設(shè)計和選擇生物材料是組織工程支架的關(guān)鍵步驟。在組織工程中，基質(zhì)被用來支持細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞向形成新組織的方向增生和分化。天然聚合物由于與細(xì)胞外基質(zhì)近似，可避免合成聚合物的慢性炎癥刺激、免疫反應(yīng)和毒性?；钇鞴俸铣傻奶烊痪酆衔锇椿瘜W(xué)結(jié)構(gòu)分為蛋白、多糖、天然聚酯。隨著生物技術(shù)進(jìn)步，天然聚合物可通過微生物發(fā)酵或體外酶處理獲得。然而，植物、動物、海藻仍是天然聚合物最大的來源，是自然形成的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和指導(dǎo)組織發(fā)育的最優(yōu)化環(huán)境。模擬ECM來引導(dǎo)組織修復(fù)和組織工程的形態(tài)發(fā)生已做了很多努力。分離純化ECM的主要組分，修飾或不修飾直接使用，是組織工程支架選擇的策略之一。因為ECM在細(xì)胞活動中起著重要作用，這一策略假定這些生物分子能維持生物學(xué)信息和其他物理化學(xué)特征，接種細(xì)胞后能促進(jìn)新組織發(fā)育，有助于克服合成材料缺乏細(xì)胞識別信號的缺陷。

一、膠 原

膠原蛋白（也稱膠原）是哺乳動物結(jié)締組織中最重要的結(jié)構(gòu)蛋白，是ECM的主要成分，約占膠原纖維固體物的85%，體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%～30%，相當(dāng)于體重的6%。廣泛存在于動物的皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、神經(jīng)、血管、腸、胃、牙齒等組織中，起著支撐器官、保護(hù)機(jī)體的作用。膠原屬于硬蛋白，其種類超過20種。其中Ⅰ型膠原具有優(yōu)越的機(jī)械強度和生物相容性，非常適合用于皮膚替換和燒傷治療。

（一）膠原的優(yōu)、缺點

膠原具有以下優(yōu)點：①生物相容性好，能促進(jìn)細(xì)胞的黏附、生長和形成新的膠原纖維；②低免疫原性，經(jīng)處理后可基本消除抗原性；③生物安全性高，膠原本身及其降解產(chǎn)物不良反應(yīng)較少；④有生理活性和凝血作用；⑤易生物降解，在體內(nèi)一定時間內(nèi)分解成易于吸收的小分子和短肽；⑥力學(xué)性能、透水汽性能優(yōu)良，在一定程度上能夠滿足機(jī)體對機(jī)械強度的要求，對傷口保護(hù)好，可減少換藥或不換藥；⑦具有較好的可溶解性，而且經(jīng)純化的可溶性膠原能夠在體外再次形成與天然膠原纖維相似的有序纖維狀結(jié)構(gòu)，即具有重聚性，在組織工程應(yīng)用中這一特點很重要；⑧官能團(tuán)多，容易改性；⑨與其他生物活性組分在一起使用，具有協(xié)同效應(yīng)，易使細(xì)胞在膠原材料表面增殖生長；⑩來源廣泛。因此，膠原被廣泛用于生物可降解縫線、人造皮膚、傷口敷料、人造腱及血管等方面。

但是，膠原蛋白作為生物材料，也存在以下不足：①力學(xué)強度不大，不能完全滿足作為體內(nèi)組織器官的力學(xué)環(huán)境要求；②膠原蛋白易于發(fā)生膠化反應(yīng)，不利于膠原材料發(fā)揮它在體內(nèi)的生物功能；③溶解后的膠原蛋白，不易固定；④生物降解速率快，不易控制。不過，在醫(yī)用材料領(lǐng)域，膠原蛋白還是現(xiàn)今優(yōu)先采用的生物高分子材料。

（二）膠原蛋白的分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)性能

膠原由3條多肽鏈組成，不同類型的膠原結(jié)構(gòu)差別明顯，但都共有一個特征性的結(jié)構(gòu)，即由3條肽鏈組成的α右手三螺旋結(jié)構(gòu)。在Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅶ型、Ⅷ型、Ⅹ型膠原中是由3條相同的鏈形成，在Ⅰ型、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型、Ⅸ型和Ⅺ型膠原中由另外1條、2條或更多的不同鏈構(gòu)成。3條α鏈的每一條內(nèi)部形成一個被擴(kuò)展的左手螺旋，每螺旋一次的螺距含有18個氨基酸。3條鏈?zhǔn)菄@一個中軸以右手螺旋的方式超螺旋而形成三螺旋結(jié)構(gòu)。三螺旋結(jié)構(gòu)形成的前提是含有一個甘氨酸殘基，位于每個多肽鏈的第三個位置，構(gòu)成Gly－X－Y的重復(fù)結(jié)構(gòu)，為膠原的共同特征，X、Y表示任意氨基酸，X通常是脯氨酸（Pro），Y通常指羥脯氨酸（Hyp）（圖4－1）。膠原蛋白中含有大量的甘氨酸（占31．4%～33．8%）、脯氨酸（占11．7%～13．8%）、羥脯氨酸（9．4%～12．5%）和丙氨酸，由于羥脯氨酸比較均一，通過測量羥脯氨酸含量，易于計算出膠原含量，但膠原中缺乏半胱氨酸和甲硫氨酸，酪氨酸含量也很低。許多哺乳動物與人膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域基本一致，因此，異種來源的膠原蛋白的同源性很好。

圖4－1　膠原結(jié)構(gòu)

膠原蛋白是一種纖維蛋白，其基本組成單元是原膠原分子。原膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)由N－末端區(qū)域、螺旋區(qū)域和C－末端區(qū)域組成，借助于原膠原蛋白氨基蛋白酶和羧基蛋白酶分別將原膠原的N－末端和C－末端區(qū)域斷裂而形成膠原蛋白。原膠原分子定向整齊排列，分子之間通過共價鍵互相交聯(lián)，彼此并排，形成穩(wěn)定的膠原微纖維（圖4－2）。由結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，原膠原分子由3個自身按左螺旋排列的多肽鍵構(gòu)成，其中2個肽鍵是一樣的，第三個稍有不同。

原膠原分子這種特殊的結(jié)構(gòu)使得該分子又長又細(xì)，長達(dá)300nm，甚至更長，直徑僅15nm，分子量約為30萬，且具有剛性，生成的產(chǎn)物具有較高的機(jī)械強度。但膠原蛋白又不算是一種典型的纖維，易引起小纖維有規(guī)則的扭結(jié)。當(dāng)它被拉長時，扭結(jié)伸直，其纖維狀結(jié)構(gòu)受熱被破壞，當(dāng)溫度超過42℃時，膠原纖維的結(jié)構(gòu)會發(fā)生變化。當(dāng)溫度超過65℃膠原纖維被破壞，長度縮短到原來的1／3，并成為無定形膠原聚合物，有類似于橡膠的性質(zhì)。

（三）膠原的提取方法

膠原可以從皮膚、肌腱、骨、軟骨、胎盤、肺等組織中提取，根據(jù)不同的組織和膠原蛋白類型，提取的方法也有所不同。膠原的水溶性差，另外，由于非膠原成分和膠原的纖維化影響，尤其是膠原分子間的共價鍵交聯(lián)增加了溶解的難度。目前，提取膠原的技術(shù)方法較成熟，一般有兩種手段，一是用溶劑的化學(xué)法，二是用酶的生物化學(xué)法?；瘜W(xué)法中根據(jù)溶劑的不同，可分為中性鹽法和酸性法，兩者可以聯(lián)合應(yīng)用，交互提取，增加膠原的可溶性?；瘜W(xué)法也可與酶法結(jié)合，能很好地提高提取產(chǎn)率。

