表2　從13C DPMAS核磁共振光譜計(jì)算得到的自組裝樣品及其相應(yīng)物理混合物的相對(duì)碳類(lèi)型分布*

注：13C核磁共振總峰面積的百分比，括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表3　20～50℃范圍內(nèi)自組裝樣品及其相應(yīng)混合物平均比熱容(CP)的差異

注：CP為比熱容。

2.3　樣品的礦化

溶解性有機(jī)質(zhì)樣品作為單一碳源培養(yǎng)125天后，其被土壤微生物礦化的程度存在差異，試驗(yàn)測(cè)得的礦化值恰好在關(guān)于土壤腐植酸微生物降解研究測(cè)得值的范圍內(nèi)。

四種材料HA0樣品的礦化表現(xiàn)出較大的變化(見(jiàn)圖3)。Guanella泥炭的HA0樣品碳礦化比最高，為43%；隨后是Poinsett土壤、Pahokee泥炭和風(fēng)化褐煤的，分別為28%、18%和6%。

各組分比較結(jié)果(見(jiàn)圖4)表明，所有材料中L0的礦化程度最高，占總有機(jī)碳的35%～43%。兩性組分HA2和脂質(zhì)組分L1的礦化程度分別為20%～44%和13%～30%。微生物似乎對(duì)每種材料中HA1組分的利用最少，整個(gè)試驗(yàn)中該組分僅有4%～26%發(fā)生了礦化。

圖3　從Guanella泥炭(GP)， Poinsett土壤(PS)，Pahokee泥炭

(PP)和風(fēng)化褐煤(LED)分離出的腐植酸(HA0)樣品的礦化率Fig.3 Mineralization of humic acid(HA0)samples isolated from Guanella peat(GP), Poinsett soil(PS), Pahokee peat(PP)and leonardite(LEO)
注：誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差，下同。

圖4　分離出的各腐植酸組分(HA1，L0，HA2和L1)的礦化率
Fig.4 Mineralization of humic acid fractions (HA1, L0, HA2, and L1)isolated from Guanella peat (a), Poinsett soil (b), Pahokee peat (c)and leonardite (d)

注：腐植酸組分來(lái)源(a)Guanella泥炭，(b)Poinsett土壤，(c)Pahokee泥炭，(d)風(fēng)化褐煤。

研究中L0混合物的礦化程度高于其相應(yīng)的混合物(L0/2)(見(jiàn)圖5a)。HA0的連續(xù)礦化模式高于HA0/3混合物(見(jiàn)圖5b)，盡管4個(gè)樣品中有3個(gè)的差異均未達(dá)到顯著水平(P=0.05)。L0/2和HA0/3的混合物礦化行為與其各組分的礦化總量相等。

2.4　生物降解下有機(jī)質(zhì)樣品化學(xué)組成的變化

用13C固態(tài)核磁共振光譜對(duì)培養(yǎng)125天后的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行表征，并與培養(yǎng)前的樣品進(jìn)行比較，評(píng)估其化學(xué)組成的變化。計(jì)算每個(gè)樣品培養(yǎng)前后相對(duì)的碳類(lèi)型分布作為每個(gè)峰區(qū)所占面積與光譜分析總面積的比例，這一百分比和總有機(jī)碳后面被用于計(jì)算培養(yǎng)前后樣品中碳類(lèi)型的絕對(duì)量。具體見(jiàn)圖6。

圖5　從Guanella泥炭(GP)，Poinsett土壤(PS)，Pahokee泥炭(PP)和風(fēng)化褐煤(LEO)分離出的自組裝樣品及其相應(yīng)物理混合物的礦化率

礦化后，HA0樣品中烷基和氧烷基碳減少。Guanella泥炭，Poinsett土壤，Pahokee泥炭的HA0樣品中烷基和氧烷基碳減少50%～60%，而風(fēng)化褐煤HA0中約減少20%。培養(yǎng)125天后，HA0樣品中未發(fā)現(xiàn)芳香碳和羧基碳的變化。

其他組分中烷基和氧烷基碳也表現(xiàn)出了明顯且一致性的降低。大多數(shù)HA1組分未觀察到其余碳類(lèi)型的其他變化。L0混合物中各類(lèi)型碳均有所降低，包括芳香碳和羧基碳，其中，L0混合物中有1/3的芳香碳和平均40%的羧基碳均被礦化。HA2組分中烷基和氧烷基碳降低，四個(gè)樣品中有兩個(gè)的芳香碳降低，而HA2的羧基碳未發(fā)現(xiàn)變化。L1組分的烷基碳降低，而羧基碳有輕微增加趨勢(shì)。

培養(yǎng)后，L0/2混合物與L0的碳類(lèi)型分布不完全相同。其中，L0/2混合物烷基和氧烷基碳均降低，大部分L0/2混合物芳香碳沒(méi)有發(fā)生任何變化，且羧基碳呈現(xiàn)出不明顯的降低。HA0/3混合物的碳類(lèi)型分布狀況與HA0樣品相同。

