腐植酸在褐鱒魚(yú)鰓和肌肉抵抗鎘中毒的組織病理學(xué)和生物化學(xué)作用_2013年論文集

腐植酸在褐鱒魚(yú)鰓和肌肉抵抗鎘中毒的組織病理學(xué)和生物化學(xué)作用

Gonca Alak1, Muhammed Atamanalp2, Ahmet Topal2, Harun Arslan2, Ertan Oru?3, Serdar Altun3 著

李　雙4　譯

(1　阿塔特克大學(xué)農(nóng)學(xué)系　埃爾祖魯姆　土耳其　25240　2　阿塔特克大學(xué)漁業(yè)系　埃爾祖魯姆　土耳其　25240　3　阿塔特克大學(xué)獸醫(yī)系　埃爾祖魯姆　土耳其　25240　4　中國(guó)腐植酸工業(yè)協(xié)會(huì)　北京　100120）

摘　要：為了探究腐植酸對(duì)褐鱒鰓和肌肉在抵抗鎘(Cd)中毒方面是否發(fā)揮積極作用，進(jìn)行了組織病理學(xué)和生物化學(xué)方面的研究。試驗(yàn)中，褐鱒暴露在僅施加2 ppm鎘，2 ppm鎘加5 ppm腐植酸，僅含5 ppm腐植酸的三種環(huán)境條件下，分別測(cè)定其鰓和肌肉組織的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)水平。在含鎘條件下，褐鱒組織中的GPx和SOD活性明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，而含鎘環(huán)境中褐鱒組織的MDA并未升高(P>0.05)。然而，腐植酸并未影響鎘造成的生化傷害。鎘對(duì)鰓和肌肉組織造成明顯的組織病理變化，而在Cd+HA組中，這種變化較小。這些結(jié)果表明，腐植酸可能從組織病理學(xué)方面能中和鎘中毒。

關(guān)鍵詞：毒性　抗氧化酶　褐鱒　組織病理學(xué)　腐植酸

Histopathological and Biochemical Effects of Humic Acid Against Cadmium Toxicity in Brown Trout Gills and Muscles

Gonca Alak1,*, Muhammed Atamanalp2, Ahmet Topal2, Harun Arslan2, Ertan Oru?3, Serdar Altun3 write Li Shuang4 translate

(1 Ataturk University, Agriculture Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 2 Ataturk University, Fisheries Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 3 Ataturk University, Veterinary Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 4 China Humic Acid Industry Association, Beijing, 100120)

Abstract: It was biochemically and histopathologically investigated whether humic acid (HA) has protective effects on cadmium (Cd) toxicity on muscle and gills of brown trout.The brown trout were exposed to cadmium (2 ppm) and/or humic acid (5 ppm).For this purpose, levels of glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) was investigated in muscle and gills tissues of brown trout.The activities of GPx and SOD in the tissues of fish exposed to Cd was significantly lower than the control groups (P<0.05).MDA levels did not increase in the groups exposed to cadmium (P>0.05).Hovewer, humic acid did not affect biochemical damage in cadmium group.Cd caused a significant increase in histopathological changes in muscle and gills tissues, but histopathological changes were lower in the muscle tissue of Cd+HA group.These results suggest that humic acid may counteract the cadmium toxicity in muscles tissue in histopathologic aspect.

Key words: toxicity; antioxidant enzyme; brown trout; histopathology; humic acid

鎘是一種毒性很強(qiáng)的重金屬元素，從上世紀(jì)起，它在大氣、水、土壤和植物中的濃度呈升高趨勢(shì)。由食物或水進(jìn)入水生動(dòng)物后，鎘與血液中的白蛋白和紅細(xì)胞結(jié)合而進(jìn)一步轉(zhuǎn)移到組織和器官。通過(guò)誘導(dǎo)金屬硫蛋白mRNA的合成，形成小分子量的金屬硫蛋白。鎘在生物體中的富集是一個(gè)值得關(guān)注的重要的生態(tài)學(xué)問(wèn)題，尤其是其富集作用發(fā)生的非?？臁ｆk能造成魚(yú)類(lèi)各器官結(jié)構(gòu)和病理形態(tài)學(xué)的變化。魚(yú)的腎臟和肝臟是發(fā)現(xiàn)含鎘量最高的地方。

近年來(lái)，特定酶系統(tǒng)和不同藥物，金屬離子和化學(xué)藥品之間的互作都有廣泛的研究。許多環(huán)境污染物會(huì)引起水生動(dòng)物的氧化應(yīng)激反應(yīng)。化學(xué)有毒污染物是生物系統(tǒng)活性氧的重要來(lái)源，會(huì)抑制抗氧化防御系統(tǒng)中一些酶的活性。在環(huán)境毒理學(xué)和生態(tài)毒理學(xué)已經(jīng)初步形成了氧化應(yīng)激反應(yīng)和對(duì)基礎(chǔ)生物分子的傷害以及器官的抗氧化防御系統(tǒng)的研究領(lǐng)域?？寡趸溉鐑?nèi)源谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)和過(guò)氧化氫酶(CAT)能降低會(huì)造成組織傷害的活性氧含量。