作為溶劑使用的酸主要有醋酸、枸櫞酸、鹽酸等，其中醋酸最為常用，主要是破壞分子間氫鍵而引起纖維膨脹、溶解，但其溶解量很少，和酶法相比提取產(chǎn)率比較低。酸法對膠原的損傷嚴(yán)重，難以獲得高品質(zhì)的產(chǎn)品。用酸法提取的膠原最大限度地保持了其三股螺旋結(jié)構(gòu)，適宜用作醫(yī)用生物材料及原料。

圖4－2　膠原超分子結(jié)構(gòu)的分級構(gòu)成

堿溶法操作簡便，但由于水解比較嚴(yán)重，得到的是相對分子質(zhì)量較小的膠原產(chǎn)物，還會產(chǎn)生DL－氨基酸消旋混合物，即旋光性化合物。由于只有L－氨基酸才可作為高等動物的有效氨基酸源，D－氨基酸不能作為有效氨基酸源，其中D－氨基酸若高過L－氨基酸，則會抑制L－氨基酸的吸收，且有些D－氨基酸是有毒的，有的甚至有致癌、致畸和致突變作用，不適合用于生物醫(yī)用材料的膠原蛋白的提取，因此本法一般只輔助酸溶法來提取膠原。

氧化法也輔助用于生物醫(yī)用材料在膠原的提取中，用H2O2等氧化劑對鉻革屑進(jìn)行處理，使鉻革屑脫鞣，再經(jīng)過漂洗、過濾，將膠原和鉻分離。氧化法脫鉻速度快、效果好，對膠原的結(jié)構(gòu)破壞程度小，獲得的膠原產(chǎn)物分子量相對較大，很難被皮膚吸收。

對膠原有消化作用的蛋白酶較多，有植物蛋白酶（如菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶等）、動物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、微生物蛋白酶。此外，較常用于水解的蛋白酶還有風(fēng)味復(fù)合酶Flavourzyme、Alcalase等。目前，應(yīng)用于實際生產(chǎn)中的酶主要有堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等。為了獲得較高的經(jīng)濟(jì)價值，在選取酶的時候，一般要考慮酶對膠原作用的強弱及酶的價格。如果酶對膠原的作用太弱，就無法得到高的膠原溶解率，而酶的純度直接影響酶的價格，純度較高的酶與工業(yè)用酶的價格往往相差上千倍，甚至更大。因此，開發(fā)的新產(chǎn)品如無特殊要求，一般選用已完全工業(yè)化的酶，在實際使用過程中再對選用的酶初步純化，除去其中的物理雜質(zhì)，同時這也可以改善酶及水解產(chǎn)品的色澤。此外，還須考慮酶對膠原的作用位點，因為這會直接影響最后水解產(chǎn)物分子量的分布，對水解產(chǎn)物是否適合開發(fā)所需的產(chǎn)品起著至關(guān)重要的作用。

酶處理法具有速度快、條件溫和、對蛋白質(zhì)的成分破壞小等優(yōu)點，而且水解所得到的膠原分子量相對較小，有利于皮膚的吸收。另外，還可以減少環(huán)境污染。選擇適當(dāng)?shù)膯我幻浮?fù)合酶及工藝條件，理論上可以得到所期望的對應(yīng)分子量的水解膠原。為提高膠原蛋白在高附加值領(lǐng)域的應(yīng)用，采用此法對膠原蛋白進(jìn)行水解是近幾年研究的熱點。

聯(lián)合提取膠原的方法有酸酶法、酶酶法、酸堿法和堿酶法等，以酸酶法聯(lián)合應(yīng)用最多見。

對用于提取膠原的組織材料進(jìn)行前處理很重要，要刮掉非膠原性組織，如碎肉、脂肪，一旦有脂肪混入，后面的操作再去除較困難。然后，對提取組織進(jìn)行切片、粉碎或勻漿，組織粉碎程度越細(xì)越好。選擇適當(dāng)?shù)慕M織材料是有效提取各型膠原的前提條件，一般可用動物皮、肌腱和骨提?、裥湍z原，從透明軟骨中提取Ⅱ型膠原，Ⅲ型膠原從胎皮中提取，Ⅳ型膠原從富含基底膜的臟器組織，如腎小球、胎盤、眼球小晶體、角膜中提取。年齡是影響膠原交聯(lián)程度的重要因素，因此，選擇年齡小的動物，其組織提取膠原相對較容易。

從組織提取可溶性膠原，依所用可溶溶劑不同，大致可分為中性鹽可溶性及酸性可溶性膠原，由于膠原對溫度敏感，pH中性時的變性溫度為40～41℃，酸性時為38～39℃，因此，所有操作最好在10～15℃下進(jìn)行，中性鹽溶劑一般采用0．15mol／L、0．45mol／L及1mol／L的NaCl溶液，酸性溶劑多采用pH 3．5的0．05～0．5mol／L醋酸或0．15mol／L枸櫞酸緩沖液，而醋酸提取的膠原含多聚體成分較多。一般說來，經(jīng)上述中性鹽或酸性溶劑反復(fù)抽提2～3次后的殘渣，即為不溶性膠原。

1．從肌腱中提取膠原 肌腱中主要含Ⅰ型膠原而其他類型的膠原含量很少，便于提純制備單一類型的膠原，因此也是目前提取膠原最常用的方法。在肌腱中提取膠原主要從牛肌腱和鼠尾肌腱中提取。我們還成功地從人肌腱中提取出膠原。

鼠尾肌腱酸溶性程度高，采用醋酸提取，一般過程是取大白鼠鼠尾1根，泡于75%乙醇中1h，剪成2～3cm的小段，去皮，抽出肌腱，剪碎成泥，然后將腱泥浸泡于0．05mol／L醋酸溶液100ml中，4℃，48h，其間不時搖動，即可得到粗制膠原溶液，再用1mol／L NaOH中和，23 000g離心，重新溶于0．05 mol／L醋酸中即得到精制膠原。

牛腱中的Ⅰ型膠原是酸不溶性的，常規(guī)的無機(jī)鹽提取法不易提取，一般要用酶法進(jìn)行提取，溫度、底物、緩沖液、pH、酶及其相應(yīng)的輔酶或抑制劑將直接影響提取、純化效果及三螺旋結(jié)構(gòu)的破壞程度?；具^程是將100g牛肌腱去筋膜和肌肉并清洗干凈后，氯仿／乙醇脫脂，切成薄片，然后用勻漿器磨碎，蒸餾水洗滌后，再懸浮于1．5L含胃蛋白酶120mg的0．05mol／L的枸櫞酸中，在10℃中緩慢攪拌消化后72h，離心，取上清液用10mol／L NaOH調(diào)節(jié)至中性，加NaCl固體粉末至濃度2．5mol／L，攪拌過夜，鹽析后離心，沉淀即為Ⅰ型膠原蛋白。

趙蒼碧等建立于胃蛋白酶和無花果蛋白酶提取的方法，新鮮牛腱去除筋膜、脂肪及雜質(zhì)后，冷凍至硬化，沿牛腱纖維方向切成1mm厚薄片，稱重，0．1%Na2CO3溶液浸泡2h，蒸餾水洗5次，不銹鋼篩網(wǎng)濾去水，晾干。取一定重量的肌腱放入三角燒瓶中，分別加入含不同酶質(zhì)量配比的0．3%醋酸溶液（pH 2～3）適量，0～4℃下控溫緩慢攪拌，3～5d，在高速冷凍離心機(jī)中以每分鐘200轉(zhuǎn)離心，上清液即為粗提膠原蛋白溶液。然后，加入1%H2O2，混勻后靜置4h，用7%枸櫞酸三鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5．0，濾掉沉淀，在剩余液體中加入NaCl，緩慢攪拌，4℃靜置過夜保存，沉淀物用Tris緩沖液（pH7．0）4℃浸泡24h，再將沉淀物裝入透析袋內(nèi)，用1%、0．5%、0．1%醋酸透析1d，再用蒸餾水透析3d，每天換液2次，最后得到較純的膠原液，冷凍保存。結(jié)果表明，胃蛋白酶（活性1∶3 000）與牛腱質(zhì)量之比以1∶10最佳，提取速率最大。無花果蛋白酶以1∶100配比最好，提取率提高近1倍，時間縮短1／3，用量只有胃蛋白酶的1／10。

