生化黃腐酸對種腫瘤細胞體外增殖影響的初步研究_2013年論文集

生化黃腐酸對3種腫瘤細胞體外增殖影響的初步研究

高金崗　陳　沫　何　濱

（海南師范大學生命科學學院熱帶動植物生態(tài)學省部共建教育部重點實驗室　?？凇?71158）

摘　要：以人胃癌細胞株GSC、人肝癌細胞株SPCA和人肺癌細胞株BEL共3種腫瘤細胞為研究對象，用四甲基偶氮唑蘭法(MTT法)研究生化黃腐酸對腫瘤細胞體外增殖得的影響。實驗通過在3種不同腫瘤細胞培養(yǎng)液內分別加入6種不同濃度的生化黃腐酸，用酶標儀測定3種不同培養(yǎng)腫瘤細胞的OD值，計算每種腫瘤細胞各個濃度下的抑制率。實驗結果表明：在各個濃度下，生化黃腐酸對3種不同腫瘤細胞的抑制率均低于50%，屬于非腫瘤細胞敏感型藥物。提示：生化黃腐酸對腫瘤細胞的體外增殖沒有明顯的直接抑制作用。另外，生化黃腐酸可能在某種濃度下對腫瘤細胞有促進生長的作用。

關鍵詞：生化黃腐酸　腫瘤細胞　四甲基偶氮唑蘭

The Preliminary Study of Biochemical Fulvic Acid on the Proliferation of Four Types of Tumor Cells in Vitro

Gao Jingang, Chen Mo, He Bin

(Co-constructing key Labs by Hainan Province and Ministry of Education for Tropical Animal and Plant Ecology, School of Life Sciences, Hainan Normal University, Haikou, 571158)

Abstract: In this experiment, we used four kinds of cancer cells, GSC, SPCA and BEL as the object of study.We use the MTT method to research if biotechnology fulvic acid has any infection in proliferation of tumor cell.In this experiment, by observing the growth of the four different tumor cells which add 6 different concentrations of biochemical fulvic acid, and The enzyme measured four different cultured tumor cells of OD values, calculate the concentration of each cell inhibition rate of each.The results show that: in all concentrations, biochemical fulvic acid on the inhibition of four different tumor cells were less than 50%, are not sensitive.Tip: biochemical fulvic acid on the proliferation of tumor cells no obvious direct inhibition.In addition, biochemical fulvic acid may be a concentration on the tumor cells has some role in promoting growth.

Key words: biochemical fulvic acid; tumor cell; MTT

腫瘤是危害人類健康的惡性疾病之一，統(tǒng)計資料表明[1]，近幾年來腫瘤的病死率有上升趨勢。目前抗癌藥在抑制癌細胞的同時對人體的正常細胞也有一定的損害，尤其是損害人體的免疫系統(tǒng)，造成多種并發(fā)癥。由于化療藥物等毒副作用大，易耐藥等缺點，故臨床上多采用給予化療藥物的同時給予輔助用藥或采用新型給藥系統(tǒng)，其目的是為了產生最大的抑瘤效應，降低不良反應、避免產生抗藥性。因此，尋找敏感的、毒副作用小的抗癌藥就顯得很有必要。

生化黃腐酸(Biotechnology Fulvic Acid，簡稱BFA)是以作物秸稈等有機物為主要原料，經過特種微生物發(fā)酵而產生的以黃腐酸為主要成分的多種生物活性物質的復合物。其來源天然，毒副作用極小，長期使用也不會產生抗藥性。

有報道認為，BFA作為飼料添加劑能明顯提高動物的抗炎能力[2-3]。臨床實驗也證明，BFA在止血、抗炎、止痛和調整腸胃功能等方面具有重要作用[4]。有關BFA在機體內的抗腫瘤作用也有報道。張覃沐等[5]在研究黃腐酸對小鼠腫瘤細胞的影響時發(fā)現黃腐酸在體內具有抗腫瘤作用。但BFA是否在體外對腫瘤細胞有直接的影響作用尚未見報道。因此，本文以人胃癌細胞株GSC、人肝癌細胞株SPCA和人肺癌細胞株BEL共3種腫瘤細胞為研究對象，初步研究BFA對腫瘤細胞體外增殖的影響，以探討B(tài)FA對腫瘤細胞的生長是否具有直接的抑制作用，從而為BFA抗腫瘤作用的臨床研究及應用提供參考依據。