腐植酸在環(huán)境中普遍存在，并發(fā)現(xiàn)它可以影響水生生物的生理功能。在歐洲獸醫(yī)實(shí)踐中，腐植酸已被用作止瀉劑，鎮(zhèn)痛劑，免疫刺激，抗菌劑。有文章表明，在不同動(dòng)物物種中，通過(guò)一些生理變化和免疫的形成，腐植酸與生長(zhǎng)和健康防護(hù)能力有很大關(guān)聯(lián)。

本研究目的是為了調(diào)查腐植酸在褐鱒魚(yú)抵御鎘傷害過(guò)程中可能起到的保護(hù)作用。毒性評(píng)估依據(jù)組織病理學(xué)，對(duì)肌肉和魚(yú)鰓組織中抗氧化物GPx、SOD和MDA水平進(jìn)行了測(cè)定。

1　材料和方法

1.1　試驗(yàn)設(shè)計(jì)

褐鱒，又名亞?wèn)|鮭，由阿塔特克大學(xué)漁業(yè)和內(nèi)河魚(yú)類(lèi)育種研究中心獲得。該研究在魚(yú)毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室并在遵守批準(zhǔn)的倫理規(guī)則前提下開(kāi)展。為了讓其適應(yīng)環(huán)境條件，褐鱒在池塘內(nèi)預(yù)喂養(yǎng)15 d。過(guò)了適應(yīng)期后，10條褐鱒被放入400 lt體積的玻璃水箱中。用來(lái)測(cè)試的褐鱒魚(yú)平均重量為203.31±8.09 g，身長(zhǎng)為22.21±0.49 cm。水箱水的理化性質(zhì)為：溫度(10～12 ℃)；pH(7.4～ 8.0)；溶氧量(7.52±0.50 ppm)；水硬度CaCO3含量(164.1±4.17 ppm)。腐植酸購(gòu)于Farmavet醫(yī)學(xué)公司。配制一定濃度氯化鎘(Sigma)和腐植酸原液。原液中Cd和腐植酸的濃度分別為2 ppm，5 ppm。

褐鱒魚(yú)被分為4組。第一組為對(duì)照組，第二組為含鎘組，第三組為腐植酸組，第四組為鎘+腐植酸組，每組有10條。給第二組魚(yú)單次施于劑量為濃度2 ppm的氯化鎘。這個(gè)劑量為前人研究中對(duì)彩虹鱒造成毒性劑量值。第三組魚(yú)的腐植酸單次施于劑量為5 ppm。第四組魚(yú)被施于2 ppm鎘和5 ppm腐植酸的混合液。魚(yú)類(lèi)在含不同劑量的環(huán)境中維持7 d。

1.2　生化分析

根據(jù)Alak等的方法，分析出褐鱒不同組織中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GPx)，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。在Wiegand等的方法上進(jìn)行改良，獲得每個(gè)個(gè)體的各個(gè)組織的提取物。將組織浸入液氮，用研缽研磨。研磨后放入KH2PO4(30 mM，pH=7.3)緩沖液中混勻成勻漿。勻漿在4 ℃下，13000 rpm離心2 h后取上清用來(lái)測(cè)定酶活，用蛋白含量表示。魚(yú)的組織中MDA含量按照Gülcin等的方法測(cè)定。加入200 μL溶血產(chǎn)物，800 μL磷酸鹽緩沖液(50 mM，pH7.4)，25 μLBHT和500 μL濃度30%的TCA，迅速混勻，-20 ℃放置2 h后，2000 rmp離心15 min，分離1.0 mL上清，分別加入75 μL EDTA-Na2 H2O，250μL TBA，之后放入沸水浴15 min，冷卻至室溫，在532 nm條件下測(cè)定和計(jì)算出MDA的含量。全部硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)用MDA顯示。根據(jù)Bradford的方法，每份勻漿的1.56×105 cm-1M-1蛋白含量的MDA的摩爾消光系數(shù)用Coomassie Brilliant Blue G-250測(cè)定，并以牛血清白蛋白作為標(biāo)樣。

1.3　組織病理學(xué)檢測(cè)