也有采用鹽酸浸泡的方法，使產(chǎn)率達(dá)到80%以上，不需要高速離心、鹽析、透析等步驟。具體步驟是取新屠宰的牛腱500g，常溫下用2mol／L的鹽酸浸泡48h，蒸餾水清洗，0．5mol／L NaOH中和，然后浸泡于0．1%胃蛋白酶溶液中，12h，20℃。取出用水清洗，獲得無細(xì)胞膠原框架。將其切成0．05～0．5cm的小塊，在與上述相同條件下復(fù)浸和酶解一次。在偏振光顯微鏡監(jiān)控下將小塊研磨成直徑為10～50μm，長度為300～500μm的膠原，在50～90℃下干燥至恒重。這樣制備的膠原不但可以做軟組織填充劑，也可以做硬組織填充劑。

2．從皮中提取膠原 皮膠原的提取工藝較為成熟，是提取膠原的常用方法之一。通常有酸法、堿法、酶法及酸酶結(jié)合法、堿酶結(jié)合法。皮組織的來源有牛皮、豬皮、鼠皮、兔皮及魚皮等，其中牛皮最常用，提取出的主要為Ⅰ型膠原，提取工藝成熟且提取出來的膠原純度比較高。

基本過程是將皮膚組織洗清，氯仿／乙醇（2∶1）脫脂，去除皮下組織，去毛、細(xì)切，干冰凍結(jié)粉碎，含20%NaCl的0．05mol／L Tris－HCl洗滌，沉淀用含0．45mol／L NaCl的0．05mol／L Tris－HCl緩沖液在4℃下攪拌1d，多次反復(fù)抽提，然后更換為1．0mol／L NaCl 0．05mol／L Tris HCl緩沖液進(jìn)一步反復(fù)抽提。上清按每升加入30ml冰醋酸，使膠原溶解，再加NaCl達(dá)1．0mol／L進(jìn)行鹽析，攪拌過濾，離心45min，沉淀物用0．05mol／L醋酸反復(fù)抽提，以每分鐘28 000轉(zhuǎn)的速率離心60min，上清用5．0mol／L NaOH中和，加入NaCl至最終濃度為4．4mol／L攪拌過夜。中性條件下鹽析，離心45min，將沉淀物用不同濃度NaCl由低到高逐級鹽析使可分離出Ⅰ型、Ⅲ型膠原。

3．從骨和軟骨中提取膠原 從骨和軟骨組織中提取出的膠原主要為Ⅰ型和Ⅱ型。常用的組織有禽類軟骨、人胚骨、豬的關(guān)節(jié)軟骨和牛鼻軟骨等，由于禽類的骨組織結(jié)合了胃組織和連接纖維蛋白組織，從禽類的骨中提?、裥湍z原的工藝更容易生成粉末狀的膠原。在軟骨中提取膠原之前，先對軟骨進(jìn)行H2O2處理，然后再用胰蛋白酶進(jìn)行消化處理有助于清除軟骨中的黏多糖，能得到纖維狀的軟骨膠原蛋白。

透明軟骨Ⅱ型膠原提取的基本方法是將牛關(guān)節(jié)透明軟骨進(jìn)行脫脂后用刀片削取軟骨，蒸餾水洗滌，切細(xì)，取120g透明軟骨懸浮于1LpH為7．5的0．15mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl緩沖液中，勻漿，每分鐘5 000轉(zhuǎn)，15min，沉淀再懸浮1L1．0mol／L NaCl、0．05mol／L Tris HCl緩沖液中再次勻漿，離心15min，重復(fù)2次，沉淀用1L含125mg胃蛋白酶和200mg NaN3的0．5mol／L的醋酸溶液中，室溫攪拌消化1d，離心15min，上清加NaCl固體粉末至濃度為0．9mol／L進(jìn)行鹽析，攪拌過夜，離心，然后在0．5mol／L醋酸中反復(fù)抽提，以每分鐘28 000轉(zhuǎn)的速率離心60min，5mol／L NaOH中和，加NaCl固體粉末至濃度為4．0mol／L進(jìn)行鹽析，攪拌過夜，離心45min，再重新懸浮于1LpH為7．5的4．0mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl緩沖液中，攪拌過夜，離心，最后用500ml 2．4mol／L NaCl、0．05mol／L Tris－HCl緩沖液進(jìn)行3次抽提，超速離心15min，上清液即為Ⅱ型膠原蛋白，沉淀為Ⅱ型膠原多聚體。

4．從結(jié)締組織中提取膠原 在結(jié)締組織中主要可以提取Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原。采用的材料主要為胎盤、鞏膜、乳豬肝等組織。為了進(jìn)一步降低膠原材料的抗原性，人們開始考慮用人的組織來提取膠原。人胎盤膠原不易引發(fā)受術(shù)者產(chǎn)生免疫反應(yīng)，存留時間長，矯形效果優(yōu)于牛膠原同類產(chǎn)品。人Ⅳ型膠原可應(yīng)用在接觸性鏡片、眼內(nèi)或角膜植入物中。

從人盤胎中提?、粜湍z原的基本過程是，取健康正常分娩的胎盤清洗去污后，剪成小塊勻漿，用0．05mol／L Tris－HCl（pH7．2）緩沖液和0．5mol／L醋酸分別抽提數(shù)次以去除雜蛋白，至組織呈乳白色，然后溶于0．5mol／L醋酸中，用胃蛋白酶消化，6℃，24h，不時攪拌，離心，上清液中逐漸加入NaCl固體粉末至終濃度為1．2mol／L，攪拌過夜，離心，沉淀溶解于0．1mol／L醋酸中，用0．05mol／L Tris－HCl（pH7．4）緩沖液和0．2mol／L NaCl透析過夜，離心，去沉淀，上清中加入NaCl固體粉末至終濃度2mol／L，即可得到Ⅳ型膠原粗品。再用0．05mol／L Tris－HCl（pH8．6）、2mol／L尿素和0．2mol／L NaCl溶解，并用相同緩沖液于4℃透析24h，經(jīng)DEAE－52－纖維素柱色譜分離，收集蛋白峰，再用0．04mol／L醋酸鈉（pH4．8）、2mol／L尿素透析，最后用CM－52纖維素柱色譜分離，須0～0．3mol／L NaCl溶液梯度淋洗，第一峰即為Ⅳ型膠原純品，透析去鹽，冷凍干燥，得到Ⅳ型膠原純品于－20℃保存。

5．人工生物工程方法合成膠原 隨著生物工程技術(shù)的發(fā)展，采用重組DNA技術(shù)，進(jìn)行人體膠原的表達(dá)與純化，是獲得膠原產(chǎn)品的新方法，但目前還難以獲得較大量的膠原生產(chǎn)。另一個制備人體膠原分子的重要途徑是轉(zhuǎn)基因動物。美國膠原公司利用特定乳腺表達(dá)系統(tǒng)，成功實現(xiàn)從轉(zhuǎn)基因動物奶汁中提取人膠原，將特定乳腺表達(dá)系統(tǒng)微量注射到受精卵母細(xì)胞后，移植到哺育動物母體，使其懷胎足月，得到能產(chǎn)生含重組人膠原奶汁的哺乳動物。這種方式產(chǎn)生的人膠原是不含其他類型膠原雜質(zhì)的單型膠原。此外，日本廣島大學(xué)自然科學(xué)研究所吉里勝利教授，在蠶體內(nèi)成功合成了人體膠原蛋白，他把人的基因注入蠶卵，最后在蠶繭中抽出了含有膠原蛋白的絲纖維，其中膠原蛋白的含量約為1%，但如果將其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，則必須將絲纖維中膠原含量提高到5%～10%。