1　實驗材料、儀器、藥品、試劑與方法

1.1　實驗材料

人胃癌細胞株(GSC)、人肝癌細胞株(BEL)和人肺癌細胞株(SPCA)，均購自中科院上海細胞庫(ATCC)。

1.2　主要實驗儀器

倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠)；酶聯免疫檢測儀(華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)；超凈工作臺(蘇州凈化設備廠)；立式超低溫冰箱(丹麥Heto公司)；高壓滅菌鍋(日本森展企業(yè)有限公司)；可調式移液器(BRAND公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(Pore公司)等。

1.3　主要藥品與試劑

1.3.1　藥品

生化黃腐酸(BFA)，購自上海通威生物技術有限公司，純度99%以上；胰蛋白酶(Gibco公司)；四甲基偶氮唑蘭(Sigma公司)；二甲基亞砜(天津市化學試劑二廠)；RPM1640培養(yǎng)基(Gibeo公司)；優(yōu)級新生胎牛血清(由蘭州民海生物工程有限公司)；青霉素(80萬單位/瓶)；鏈霉素(100萬單位/瓶)。

1.3.2　試劑

RPM 1640血清培養(yǎng)基：RPM1640基礎培養(yǎng)基1袋，NaHCO3 3.7 g，三蒸水1000 mL，磁力攪拌溶解，調pH=7.5。

胰蛋白酶(0.25%)：胰蛋白酶0.5 g，MilliQ水200 mL，磁性攪拌至完全溶解，用直徑為0.22 μm的雙層濾膜過濾除菌，-20 ℃保存。

PBS緩沖液：NaCl 8.0 g(pH7.2～7.4)，KCl 0.2 g，NaH2PO4 1.44 g，KH2PO4 0.24 g，三蒸水1000 mL，高壓滅菌，室溫保存。

胎牛血清：-20 ℃保存，取出室溫融化，放入恒溫槽中，56 ℃恒定30 min滅活，分裝，-20℃保存。

抗菌素液(雙抗液)：用注射器吸5 mlPBS，注入鏈霉素(100萬單位)瓶內，反復吹打，使其完全溶解，然后吸出4 mL再注入青霉素(80萬單位)瓶內，反復吹打，使其完全溶解。吸出全部于一小燒杯，加PBS至100 mL，在超凈臺內用過濾器分裝，每瓶5 mL，20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四甲基偶氮唑蘭(MTT)：MTT 50 mg，加PBS 50 mL，攪拌溶解，用直徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌后，4 ℃避光保存，一周內使用。

1.4　實驗方法步驟

1.4.1　凍存細胞的復蘇

從液氮罐中取出凍存的GSC、BEL、SPCA和K562細胞株，迅速放入37 ℃水浴中使其在1 min內完全溶解，將細胞懸液移至含有10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基的離心管中，在4 ℃，1000 r/ min下離心3 min，棄上清液，將細胞重新懸浮于含10%胎牛血清的RPM1640培養(yǎng)基中，置于37℃，CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，24 h后觀察細胞貼壁情況，并更換一次培養(yǎng)液。

1.4.2　細胞培養(yǎng)

將凍存復蘇的3種細胞株分別裝在有適量RPMI1640培養(yǎng)液(內含10%胎牛血清和雙抗液)的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中，在恒溫37 ℃，5%CO2濃度，飽和濕度下培養(yǎng)。

每3～4天傳代一次，傳代時小心棄去舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液(pH7.4)沖洗2次，棄去PBS緩沖液，加入適量0.25%胰蛋白酶，37 ℃，消化1～2 min，倒置鏡下觀察細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度，加含10%小牛血清的RPM1640培養(yǎng)基終止消化，用吹打管將已經消化好的細胞吹打為細胞懸液。將細胞懸液由細胞培養(yǎng)瓶中吸入離心管中，1000 r/min離心5 min；離心后棄去上清液，加入新鮮的小牛血清的RPM1640培養(yǎng)基，用微量進樣器輕輕反復吹打細胞懸液，使細胞重懸混勻后，分裝于培養(yǎng)瓶中再培養(yǎng)。

1.4.3　細胞的凍存

在細胞培養(yǎng)的過程中，防止實驗過程中操作不當造成細胞完全死亡，可以將一部分細胞凍存起來。凍存細胞時選用對數生長期細胞。凍存方法如下：將細胞制成細胞懸液，計數，離心，去上清，加入含10%二甲基亞砜(DMSO)的凍存液，用吸管輕輕吹打使細胞重懸，使細胞密度達到5×106/mL，分裝入無菌凍存管中，置于4℃，45 min，然后置于-20 ℃，45 min，最后在-80 ℃下過夜，逐級降溫冷凍，然后放入液氮罐中保存。