用于光學(xué)顯微鏡檢測(cè)的組織樣本先在10%福爾馬林中固定24 h，在不同濃度的酒精下脫水后用二甲苯清洗干凈，樣本埋入融化的石蠟中，用薄片切片機(jī)(Leica,Germany)切成塊。每個(gè)蠟塊連續(xù)切成5 um后的薄片。石蠟薄片在蘇木精-伊紅(H-E)中染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察(Olympus BX52 with DP72 camera system)。所有組織病理學(xué)改變用圖像處理系統(tǒng)評(píng)估(Olympus, DP2-BSW)。光學(xué)顯微鏡檢測(cè)結(jié)果用半定量的方法評(píng)估，評(píng)價(jià)如下：無(wú)病變(-)，輕度病變(+)，中度病變(++)，和重度病變(+++)。

1.4　數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用單因素方差分析法(ANOVA)和Duncan檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。P＜0.05的數(shù)據(jù)被視作差異顯著。數(shù)據(jù)使用SPSS 10.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)軟件處理。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1　生化結(jié)果

與對(duì)照組相比，鎘的施加使得魚(yú)類(lèi)肌肉和魚(yú)鰓組織中SOD和GPx水平的顯著降低(P＜0.05)，見(jiàn)表1、表2。施加腐植酸和鎘并沒(méi)有使魚(yú)類(lèi)肌肉和魚(yú)鰓組織中SOD和GPx水平有明顯升高。鎘處理后，褐鱒肌肉和魚(yú)鰓組織中MDA數(shù)據(jù)并未顯著增加(P＞0.05)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組數(shù)值相比，褐鱒魚(yú)鰓組織中MDA活性并沒(méi)有顯著富集。

表1　腐植酸(HA)施加對(duì)含鎘和不含鎘魚(yú)類(lèi)肌肉組織中GPx,SOD活性MDA水平的影響
Tab.1 The effects on GPx, SOD activity and MDA levels in the muscle tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

注：所有的值為8個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同上標(biāo)字母代表數(shù)據(jù)的差異顯著性(P﹤0.05)

表2　腐植酸(HA)施加對(duì)含鎘和不含鎘魚(yú)類(lèi)鰓組織中GPx，SOD　活性　MDA　水平的影響
Tab.2 The effects on GPx，SOD activity and MDA levels in the gill tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

注：所有的值為8個(gè)獨(dú)立測(cè)量值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。不同上標(biāo)字母代表數(shù)據(jù)的差異顯著性(P﹤0.05)

2.2　組織病理學(xué)結(jié)果

對(duì)照組中的肌肉(圖1a)和魚(yú)鰓組織(圖2a)沒(méi)有任何病理學(xué)的變化；腐植酸組(圖1b和2b)同樣也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病理性變化；在試驗(yàn)鎘處理組發(fā)現(xiàn)有明顯變化。

在鎘處理組中，發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰓組織的水樣變質(zhì)，空泡性惡化，第二層腮瓣上皮細(xì)胞增生和第二層腮瓣的破壞(圖1c)。另外，在鎘處理組的肌肉組織中，發(fā)現(xiàn)縫隙有單核細(xì)胞的侵入。同時(shí)施加鎘和腐植酸試驗(yàn)組也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的病理學(xué)變化。在該組的肌肉組織中，血管堵塞，細(xì)胞衰退，脫皮(圖2d)。病理變化的嚴(yán)重程度見(jiàn)表3。

圖1　對(duì)照組(a)和腐植酸組(b)鰓組織正常組織學(xué)表現(xiàn)

Fig.1 Normal histologic appearance of gill tissue in control (a) and HA (b) groups
注：含鎘組鰓上皮細(xì)胞的嚴(yán)重變性和脫落(c-箭頭)；含鎘+腐植酸組有類(lèi)似的上皮細(xì)胞丟失(d-箭頭)，含鎘+腐植酸組有許多充血血管(*)。

圖2　對(duì)照組(a)和腐植酸組(b)肌肉組織正常組織學(xué)表現(xiàn)

Fig.2 Normal histologic appearance of muscle tissue in control (a) and HA (b) groups
注：含鎘組鰓出現(xiàn)炎癥單核細(xì)胞侵入(c-箭頭)；含鎘+腐植酸組沒(méi)有炎癥細(xì)胞(d-箭頭)。

表3　鰓和肌肉組織中病理學(xué)變化的嚴(yán)重程度
Tab.3 The intensity and severity of histopathological alterations in gill and muscles tissues