（四）膠原蛋白的交聯(lián)

純化的膠原可以制成許多不同形式的產(chǎn)品，如膜、薄片、海綿、珠體、管、帶等，其中膜和海綿應(yīng)用最多。一方面由于膠原蛋白再形成的材料（如膜和海綿）并不具有所要求的拉伸強度和耐蛋白水解能力，造成在組織構(gòu)建、運輸和移植過程中的操作困難，易被創(chuàng)面膠原酶降解，另一方面由于其移植后降解速度的不可控性，降解過快，造成移植后新生組織和器官形成的時間不夠，難以真正達(dá)到重建組織器官功能的目的。因此，有必要對膠原進(jìn)行進(jìn)一步的改性，改性的方法有共混改性和交聯(lián)改性，其中交聯(lián)改性最為常用。

共混改性是引入其他一些材料，如氨基聚糖、殼多糖、羥基磷灰石等，可以有效地改善膠原的力學(xué)性能，延緩膠原酶的降解，增加新的性能。我們研制的復(fù)方殼多糖真皮基質(zhì)在這三點上的改善作用非常明顯，但是由于共混材料的多相、多組分，后處理較困難。

交聯(lián)改性是通過某些交聯(lián)方法，在膠原蛋白分子內(nèi)和分子間引入共價鍵的交聯(lián)，它能夠保留大部分膠原蛋白結(jié)構(gòu)，提高膠原纖維的力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性，控制降解速度，因此膠原蛋白的優(yōu)勢依然保留，而交聯(lián)劑用量少、成本低、方法簡便，有明顯優(yōu)勢。交聯(lián)改性的方法主要有物理方法和化學(xué)方法。

物理方法有脫氫加熱、紫外線和γ射線照射、光敏劑氧化交聯(lián)等方法，雖然沒有交聯(lián)劑帶來的細(xì)胞毒性問題，但由于交聯(lián)程度低且不均勻，力學(xué)強度差，因而交聯(lián)效果不明顯。

化學(xué)交聯(lián)有三價金屬離子、醛（甲醛、戊二醛、雙醛、糖）、碳化二亞胺、酰疊氮、聚二醇等方法。其中，戊二醛法最為常用。近來研發(fā)最多的是碳化二亞胺法，3－二甲基氨丙基碳化二亞胺（EDC）使用最普遍。戊二醛的2個醛基可分別與2個相同或不相同分子的伯氨基形成Schift堿，將2個分子以五碳橋方式連接起來，高濃度戊二醛與膠原肽鏈的賴氨酸或羥氨酸殘基的ε－氨基反應(yīng)，形成分子間的交聯(lián)，膠原3 156個殘基中約85個氨基酸殘基被交聯(lián)，低濃度時與膠原肽鏈形成分子間交聯(lián)，因此建議用低濃度較好。戊二醛對膠原的交聯(lián)是不可逆的，對沸水、酸、酶的抵抗能力突出，對脲、氨基脲處理穩(wěn)定，交聯(lián)的pH范圍較廣泛，pH 5～12，均表現(xiàn)出良好的交聯(lián)性能，以pH7～8最好，但是戊二醛交聯(lián)，可能對細(xì)胞有毒，須徹底清除未交聯(lián)的戊二醛。碳化二亞胺交聯(lián)膠原時，常是先與肽鏈的羧基反應(yīng)生成中間產(chǎn)物，再與肽鏈的氨基反應(yīng)而形成偶聯(lián)物，交聯(lián)的pH范圍為5～9，與膠原交聯(lián)的最佳條件是pH7．0左右，4℃或室溫24h，碳化二亞胺交聯(lián)膠原，抗膠原酶的降解能力比戊二醛關(guān)聯(lián)的膠原差一些，且有潛在的鈣化能力。

（五）膠原應(yīng)用形式

膠原及其改性產(chǎn)物是一類常用的醫(yī)用高分子材料，已大量用于生物敷料的生產(chǎn)，因為膠原蛋白可大量分離、純化，通過不同的制備方法調(diào)整其通透性，降低其免疫原性，主要可制成薄膜型、海綿型和凝膠型敷料。這類敷料拉伸強度高，但延展性低，易干裂；具有較好的透水通氣性；經(jīng)過交聯(lián)或酶處理降低其抗原性；可以添加藥物、抗生素、透明質(zhì)酸、肝素、FGF、PDGF、EGF等成分，進(jìn)一步提高其性能。如膠原與殼多糖制成復(fù)合生物敷料性能得到明顯的提高，膜的機(jī)械強度好，柔軟性好，有彈性，與皮膚也有良好的貼附性，又有抑制細(xì)菌生長的作用，是一類有發(fā)展前景的敷料。

1．膠原類生物敷料 主要有膠原膜、膠原海綿膜、膠原凝膠等。

（1）膠原膜：移植于創(chuàng)面后無明顯炎癥反應(yīng)，宿主細(xì)胞能很快的浸潤生長，可起到防止細(xì)菌污染傷口的屏障作用，膠原膜吸水性好，還可減輕創(chuàng)面的組織水腫程度，與創(chuàng)面的貼附性好，有利于藥物釋放和促進(jìn)創(chuàng)面壞死組織的溶脫，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)膠原合成，加速上皮化過程。但由于膜太薄，操作較困難，更主要的是缺乏足夠的空隙度和表面積接觸，傷口的滲出液易在膜下積聚成液腔，造成患者疼痛和不舒服感，因此使用上受到限制。

（2）膠原海綿膜：膠原海綿在早期是以封閉傷口、減少感染、阻止體液喪失為主要目的，但在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有許多不足，發(fā)展到改性膠原敷料，降低其免疫原性，可添加其他成分，如透明質(zhì)酸、殼多糖、肝素、葡胺聚糖、抗生素、bFGF、PDGF和EGF，從而賦予更多的生物學(xué)作用，達(dá)到更好地促進(jìn)傷口愈合的目的。

膠原止血海綿制備過程為將牛腱粉碎后加入醋酸溶解5d，過濾除去不溶物，然后上清中加入飽和NaCl溶液，使膠原沉淀，再用蒸餾水洗滌，置溶于0．1%醋酸中，配制15～25mg／ml溶液，離心取含50～60g膠原的上清液，加6～8ml甲醛，在35～41℃下攪拌至發(fā)泡，控制泡沫細(xì)小而均勻，經(jīng)過澆模、冷凍、干燥、脫模即可得到多孔松軟的成品，切成不同規(guī)格，于120℃的干風(fēng)下消毒2h，密封包裝，即為膠原止血海綿。

膠原海綿有以下4個方面的作用：①可大量吸收組織滲出物，防止?jié)駛诟山Y(jié)而起到滑潤作用；②防止傷口受到機(jī)械傷害和細(xì)菌感染；③可作為藥物遞送載體，適合于抗生素短期給藥（3～7d），該系統(tǒng)無副作用，且膠原幾天后可自動被吸收；④膠原為表皮細(xì)胞的遷移和增殖提供了支架和營養(yǎng)交換的空間，有利于上皮細(xì)胞的增生修復(fù)，從而能促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。其中，膠原海綿的多孔性是非常重要的，一般認(rèn)為，孔隙率應(yīng)大于90%，孔徑大小在200～300μm較適宜。研究發(fā)現(xiàn)，孔徑大于80μm時對新生纖維細(xì)胞在其中的生長和毛細(xì)血管的形成是必要的。國外應(yīng)用較多的膠原海綿是Integra，它是用牛膠原和硫酸軟骨素通過戊二醛交聯(lián)制成的海綿，表面覆蓋有一層硅橡膠，厚2mm，有70～200μm的微孔。