試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和培養(yǎng)125天后剩余的有機(jī)質(zhì)存在差別，可能是由于存在優(yōu)先礦化和(或)生物量的形成，而已使用的分析不能區(qū)分這兩種過(guò)程。由于核磁共振光譜中沒(méi)有出現(xiàn)新的特征峰，培養(yǎng)后的有機(jī)質(zhì)樣品沒(méi)有檢測(cè)到羧基/氨基碳類(lèi)型(例如核磁共振光譜中160～220 ppm)的增加，因此，我們推測(cè)優(yōu)先礦化是主要的過(guò)程。Qi等(2004)的研究結(jié)果也證實(shí)了在垃圾堆肥時(shí)，用微生物菌群降解腐植酸優(yōu)先礦化的是烷基碳。

3　討論

3.1　自組裝對(duì)有機(jī)質(zhì)樣品微生物降解的影響

先前的研究認(rèn)為，非化學(xué)特性因素對(duì)SOM的穩(wěn)定性產(chǎn)生重大影響。MacCarthy和Rice(1991)認(rèn)為，SOM的異質(zhì)性是其長(zhǎng)久存在于環(huán)境中的主要原因，且提出其分子的不規(guī)則性使微生物處于混亂的分子環(huán)境中；這種混亂可能搶占SOM作為模板引導(dǎo)生物后代能夠快速利用其作為能源或營(yíng)養(yǎng)來(lái)源而進(jìn)化；Almendros和Dorado(2009)也認(rèn)為SOM具有復(fù)雜性，提出其難以降解的原因在于材料的無(wú)序結(jié)構(gòu)和重復(fù)單元的缺失；Puglisi等(2009)也指出了SOM結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，并認(rèn)為能夠解釋SOM穩(wěn)定的原因是其聯(lián)合的強(qiáng)度而不是特定分子組成的差異；Papa等(2010)將SOM的穩(wěn)定性歸因于其納米結(jié)構(gòu)，且提出降解性與微孔率相關(guān)。以上研究結(jié)果分析的SOM樣品化學(xué)組成不同，因此，他們的分析結(jié)果不能從其他因素中分離出化學(xué)成分的影響。

圖6　培養(yǎng)前后分離出的自組裝樣品、物理混合物及組分的碳類(lèi)型分布

Fig.6 Carbon-type distribution of self-assembled samples(HA0, L0), physical mixtures(HA0/3, L0/2)and fractions(HA1, HA2, L1)isolated from Guanella peat (a), Poinsett soil (b)before adding the inoculum(initial)and at the end of incubation period(final)
注：自組裝樣品、物理混合物及組分的來(lái)源(a)Guanella泥炭，(b)Poinsett土壤。

圖6續(xù)　培養(yǎng)前后分離出的自組裝樣品、物理混合物及組分的碳類(lèi)型分布

Fig.6 Carbon-type distribution of self-assembled samples(HA0, L0), physical mixtures(HA0/3, L0/2)and fractions(HA1, HA2, L1)isolated from Pahokee peat (c)and leonardite (d)before adding the inoculum(initial)and at the end of incubation
period(final)
注：自組裝樣品、物理混合物及組分的來(lái)源(c)Pahokee泥炭，(d)風(fēng)化褐煤。

然而在本研究中，我們能夠通過(guò)在僅組織程度存在差異的樣品中進(jìn)行直接的數(shù)據(jù)比較，分離出對(duì)礦化產(chǎn)生影響的組織。

通過(guò)每種材料中L0和HA0與其相應(yīng)的物理混合物(分別為L(zhǎng)0/2和HA0/3)的礦化比較研究，發(fā)現(xiàn)自組裝增強(qiáng)礦化。自組裝樣品的礦化程度與其相應(yīng)物理混合物相比，高達(dá)70%。礦化增強(qiáng)趨勢(shì)與自組裝程度取決于熱容值變化的趨勢(shì)一致(見(jiàn)圖7)。熱容量變化越大，樣品的自組裝程度越高，其比相應(yīng)物理混合物的礦化程度越高。

圖7　自組裝樣品(HA0，L0)在不同自組裝程度(ΔCp = Cp自組裝-Cp混合物，Cp表示熱容量)下的礦化變化率(百分比變動(dòng))

Fig.7 Variation of mineralization (percentage change)with the extent of self-assembly(ΔCp = Cpself-assembled-Cpmixture, where Cp is the heat capacity)for the self-assembled samples (HA0, L0)
注：圖中圈用來(lái)將樣品分為自組裝程度低、有限礦化的樣品組和自組裝程度高、高度礦化的樣品組。