注：-表示無(wú)病變，+表示輕度病變，++表示中度病變，+++表示重度病變。

3　討論

本研究旨在探究鎘對(duì)褐鱒魚(yú)的毒性效應(yīng)和利用腐植酸防止毒性的可能性。病理學(xué)研究將金屬毒性歸咎于自由基和活性氧。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在暴露在含鎘環(huán)境下，自由基的生成量和抗氧化防御系統(tǒng)都會(huì)有變化。一些研究顯示，在水生生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境下存在污染物，包括鎘，會(huì)使細(xì)胞內(nèi)形成大量活性氧，會(huì)對(duì)生物系統(tǒng)造成氧化性傷害。在這個(gè)意義上，鎘會(huì)和一些基礎(chǔ)金屬競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合位點(diǎn)，引發(fā)Fe2+和Cu2+離子釋放，從而導(dǎo)致活性氧生成的增加。

因此，抗氧化酶水平是研究重金屬類(lèi)的污染物影響的重要指標(biāo)。抗氧化酶如谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶預(yù)防氧化應(yīng)激反應(yīng)。我們的研究中，鎘處理組中褐鱒的肌肉和魚(yú)鰓組織中的酶活(GPx and SOD)顯著下降(P＜0.05)。該結(jié)果表明GPx和SOD抑制肌肉和魚(yú)鰓組織中氧自由基形成。相似研究結(jié)果顯示，重金屬毒性造成組織自由基和氧化傷害，魚(yú)受到重金屬毒害時(shí)會(huì)導(dǎo)致SOD和GSH-Px水平降低。也有報(bào)道稱(chēng)鎘是通過(guò)破壞線粒體酶造成細(xì)胞和組織的缺陷。

一般而言，金屬引起的氧化脅迫可直接通過(guò)氧化還原反應(yīng)循環(huán)引起，也可間接通過(guò)與酶促或非酶抗氧化脅迫抵御系統(tǒng)互作產(chǎn)生。因此，我們?cè)u(píng)估了MDA功效。MDA是一種膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物，它可以作為檢測(cè)金屬污染條件下，氧化脅迫造成細(xì)胞傷害初期的生物學(xué)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，僅施鎘及鎘+腐植酸組中肌肉和鰓組織中MDA水平?jīng)]有變化。同時(shí)含鎘環(huán)境下施加腐植酸，并沒(méi)有造成肌肉和鰓組織中GPx和SOD的顯著升高(P＞0.05)。

有報(bào)道稱(chēng)腐植酸增加了鎘造成的急性和慢性毒性，腐植酸也不影響任何金屬的生物富集作用。但也有研究表明腐植酸持續(xù)降低了鎘在各組織器官中的富集，通過(guò)水的傳播，鎘可以在水生動(dòng)物的全身，肌肉和脊椎中明顯富集。在這個(gè)研究里，試驗(yàn)記錄的肌肉組織中的鎘含量已經(jīng)高到令人擔(dān)憂(yōu)的水平。病理學(xué)的變化在鎘+腐植酸組相對(duì)較小(圖2b)，這一結(jié)果表明，腐植酸可能降低了肌肉組織中的鎘中毒。

重金屬傷害是很多病理性和毒害性過(guò)程中的重要因素。對(duì)魚(yú)類(lèi)，鎘會(huì)造成各組織大量結(jié)構(gòu)和病理性變化。鰓是一重要組織，因?yàn)槠渑c水直接接觸，任何有直接或間接影響的物質(zhì)都先通過(guò)鰓才能進(jìn)入魚(yú)體內(nèi)。有報(bào)道稱(chēng)薄層上皮黏膜對(duì)水中溶解的鉛反應(yīng)，造成組織滲透調(diào)節(jié)不平衡。也有試驗(yàn)研究顯示，鰓作為鎘的儲(chǔ)藏庫(kù)。

Wong等報(bào)道稱(chēng)，鎘處理會(huì)造成羅非魚(yú)(Oreochromis mossambicus)形態(tài)和生化反應(yīng)的變化。魚(yú)在有毒物環(huán)境下極度活躍可能是由于其鰓因刺激而受到損害引發(fā)缺氧造成的。而血紅蛋白的增加可以補(bǔ)償受損的呼吸效率，這在降低歐鰱(Leuciscus cephalus)鎘中毒試驗(yàn)中有相似報(bào)道。本研究的試驗(yàn)結(jié)果與之相類(lèi)似。因此，我們可以說(shuō)這一病理學(xué)的變化是由鎘毒害造成的。

總之，病理學(xué)變化的加劇和抗氧化物活性的降低說(shuō)明鎘處理對(duì)鰓和肌肉組織造成了傷害。腐植酸對(duì)鎘造成的傷害并沒(méi)有很多影響，但是發(fā)現(xiàn)它可以減低鎘引起的肌肉組織病理學(xué)變化。因此，由于其對(duì)病理學(xué)變化降低這一作用，鎘可能能夠中和鎘中毒。

致謝和參考文獻(xiàn)(略)

譯自：Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，2013，13：315～320。

歡迎為《腐植酸》雜志投稿！