（3）膠原凝膠：由于膠原具有很好的復(fù)凝特性，可以制成天然高分子凝膠，但材料穩(wěn)定性差，易降解，現(xiàn)多與其他天然高分子或合成高分子材料制成共混水凝膠。如膠原－殼多糖、膠原－聚乳酸、膠原－聚氨酯、膠原－聚甲基丙烯酸羥酸、膠原－聚乙烯醇等水凝膠。由于水凝膠與人體組織的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)極為相似，因而其生物學(xué)價值很重要，尤其是在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

膠原凝膠類敷料可以與不平整的傷口形成緊密的結(jié)合，消除了死腔，減少了細(xì)菌得以生長的機(jī)會，且潮濕的環(huán)境有利于修復(fù)細(xì)胞的生長，但抗膠原酶降解能力差且收縮嚴(yán)重，因此很少單獨使用，但其生物學(xué)性能優(yōu)于傳統(tǒng)膠原海綿真皮。

綜上所述，單純的膠原膜、膠原海綿和膠原凝膠只能作為暫時性生物敷料，盡管是由外源性膠原制備，但仍然可以促進(jìn)創(chuàng)面的凝血，誘導(dǎo)與創(chuàng)面愈合相關(guān)的細(xì)胞遷移、增殖，具備良好的透氣性、透水性，在一定程度上保護(hù)創(chuàng)面防止感染和促進(jìn)創(chuàng)面的愈合。但因其僅有支架沒有細(xì)胞的參與，難以實現(xiàn)完美的傷口修復(fù)作用，人們一直希望能有一種永久性替代自體皮膚移植的材料，以避免因供皮給患者造成新的損傷，也是解決大面積深度燒傷患者自體皮源不足的根本手段。因此，人們又利用膠原作為基質(zhì)，研制出一系列的組織工程皮膚替代物。

2．基于膠原的組織工程皮膚替代物由于膠原具有良好的生物學(xué)性能，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域，尤其是它具有凝聚特性，可與其他材料復(fù)合制備出性能更好的復(fù)合材料，因此特別適合組織工程領(lǐng)域支架材料的構(gòu)建。膠原應(yīng)用的形式有膜、帶、薄片、海綿、珠體等，在皮膚組織工程中，最常見的應(yīng)用形式是海綿、水凝膠和膜三種形式。

膠原支架材料從制作方法上大致可分為兩種類型。一種是將可溶性膠原利用其重聚性特點，再制成重組的膠原生物材料，另一種是利用膠原蛋白組織的天然結(jié)構(gòu)，制備脫細(xì)胞真皮基質(zhì)，這種材料更適于用作支架材料。從組分上來看，有單純膠原支架、復(fù)合膠原支架，膠原常與透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素和殼多糖聯(lián)合應(yīng)用。復(fù)合組分中的成分往往是天然細(xì)胞外基質(zhì)，對細(xì)胞的黏附、遷移、增生和生長分化有利，膠原和硫酸軟骨素支架的優(yōu)點，一是膠原經(jīng)硫酸軟骨素交聯(lián)后，能夠降低膠原的生物降解速度；二是提高物理特性，如彈性模數(shù)和拉伸強度；三是增大孔隙結(jié)構(gòu)，改善透氣性和滲濕性。膠原和透明質(zhì)酸復(fù)合，其優(yōu)點是能夠進(jìn)一步提高細(xì)胞的遷移，促進(jìn)傷口愈合，且有良好的黏彈性和機(jī)械特性。膠原經(jīng)殼多糖交聯(lián)后的優(yōu)點是改善了物理特性，降低了膠原的生物降解速度，并具有抑菌功能等。

（1）膠原膜支架：膠原膜通常是經(jīng)純化后的膠原溶液凍干后，經(jīng)風(fēng)干或是用濃氨溶液熏30min，在37℃恒溫箱中干燥成膜，成膜后可以用紫外線照射或是0．06%戊乙醛交聯(lián)，由于膠原膜是表皮細(xì)胞遷移、黏附、生長、增殖的重要支架，有利于傷口的再上皮化，因此也常用作KC培養(yǎng)的底物。以膠原膜作為支架，可用于制備表皮替代物，作為培養(yǎng)角質(zhì)形成細(xì)胞膜片的支撐和促進(jìn)生長基質(zhì)。Horch等將人角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)在未交聯(lián)的Ⅰ型膠原膜上，無血清條件下培養(yǎng)，移植到裸鼠創(chuàng)面，可誘導(dǎo)多層鱗狀上皮細(xì)胞重建。王韋等用豬皮膠原涂在F46膜上，干燥成膜，接種表皮細(xì)胞，培養(yǎng)成膜片，再進(jìn)行自體移植，表皮膜片貼向創(chuàng)面，移植后4d，表皮細(xì)胞膜片使已黏附于創(chuàng)面，形成新的表皮層，表明膠原膜可促進(jìn)表皮細(xì)胞生長和連片。陳曉東等觀察了膠原膜對Fb生長的影響，將培養(yǎng)7d的Fb黏附于膠原膜上，14d時細(xì)胞突起形成并錨定于膜上，17d時分泌的IL－6高于二維培養(yǎng)的Fb。

由于膠原膜片脆性大，搬運操作較困難，因此實際使用較少。

（2）膠原海綿支架：這是較常用的一類支架，是膠原或膠原與其他細(xì)胞外基質(zhì)通過戊二醛等方法交聯(lián)后制備的膠原海綿，然后將Fb種植在海綿內(nèi)，表面再接種表皮細(xì)胞，形成雙層結(jié)構(gòu)的皮膚替代物。由于海綿的孔隙較大，造成接種的表皮細(xì)胞易陷落到海綿內(nèi)，難以在海綿表面形成表皮層，因此用海綿構(gòu)建的多為真皮替代物。對種植Fb時也有影響，F(xiàn)b不一定能全部黏附到海綿內(nèi)，即細(xì)胞上架率難以達(dá)到100%，造成細(xì)胞丟失。馬剛等采用冷凍干燥和戊二醛交聯(lián)，制成上面粗糙，底面成膜的膠原蛋白基質(zhì)網(wǎng)架，按2× 105／cm2密度接種Fb；1h后只有少量細(xì)胞散在分布于海綿的網(wǎng)孔內(nèi)。第三軍醫(yī)大學(xué)王旭等制備的夾心式雙層皮膚替代物是在膠原海綿膜的兩面分別接種KC和Fb。

膠原還與硫酸軟骨素等糖胺聚糖、殼多糖組合制成海綿類支架在皮膚組織工程學(xué)中有所使用。如Integra，是膠原與鯊魚硫酸軟骨素經(jīng)戊二醛交聯(lián)制成的膠原海綿類真皮替代物；膠原－殼多糖－GAGs支架也在皮膚組織工程中應(yīng)用。

（3）水凝膠支架：由于水凝膠制作技術(shù)簡單，更為重要的是在制作過程中能夠與Fb充分混合，能夠完美地模擬其在體生長情況的三維空間，有利于Fb的生長和增殖，凝膠內(nèi)充分水化，也有利于細(xì)胞的營養(yǎng)代謝。因而是目前構(gòu)建組織工程真皮的重要技術(shù)方法。此外，凝膠的表面沒有孔隙，利于接種表皮細(xì)胞，而不至于陷落到凝膠內(nèi)。研究表明僅有極少數(shù)表皮細(xì)胞陷落到凝膠的表層下面。因此，也是制作組織工程雙層皮膚的重要方法。本方法由EB Bell博士最先創(chuàng)立，并形成了第一個以天然細(xì)胞外基質(zhì)為支架材料的組織工程皮膚產(chǎn)品——Apigraf。國內(nèi)也有類似產(chǎn)品得到批準(zhǔn)。