有機(jī)質(zhì)的組織程度不但影響碳的礦化量，也對(duì)微生物有機(jī)體消耗碳的類(lèi)型有一定影響。對(duì)如Poinsett土壤和Pahokee泥炭中的L0等原始自組裝樣品而言，所有類(lèi)型的碳均發(fā)生了礦化，而其相應(yīng)的物理混合物中僅發(fā)生了脂肪族和烷基碳的礦化，因此，我們可以假設(shè)，自組裝越多，發(fā)生的碳優(yōu)先礦化越少。究其原因在于，微觀世界中微生物一次只能利用一個(gè)納米結(jié)構(gòu)。然而，由于沒(méi)有短期礦化的數(shù)據(jù)，不能排除動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，即可能是由于碳礦化初期主要消耗脂肪族和氧烷基碳，而后期主要利用芳香族和羧基碳。

3.2 化學(xué)成分對(duì)有機(jī)質(zhì)樣品微生物降解的影響

本研究主要通過(guò)比較結(jié)構(gòu)組成未受到影響的樣品，例如物理混合物L(fēng)0/2和HA0/3，以及HA1、HA2和L1組分，來(lái)研究化學(xué)成分對(duì)有機(jī)質(zhì)樣品微生物降解的影響。通過(guò)分析13C核磁共振測(cè)得的相關(guān)參數(shù)如碳類(lèi)型含量和有機(jī)質(zhì)疏水性指數(shù)得到樣品的生物降解相關(guān)性。

微生物降解程度與芳香碳的相關(guān)性最好(圖 8)，而R2值卻僅為0.498。研究結(jié)果表明，芳香族化合物從占總碳量的60%降至10%，而礦化量增加了70%。其他碳類(lèi)型或疏水性指數(shù)均與礦化程度不相關(guān)。

然而，自組裝樣品(熱容量發(fā)生顯著變化的樣品)之間的比較結(jié)果表明，13C核磁共振測(cè)得的參數(shù)之間不存在相關(guān)性，且不隨樣品的芳香性而變(圖8)。以上結(jié)果表明，化學(xué)成分對(duì)自組裝樣品礦化的影響有限，卻對(duì)非自組裝或自組裝程度有限的樣品起影響作用，這可能填補(bǔ)了化學(xué)成分影響碳穩(wěn)定性研究的空缺。對(duì)高度自組裝系統(tǒng)而言，化學(xué)成分可能并非是影響SOM微生物降解的直接原因；然而，卻不能排除化學(xué)成分對(duì)各組分自組裝的間接作用，以上推測(cè)需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

圖8　非組織腐植酸樣品(物理混合物L(fēng)0/2和HA0/3，以及組
分HA1，HA2和 L1)礦化隨芳香碳含量的變化

Fig.8 Variation of mineralization with aromatic carbon content for humic acid samples without organization (mixtures L0/2, HA0/3, and fractions HA1, HA2, and L1)
注：填充滿(mǎn)了的標(biāo)識(shí)代表自組裝樣品L0。

3.3　碳穩(wěn)定性的意義

本文研究結(jié)果表明，與化學(xué)成分相比，SOM的自組裝程度對(duì)其礦化作用的影響更大，但化學(xué)成分對(duì)SOM礦化的影響研究有所欠缺。由于土壤和SOM的化學(xué)復(fù)雜性及外界環(huán)境如有機(jī)質(zhì)投入、pH值、濕度、溫度和微生物活性等的變化，SOM的自組裝更可能是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。因此，自組織程度變化比SOM的化學(xué)成分變化在短時(shí)間內(nèi)更容易發(fā)生。

為了使該研究結(jié)果得到廣泛證實(shí)，以下問(wèn)題亟需通過(guò)進(jìn)一步研究來(lái)解決。有報(bào)道結(jié)果表明，腐植酸對(duì)不同微生物種群的抗降解能力不同，而本研究?jī)H使用了單一的接種體，需要考慮不同種類(lèi)微生物的作用。使用單一類(lèi)型的接種物可能不影響同一來(lái)源材料樣品之間的比較，但需要考慮不同來(lái)源材料的樣品礦化作用的比較。

以上研究假設(shè)腐植酸原始樣品與其相應(yīng)混合物僅為自組裝程度不同。研究假定溫和的提取步驟未引起各成分中化學(xué)性質(zhì)的改變，氫鍵結(jié)合作用和疏水性相互作用較弱。原始樣品和混合物樣品核磁共振光譜分析結(jié)果類(lèi)似和提取過(guò)程中碳的回收率高，證實(shí)了以上假設(shè)的正確性。然而，由于SOM具有寬泛的核磁共振峰屬性，在我們的試驗(yàn)中不能排除未被檢出的小變化。本研究雖然成功地將潛在的影響減到最少，但擴(kuò)展以上結(jié)論的適用性是一個(gè)積極的研究領(lǐng)域。

致謝和參考文獻(xiàn)(略)

譯自：Soil Biology & Biochemistry，2014，73：96～105。