1.4.4　細胞鋪板

鋪板前處理：將對數生長期的細胞經0.25%胰蛋白酶消化后吹打成單個懸浮細胞，用血球計數板計數，將結果代入下式：細胞個數/毫升原液=(四角大格中細胞數之和/4)×104，接著用RPM-1640完全培養(yǎng)基調整細胞的濃度，使GSC細胞的濃度達4×104個/mL，BEL細胞濃度達7×104個/毫升，SPCA細胞濃度達2×104個/毫升，K562細胞濃度達1×104個/毫升。

將調整好濃度的3種細胞分別加入到96孔細胞培養(yǎng)板B行到F行中，每孔180 μL，鋪兩行吹勻一次，A行每孔加200 μL RPM-1640培養(yǎng)液作為空白對照，分別置于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4.5　藥品的溶解及稀釋

用電子天平稱量BFA 100 mg，在超凈臺內溶于1 mL的DMSO，用移液器混勻溶解后，將母液依次稀釋為6個濃度：0.1 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/ mL、10 mg/mL、50 mg/mL和100 mg/mL。將6個濃度的BFA藥品分別依次加入到96孔細胞培養(yǎng)板的D、E、F行中；A行設置空白組(僅加入不含細胞的培養(yǎng)液)，B、C兩行是對照組(以培養(yǎng)液替代藥物)，然后置于37 ℃，5%CO2濃度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各濃度BFA在96孔細胞培養(yǎng)板上的安排見表1。

表1　細胞板上各孔的濃度匯總
Tab.1 The concentration summary of each hole on the cell board

1.4.6　加MTT法[6]測吸光值(OD值)

加藥44 h后，向3個細胞板中分別加入MTT，每孔50μL。4h后，將培養(yǎng)的3種細胞培養(yǎng)板中的液體倒掉。接著向其中加入DMSO，每孔150μL，震蕩10分鐘，使用酶標儀在570 nm波長下測定各孔OD值。

根據公式：抑制率(%)=[(對照組OD值-空白組OD值)-(實驗組OD值-空白組OD值)]/(對照組OD值-空白組OD值)×100%[7]，分別計算不同濃度的BFA對3種腫瘤細胞的抑制率。

各項實驗均重復3次以上，用統(tǒng)計學軟件SPSS處理：實驗組與對照組間采用獨立樣本t檢驗法，以P＜0.05為差異具有顯著性意義。

2　結果與分析

2.1　BFA對3種腫瘤細胞的影響

實驗過程中可以觀察到BFA對3種腫瘤細胞有一定程度的影響，需進一步通過計算來探索。根據上述公式，分別計算不同濃度的BFA對3種腫瘤細胞的抑制率，繪制抑制率曲線，見圖1～圖3。同時依據吳舟鋒[7]使用的判斷藥物是否是腫瘤細胞敏感型藥物的標準(抑制率＜50%為不敏感；50%～70%為中度敏感；＞70%為高度敏感)進行判斷。

圖1　生化黃腐酸對SPCA的影響

Fig1.The influence of biochemistry fulvic acid on SPCA

由圖1可見，BFA對SPCA的抑制率在1 mg/ mL～10 mg/mL的范圍內逐漸增加；至10 mg/ mL濃度時達到8.53%抑制率，接近最大抑制率(約8.85%，如圖中所示)，之后逐漸減少，在50 mg/ mL到100 mg/mL的濃度范圍內趨于平穩(wěn)。各濃度的BFA對SPCA細胞的抑制率遠未達到50%。

圖2　生化黃腐酸對GSC的影響

Fig.2 The influence of biochemistry fulvic acid on GSC

由圖2可見，BFA對GSC的抑制率在1 mg/mL～10 mg/mL的濃度范圍內逐漸增加；至10 mg/ mL濃度時達到40.96%抑制率，接近最大抑制率(約42.50%，如圖中所示)，之后逐漸減少，各濃度BFA對GSC細胞的抑制率均未達到50%。

由圖3可知，BFA對BEL的抑制率在5 mg/ mL～10 mg/mL的濃度范圍逐漸增大，至10 mg/ mL濃度時達到9.48%抑制率，接近最大抑制率(約9.90%，如圖中所示)，之后逐漸減少，各濃度BFA對BEL細胞的抑制率均未達到50%。