膠原水凝膠支架由于物理特性差，擴(kuò)張強度低，凝膠收縮巨大，抵抗創(chuàng)面膠原酶降解的能力低，不具有抗感染作用。我們針對這些缺陷，通過對支架材料進(jìn)行改進(jìn)，研制的復(fù)方殼多糖組織工程皮膚具有表皮分化層次清楚，真表皮間結(jié)合較緊密，物理特性好，可任意剪切縫合，抗張強度較強，增強了抵抗創(chuàng)面膠原酶降解能力和主動抑菌能力等特性，是一種有前途的新型凝膠類組織工程皮膚。

與其他材料組合，如膠原微海綿植入合成聚合物支架，也可增強其力學(xué)性能。膠原凝膠包被合成材料組成的復(fù)合支架也在組織工程皮膚中有應(yīng)用，細(xì)胞黏附、生長和分化、修復(fù)效果明顯優(yōu)于單純的合成支架。膠原海綿和凝膠可以攜帶生長因子和其他活性物質(zhì)，控制釋放，增強組織工程方法的治療效果。

（六）膠原的生物降解

膠原合成和膠原降解是生理重建的正?，F(xiàn)象。膠原材料移植于創(chuàng)面后會發(fā)生降解，其降解的速度取決于膠原材料本身的免疫原性、宿主的反應(yīng)性、膠原移植物對細(xì)胞浸潤的適應(yīng)性和對蛋白水解酶作用的敏感性，并受到細(xì)胞與基質(zhì)相互作用的調(diào)節(jié)，包括酶的產(chǎn)生、激活和抑制，膠原蛋白的降解不同于一般蛋白類，半衰期從數(shù)周到數(shù)年不等，未變性膠原具有典型的螺旋結(jié)構(gòu)，能夠抵抗一般蛋白水解酶的消化，不易解聚，須有一定濃度的膠原酶和特定條件才能降解，因此膠原蛋白的降解常以膠原酶活性來表示（圖4－3）。

圖4－3　原膠原的分解

膠原基皮膚替代物覆蓋于創(chuàng)面后發(fā)生降解存在以下幾條途徑：①補體和血小板因子激活介導(dǎo)炎性細(xì)胞浸潤。②膠原誘導(dǎo)產(chǎn)生的趨化因子，如PDGF和纖維粘連蛋白，可先后趨化Fb和平滑肌細(xì)胞，且膠原本身對Fb也有趨化性，F(xiàn)b移入膠原移植物內(nèi)，于3～5d后發(fā)生血管生成和快速的膠原分解與合成。③白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬降解的多肽。蛋白酶降解膠原的影響因素較多，主要與膠原本身分子量大小、種類、免疫原性強弱、耐蛋白酶能力和分子間交聯(lián)程度有關(guān)。酶降解一般是先在膠原分子螺旋部分的特定部位裂解出3個酶鏈，形成凝膠多肽，在細(xì)胞外再被中性蛋白酶進(jìn)一步水解，被白細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬，由細(xì)胞內(nèi)溶酶體酶降解。④被創(chuàng)面細(xì)菌分泌的膠原酶直接降解。

降解膠原的肽鏈內(nèi)切酶主要分為4類：①金屬蛋白酶；②絲氨酸蛋白酶；③半胱氨酸蛋白酶；④天冬氨酸蛋白酶。金屬酶和絲氨酸蛋白酶在生理pH條件下降解作用最佳，而半胱氨酸蛋白酶（組織蛋白酶B、H、L、S）和天冬氨酸蛋白酶（組織蛋白酶D）則在酸性的環(huán)境中作用最佳，但仍以吞噬膠原片段的細(xì)胞內(nèi)溶酶體發(fā)揮作用為主。隨著環(huán)境改變，蛋白酶可協(xié)同消化膠原，但重吸收中，細(xì)胞內(nèi)消化不占主導(dǎo)地位?；瘜W(xué)交聯(lián)膠原移植物對酶的消化相對穩(wěn)定，降解慢，且降解速度與交聯(lián)的程度和性質(zhì)有關(guān)。

膠原酶普遍存在于脊椎動物的細(xì)胞內(nèi)及分泌物中，通常以活性的形式存在，經(jīng)纖溶酶及激肽釋放酶等作用后變?yōu)橛谢钚缘哪z原酶，但是膠原酶來源不同，對不同類型膠原水解的能力也不同，人皮膚膠原酶只對Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原起作用，對Ⅳ型、Ⅴ型膠原無效。人中性粒細(xì)胞的膠原酶降解Ⅰ型膠原的能力強，為降解Ⅲ型膠原的15倍。細(xì)菌膠原酶也只降解Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原，對Ⅳ型膠原無效，機(jī)制上也不同于動物膠原酶，它可以從兩端多點降解膠原。

膠原基組織工程皮膚形成過程中，細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力是其生命活力的重要指標(biāo)。Fb合成的前膠原，分泌到細(xì)胞外后，經(jīng)內(nèi)切肽酶水解生成原膠原，自行聚合成膠原微纖維，不夠穩(wěn)定，經(jīng)過共價交聯(lián)形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。培養(yǎng)2周后組織工程皮膚的膠原蛋白基質(zhì)網(wǎng)架在電鏡下已見到成束的膠原纖維。培養(yǎng)3周的膠原蛋白基質(zhì)網(wǎng)架，在偏振光顯微鏡下可見到有成束的紅色雙折光物質(zhì)和細(xì)的綠色雙折光物質(zhì)。單純基質(zhì)網(wǎng)架只見到紅色雙折光物質(zhì)，這一結(jié)果提示當(dāng)組織工程皮膚培養(yǎng)過程中，又有新的膠原由組織工程皮膚所分泌。因此，膠原支架在種植種子細(xì)胞后不斷地處于原有膠原被降解，新膠原又有合成的動態(tài)過程，即處于不斷的重建過程中，以進(jìn)一步完善膠原的三維結(jié)構(gòu)。

總之，膠原由于其良好的生物相容性、低免疫性、完全可降解性和天然拉伸性等特性，已成為組織工程皮膚的最重要的支架材料，其優(yōu)點表現(xiàn)為：①黏附性好，利于細(xì)胞的生長、基底沉積、血管再生和上皮移行及再生長皮化；②具有最適宜的孔徑，特別適合細(xì)胞的營養(yǎng)交換、生長因子擴(kuò)散和血管長入，保持了天然的滲透性；③易于其他支架材料共用，利于開發(fā)出更好的支架材料，可以任意塑形，應(yīng)用形式多樣，利于加工；④生物學(xué)作用接近天然組織，功能全面，還有創(chuàng)面止血，緩解疼痛的作用。缺點表現(xiàn)為：①力學(xué)性能差，難以滿足實際操作需要；②來源于異種或異體組織的膠原中，作為異物仍有一定的免疫排斥反應(yīng)，有傳播病源微生物（如HIV病毒、瘋牛病病毒）的風(fēng)險；③提取工藝復(fù)雜，工業(yè)化生產(chǎn)相對難度較大；④易于在創(chuàng)面降解，降解速度可控制性不如合成材料。此外，使用動物來源的膠原和彈性蛋白膜作為真皮替代物支架，實驗表明能激發(fā)慢性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致組織破壞而不是組織修復(fù)。將KC和Fb接種在化學(xué)修飾的膠原膜上，適于做永久性真皮替代物，但研究表明，移植后有正常的炎癥反應(yīng)。因此，基于蛋白質(zhì)的生物材料制成膜片時尤其應(yīng)考慮免疫原性，膠原作為動物來源的蛋白，可能激發(fā)特異的或不受控制的免疫反應(yīng)?？墒窍拗颇z原類支架在創(chuàng)傷愈合中實際使用的不是免疫原性而是儲藏穩(wěn)定性和制備濃縮膠原溶液所需時間的問題。

二、明 膠

明膠是膠原的變性衍生物，是一種可溶性蛋白，主要由甘氨酸－脯氨酸－羥脯氨酸序列組成，這些序列使明膠可固定水分子，從而形成螺旋結(jié)構(gòu)。明膠繼承了膠原的優(yōu)點，又無抗原性，具有良好的生物相容性及細(xì)胞黏附能力。容易制成溶液方便使用，且價格低廉。明膠作為生長因子載體，在藥物輸送系統(tǒng)技術(shù)中廣泛應(yīng)用；還可與膠原、殼多糖、藻酸鹽、透明質(zhì)酸衍生物、碳酸鈣等其他材料組成復(fù)合海綿支架；包被合成材料以促進(jìn)細(xì)胞黏附、生長而在皮膚和骨組織工程中占有一席之地。

三、纖維連接蛋白

纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)n）是ECM的一個多功能成分，為220～250kDa的由二硫化物連接的二聚體亞單位。通過細(xì)胞結(jié)合位點和相關(guān)的協(xié)同位點，能誘導(dǎo)細(xì)胞黏附、伸展。其細(xì)胞黏附能力是通過幾個生物活性組件實現(xiàn)的，如RGD三肽（精氨酸－甘氨酸－門冬氨酸序列）、第十Fn3組件。將纖維連接蛋白定向吸附于材料表面，能提高細(xì)胞結(jié)合位點的有效性，因此已開發(fā)出很多結(jié)合了Fn的生物材料。

四、糖胺聚糖

糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）是重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，主要的有硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸、硫酸皮膚素、肝素、硫酸角質(zhì)素等5類，其鑒別可見表4－1，它們都是由重復(fù)的二糖單位聚合而成的長鏈多糖，因為其中一個為氨基己糖，也稱為氨基聚糖。透明質(zhì)酸（也稱透明質(zhì)烷或透明質(zhì)酸酯）結(jié)構(gòu)最簡單，不含硫酸根，不與蛋白質(zhì)共價連接，而其他糖胺聚糖均與核心蛋白共價連接成蛋白聚糖。

表4－1　重要糖胺聚糖的分子結(jié)構(gòu)及其在組織中的分布

糖胺聚糖鏈?zhǔn)情L而無分支、不折疊且含多個重復(fù)多糖片斷的多糖鏈，每2個多糖片斷中常有一個含有氨基葡萄糖，易形成線圈樣結(jié)構(gòu)占據(jù)較大空間。GAG有親水性，是多聚陰離子，呈酸性。具有充填細(xì)胞外間質(zhì)、排斥負(fù)電荷并形成水合分子網(wǎng)及結(jié)合生長因子、蛋白酶、黏附分子等生物大分子的功能。由于其離子特性，能吸收大量水分，這種滲透性溶脹能提供壓縮韌力。透明質(zhì)酸具有獨特的吸濕性、流變性和黏彈性，可形成開放、含水的細(xì)胞外微環(huán)境，從而有利于細(xì)胞遷移運動。透明質(zhì)酸可促進(jìn)Fb從細(xì)胞外基質(zhì)脫離，有利于Fb的有絲分裂。在創(chuàng)傷愈合中，富含透明質(zhì)酸的基質(zhì)可促進(jìn)基底細(xì)胞的增生，通過CD44介導(dǎo)的機(jī)制促進(jìn)KC遷移，并減少膠原沉積和瘢痕形成。

細(xì)胞膜上的細(xì)胞外基質(zhì)大分子受體屬于整合素家族的αβ異二聚體，大多數(shù)情況下識別細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）序列。在細(xì)胞的外表面，整合素連接細(xì)胞外基質(zhì)大分子，而在胞質(zhì)內(nèi)，它們連接細(xì)胞骨架。因此，在細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)纖維之間形成膜橋。這種結(jié)構(gòu)使細(xì)胞能黏附到基質(zhì)。與激素－受體或生長因子－受體結(jié)合相似，整合素和其特異性配體相互作用能改變細(xì)胞黏附、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，并能誘導(dǎo)直接的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響細(xì)胞活動。糖胺聚糖還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、增生和新的細(xì)胞外基質(zhì)形成。

由于糖胺聚糖類多糖在細(xì)胞黏附、增殖、分化和細(xì)胞外基質(zhì)合成中的重要作用，常被應(yīng)用于組織工程皮膚中。但因透明質(zhì)酸易溶于水、吸收迅速和在組織中停留時間短等特性限制了它的直接應(yīng)用。化學(xué)修飾、交聯(lián)后的透明質(zhì)酸衍生物性質(zhì)更穩(wěn)定。一般將其與其他天然高分子材料復(fù)合，作為輔助成分使用。糖胺聚糖可與膠原等其他水凝膠類材料共同構(gòu)建生物性能更優(yōu)良的水凝膠支架或交聯(lián)后制成海綿支架；明膠和透明質(zhì)酸鈉交聯(lián)形成的可降解性膜作為KC生長支架，用于構(gòu)建表皮替代物；透明質(zhì)酸經(jīng)交聯(lián)后可形成三維多孔海綿；意大利Fidia Advanced Biopolymers有限公司生產(chǎn)的酯化苯甲基透明質(zhì)酸產(chǎn)品已廣泛用于臨床（見第一篇第1章第三節(jié)）。其他應(yīng)用報道有酯化苯甲基透明質(zhì)酸支架用于韌帶組織工程研究，基于透明質(zhì)酸的海綿治療骨軟骨缺損，基于透明質(zhì)酸的非針織平片支架用作血管移植物，光交聯(lián)透明質(zhì)酸水凝膠用作組織工程支架。

五、纖維蛋白

纖維蛋白（fibrin）主要來源于血漿蛋白，因此具有明顯的血液相容性和組織相容性，沒有毒性和其他不良影響。作為止血劑、創(chuàng)傷愈合劑和可降解生物材料在臨床廣泛應(yīng)用。纖維蛋白本身作為天然細(xì)胞外基質(zhì)成分，有較好地介導(dǎo)細(xì)胞間信號傳導(dǎo)及相互作用的性能?？勺鳛闀簳r性基質(zhì)，隨后被ECM替代。目前以纖維蛋白凝膠的形式在臨床上應(yīng)用。德國生產(chǎn)的表皮替代物“BioSeed－S”就是將KC培養(yǎng)在纖維蛋白凝膠上制成的產(chǎn)品?？膳c其他生物材料，如藻酸鹽或透明質(zhì)酸組合，在皮膚和軟骨組織工程中作為細(xì)胞輸送基質(zhì)使用。纖維蛋白凝膠具有良好的生物相容性和可塑性，可通過釋放PDGF、TGF－β促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)合成。這種纖維蛋白凝膠來源于自身血液，避免了免疫原性問題，是較理想的細(xì)胞外基質(zhì)材料。但有機(jī)械強度差、大量獲取困難的缺陷。纖維蛋白可以用不同方法進(jìn)行化學(xué)改性，其中包括放射性碘化法、重氮甲烷和甲醛甲基化法、與合成高分子嫁接或在纖維蛋白上進(jìn)行酶固定等方法。

六、其他蛋白質(zhì)衍生的生物材料

蠶絲蛋白適合于應(yīng)用在需要力學(xué)特性優(yōu)良、降解時間較長的組織工程化組織或器官的構(gòu)建中。有人在高度多孔的蠶絲蛋白支架中接種MSCs在體外構(gòu)建了組織工程軟骨。