圖3　生化黃腐酸對BEL的影響

Fig.3 The influence of biochemistry fulvic acid on BEL

2.2　BFA對3種腫瘤細胞抑制結果的分析

為進一步判斷BFA對3種不同腫瘤細胞體外增值的抑制作用，根據上述OD值進行差異顯著性分析[8](表2)。另外，計算出的抑制率也放入表2，用以對BFA的抑制作用進行輔助分析。可以看出，SPCA細胞組中6個濃度的實驗組與對照組相比均沒有顯著差異(P＜0.05)；GSC細胞組中，3個濃度(5 mg/mL，10 mg/mL和50 mg/mL)的實驗組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)，而BEL細胞組中，也有2個濃度(50 mg/mL和100 mg/mL)的實驗組與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)或極顯著性差異(P＜0.01)。但是，這5個濃度的實驗組對GSC和BEL細胞的抑制率都低于50%，表明BFA對這兩種腫瘤細胞沒有明顯的抑制作用。

表2　BFA對3種不同腫瘤細胞的抑制作用(n=6)
Tab.2 Anti-proliferative activity of biochemistry fulvic acid on four tumor cells(n=6)

表2　續(xù)

注：*表示P＜0.05，差異顯著；**表示P＜0.01，差異極顯著。

3　討論

本實驗結果顯示：BFA對GSC的抑制率，在10 mg/ml濃度時達到40.96%抑制率，其最大抑制率約42.50%(如圖2所示)，接近了50%的抑制率。統(tǒng)計學處理結果也表明：BFA對GSC的抑制率，其中有3個濃度(5 mg/mL，10 mg/mL和50 mg/ mL)的實驗組與對照組相比有顯著性差異。提示BFA對GSC的體外生長可能有一定的影響，但由于BFA的3個濃度的抑制率均小于50%，沒有明顯抑制腫瘤細胞增值的作用；而BFA對GSC和BEL兩種腫瘤細胞抑制率更低，各6個濃度的抑制率均未達到10%。因此，認為BFA不是腫瘤細胞敏感型藥物，對癌細胞本身沒有直接的殺滅作用。

張覃沐等在研究黃腐酸對小鼠腫瘤細胞的影響時，發(fā)現黃腐酸在體內具有抗腫瘤作用，且口服比注射效果要好，認為黃腐酸可能是通過提高小鼠自身免疫系統(tǒng)的功能而發(fā)揮其抗腫瘤作用的，而不是直接抑制或殺滅腫瘤細胞。

本實驗結果也顯示：當BFA的濃度較高(＞50 mg/mL)時，對SPCA和BEL細胞株的負面影響很小，如圖1和圖3所示：抑制率很低，甚至出現負值。推測：BFA具有一定的抑菌作用，本身又是一種營養(yǎng)添加劑，體外培養(yǎng)體系中，加入一定濃度的BFA，對腫瘤細胞的生長，可能有促進作用。

雖然本實驗結果表明：BFA不是腫瘤細胞敏感型藥物，對腫瘤細胞本身沒有直接的殺滅作用。但由于BFA來源于天然，有毒副作用極小，長期使用不會產生抗藥性的特點，因此，BFA應該可以作為腫瘤患者化療時的輔助用藥使用，以提高腫瘤患者的免役力。

致謝：

本論文在實驗過程中得到了海南師范大學生命科學學院陳忠教授的指導和幫助，在此表示感謝！

參考文獻

[1]顧琳娜，顧昊.天然抗腫瘤藥物篩選方法的研究進展[J].藥學導報，2009，28(4):496～498

[2]李紅玉.生化黃腐酸在畜牧業(yè)中的應用[J].中國畜牧獸醫(yī)，2006，33(2):18～19

[3]楊曉松，李良臣.生化黃腐酸對奶牛乳房炎和生產性能的影響[J].中國食草物，2008，28(2):31～33

[4]馬慶凱，王 虹.黃腐酸鈉灌腸治療慢性非特異性結腸炎180例[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志，2002，19(5):285

[5]張覃沐，胡孟州，等.黃腐酸抗腫瘤作用的藥理研究[J].河南醫(yī)學院學報，1983，18(1):11～14

[6]司徒鎮(zhèn)強.細胞培養(yǎng)[M].北京：世界圖書出版社，2004

[7]吳舟鋒.腫瘤化療藥物敏感性試驗[J].國外醫(yī)學:外科學分冊，1988，25(3):153～155

[8]黃鳴清，蔣東旭.昆明山海棠抗腫瘤活性部位篩選研究[J].中國中藥雜志，2009，34(20): 2633～2636