另外，基于酪蛋白和大豆蛋白的材料有希望做組織工程支架。但移植后可能引起異物反應(yīng)。

七、甲殼素及殼多糖

甲殼素又名甲殼質(zhì)、幾丁質(zhì)，是一種廣泛存在于自然界（如蝦蟹外殼、真菌細(xì)胞壁）中的天然高分子化合物，屬于多糖，其化學(xué)名為β－（1→4）聚－2－乙酰氨基－2－D－葡萄糖，是由N－乙酰氨基葡萄糖以β－1，4糖苷鍵縮合而成。殼多糖是甲殼素的脫乙酰化產(chǎn)物，是一種聚陽離子多糖，類似哺乳動物糖胺聚糖（GAGs）結(jié)構(gòu)，由β－1，4鍵重復(fù)鏈接含N－乙?；陌被咸烟菃挝粯?gòu)成，分子呈線性，含有活性的氨基和羥基，可與聚陰離子物質(zhì)（透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素等糖胺聚糖）形成凝膠。它具有天然、安全無毒、可生物降解成正常機(jī)體成分的良好生物相容性，還具有止血、止痛、抑制細(xì)菌和真菌、抗癌等生物學(xué)特性。由于殼多糖的良好生物降解性、組織相容性，并可促進(jìn)透明質(zhì)酸的合成，現(xiàn)已被廣泛用作皮膚、骨、軟骨、神經(jīng)等的組織工程材料，在組織工程中的地位可與膠原媲美。殼多糖可促進(jìn)KC的增殖，但超過一定濃度將抑制Fb的生長。是用作人工皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的理想材料。殼聚糖與膠原或明膠、糖胺聚糖通過真空冷凍干燥制備膠原（明膠）－殼多糖－GAGs海綿支架在組織工程皮膚、骨、軟骨研究中有較多應(yīng)用。在骨組織工程中還與其他材料（如羥基磷酸鈣、藻酸鹽等）制成復(fù)合材料應(yīng)用，還用于非病毒基因載體、制藥領(lǐng)域。殼多糖還被用于生物因子控制釋放、一些難培養(yǎng)細(xì)胞（如人KC、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞）的支持底物。另外，濕紡技術(shù)（wet spinning）生產(chǎn)的殼多糖纖維網(wǎng)、殼多糖海綿、殼多糖顆粒凝聚支架（chitosan particles agglomerated scaffolds）、可注射殼多糖細(xì)胞輸送系統(tǒng)可用于骨和軟骨組織工程，甲殼素管可用于神經(jīng)再生。

膠原－殼多糖海綿適用于構(gòu)建組織工程皮膚，與人Fb培養(yǎng)1個月，產(chǎn)生分化的結(jié)締組織；接種人KC和Fb的膠原－殼多糖海綿雙層皮膚替代物裸鼠移植后能促進(jìn)神經(jīng)再生。1994年，Damour等首次將這類人工皮膚用于臨床，發(fā)現(xiàn)真皮替代物可通過與下層組織貼附從而代替損傷的真皮，促進(jìn)微管組織的長入，移植15d后即可形成連續(xù)的上皮層。此后，Braye等以殼聚糖－膠原材料為支架培養(yǎng)人Fb和角質(zhì)細(xì)胞形成人工皮膚，并將其移植到豬的皮膚損傷處，手術(shù)后14d發(fā)現(xiàn)創(chuàng)傷處人工皮膚在形態(tài)上類似周圍正常皮膚，外觀柔軟、光滑、透明、呈桃紅色，結(jié)果提示利用殼聚糖材料及體外培養(yǎng)的人皮膚細(xì)胞構(gòu)成人工皮膚（真皮替代物）在臨床上應(yīng)用的可能。

我們制備的復(fù)方殼多糖真皮凝膠基質(zhì)的科學(xué)性在于：殼多糖的游離氨基可與膠原的羥基有機(jī)結(jié)合，同時由于殼多糖帶正電荷，膠原帶負(fù)電荷，兩者可自然地通過靜電相互作用，殼多糖還可與聚陰離子的GAGs通過離子交聯(lián)形成多電子復(fù)合體水凝膠。在膠原凝膠內(nèi)，GAG成分（硫酸軟骨素和透明質(zhì)酸）既可以通過與膠原結(jié)合，又在彼此間形成復(fù)合物，使之保持和提高了凝膠的穩(wěn)定。故復(fù)方殼多糖－膠原－GAGs凝膠靠離子鍵、化學(xué)鍵能夠形成一個有機(jī)整體，構(gòu)建理想的水凝膠支架材料。

八、藻 酸 鹽

藻酸鹽是從海藻中分離的一類多糖，由D－甘露糖醛酸和L－Guluronic Acid組成的共聚物。在二價離子（如鈣離子）存在時，可通過離子交聯(lián)作用形成水凝膠。具有價格低、來源豐富、易塑形、親水性更好，易于細(xì)胞吸附、易于營養(yǎng)物質(zhì)滲透等特點。但存在體內(nèi)難以降解、組分不穩(wěn)定（不同成品純度不一）、有一定抗原性等缺點。有將藻酸鹽與明膠經(jīng)化學(xué)交聯(lián)組成的可生物降解真皮替代物的報道。

九、其他動植物多糖

淀粉、纖維素等植物多糖制備的支架有用于骨、軟骨組織工程的報道。瓊脂糖凝膠或海綿用于軟骨、神經(jīng)組織工程。阿拉伯半乳聚糖（阿拉伯樹膠的主要成分）、羧化芽霉菌糖衍生物（carboxylated pullulan deriva－tives）、激光熔結(jié)的聚己酸內(nèi)酯／膠凝糖（gellan gum）海綿及葡聚糖（dextran）水凝膠有用于組織工程支架的報道。

十、天然聚酯

天然聚酯具有可降解、生物相容性好、可熱塑性等特點，組織工程中常用聚羥基丁酸酯（PHB）和其共聚處理產(chǎn)物聚羥基丁酸戊酯（PHBV），單獨或經(jīng)多聚賴氨酸（PLYS）處理或與可溶性磷酸鹽、透明質(zhì)酸、磷酸鈣等復(fù)合，在骨軟骨組織工程中有應(yīng)用。

允許酶介導(dǎo)細(xì)胞遷移的水凝膠（hydrogels enabling enzymatically mediated cell migration）是模擬ECM的一個有趣策略，它通過細(xì)胞分泌的金屬蛋白酶水解基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞向內(nèi)生長。如特殊的細(xì)胞黏附肽、生長因子、變性纖維蛋白原片段與聚乙二醇結(jié)合形成的生物合成雜合水凝膠可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的浸潤和分化。

自發(fā)裝配材料（self－assembling materials）也以模仿ECM為目標(biāo)，有人建議以水凝膠形式用于組織工程。通過pH誘導(dǎo)的自裝配產(chǎn)生了基于兩性分子肽的納米結(jié)構(gòu)纖維支架能誘導(dǎo)生物礦化。通過兩性肽分子自裝配形成的納米纖維三維網(wǎng)狀構(gòu)造被用來包裹神經(jīng)前體細(xì)胞，可很快分化成神經(jīng)元。

總之，天然真皮基質(zhì)擁有刺激血管形成和調(diào)節(jié)內(nèi)源性生長因子的功能。目前認(rèn)為，不同來源、不同種類的纖維連接蛋白、透明質(zhì)酸、殼多糖和膠原，單獨或組合制造的支架中接種細(xì)胞（KC和Fb），在創(chuàng)傷愈合應(yīng)用中是有前途的。存在的問題是需要恢復(fù)活組織的連續(xù)性，將定植和重建基質(zhì)所必需的幾種細(xì)胞通過對創(chuàng)傷修復(fù)的反應(yīng)進(jìn)行整合，控制炎癥和促血管化是努力的方向。使用不同來源的天然材料可能因為不純和含有內(nèi)毒素而誘發(fā)免疫反應(yīng)，另外，由于大規(guī)模生產(chǎn)過程控制不力，可能存在不同批次之間的質(zhì)量差異。