本節(jié)熱門(mén)考點(diǎn)

1．凝集反應(yīng)是顆粒性抗原（細(xì)菌、細(xì)胞等）與相應(yīng)抗體特異性結(jié)合后形成肉眼可見(jiàn)的凝集團(tuán)塊，沉淀反應(yīng)是可溶性抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合，在適當(dāng)條件下出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀線。

2．免疫學(xué)檢測(cè)的三大標(biāo)記技術(shù)：酶免疫測(cè)定、免疫熒光技術(shù)和放射免疫測(cè)定。

3．淋巴細(xì)胞分離的主要方法：葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法，磁珠分離法，流式細(xì)胞術(shù)分離法。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的原理和應(yīng)用。

4．細(xì)胞因子的檢測(cè)：①生物活性測(cè)定法；②免疫學(xué)測(cè)定法，包括RIA和ELISA；③分子生物學(xué)法，包括原位雜交法和RT-PCR法。

一、抗體的檢測(cè)及應(yīng)用抗體進(jìn)行的檢測(cè)

1．概念　指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。根據(jù)反應(yīng)的基本原理與表現(xiàn)主要分為凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)和補(bǔ)體參與的各種反應(yīng)。

2．血凝抑制　當(dāng)病毒的懸液中加入特異性抗體，且這種抗體的量足以抑制病毒顆?；蚱溲貢r(shí)，則紅細(xì)胞表面的受體就不能與病毒顆粒或血凝素直接接觸，這時(shí)紅細(xì)胞的凝集現(xiàn)象就被抑制，稱為血凝抑制反應(yīng)。

3．凝集反應(yīng)和血型的鑒定　凝集反應(yīng)是指顆粒性抗原（如細(xì)菌、紅細(xì)胞或表面帶有抗原的乳膠顆粒）與相應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下可形成凝集團(tuán)塊的現(xiàn)象。凝集反應(yīng)分為直接凝集反應(yīng)和間接凝集反應(yīng)兩種。

ABO血型鑒定，即指ABH血型抗原的檢測(cè)。紅細(xì)胞含A抗原的叫A型，含B抗原的叫B型，含A和B抗原的叫AB型；不含A、B抗原，而含H抗原的稱O型。

4．免疫熒光　這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù)。

5．放射免疫　放射免疫測(cè)定法是用放射性核素標(biāo)記抗原或抗體進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)的技術(shù)，檢測(cè)的敏感度可達(dá)pg/ml水平。

6．酶免疫（ELISA和免疫組化）　酶免疫測(cè)定（EIA）是將酶催化作用的高效性與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶免疫測(cè)定分為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和酶免疫組化技術(shù)，前者用于測(cè)定可溶性抗原或抗體，后者用于測(cè)定組織或細(xì)胞表面的抗原。

7．免疫電鏡　將抗體進(jìn)行特殊標(biāo)記后用電子顯微鏡觀察免疫反應(yīng)的結(jié)果。根據(jù)標(biāo)記方法的不同，分為免疫鐵蛋白技術(shù)、免疫酶標(biāo)技術(shù)和免疫膠體金技術(shù)。

8．免疫沉淀　利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。

9．免疫印跡　免疫印跡又稱Western blotting，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。

二、免疫細(xì)胞的分離

（一）Ficoll-Hypaque離心法

外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。PBMC是免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)最常用的細(xì)胞，也是進(jìn)行T、B細(xì)胞分離純化過(guò)程的第一步。常用的分離方法是葡聚糖-泛影葡膠密度梯度離心法，其原理是根據(jù)外周血中各種血細(xì)胞比重不同使不同密度的細(xì)胞呈梯度分布。紅細(xì)胞密度最大，沉至管底；多形核白細(xì)胞的密度為1.092，鋪于紅細(xì)胞上，呈乳白色；　PBMC的密度約為1.075，分布于淋巴細(xì)胞分層液上面；最上層是血漿。

（二）磁珠分離法

將已知抗細(xì)胞表面標(biāo)記的抗體交聯(lián)物稱為磁珠（平均直徑＜1.5μm的磁性顆粒），與細(xì)胞懸液反應(yīng)后，磁珠借抗體結(jié)合于相應(yīng)細(xì)胞群或亞群表面。再將細(xì)胞懸液加于一試管內(nèi)并置磁場(chǎng)中，因磁珠被磁場(chǎng)吸引，將磁珠結(jié)合的細(xì)胞與未結(jié)合磁珠的細(xì)胞分開(kāi)。

（三）流式細(xì)胞術(shù)

是一種集光學(xué)、流體力學(xué)、電力學(xué)和計(jì)算機(jī)技術(shù)于一體，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)定量測(cè)定和綜合分析的方法?；玖鞒虨椋簩⒋郎y(cè)細(xì)胞懸液與熒光素標(biāo)記抗體反應(yīng)后，在壓力作用下，細(xì)胞排成單列經(jīng)流動(dòng)室下方噴嘴噴出形成液滴射流，每一液滴中包裹一個(gè)細(xì)胞。當(dāng)液滴射流與高速聚焦激光柬相變，液滴中的細(xì)胞受激發(fā)光照射，產(chǎn)生散射光并發(fā)出各種熒光信號(hào)，后者被接收器檢測(cè)。同時(shí)，分選部件將所欲分選細(xì)胞賦以電荷，帶電液滴在分選器的作用下偏向帶相反電荷的偏導(dǎo)板，落入適當(dāng)容器中，達(dá)到分選的目的。流式細(xì)胞儀可鑒定熒光抗體單色、雙色或多色標(biāo)記的細(xì)胞。同時(shí)還能進(jìn)行細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等分析，廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究。

三、免疫細(xì)胞的特異性、數(shù)量和功能檢測(cè)

（一）流式細(xì)胞術(shù)

根據(jù)表面表達(dá)CD分子的種類、水平和多種CD表達(dá)格局，以流式細(xì)胞術(shù)可以二維熒光方圖和比例統(tǒng)計(jì)顯示待測(cè)細(xì)胞群體中某群CD＋細(xì)胞的比例及數(shù)量、CD分子表達(dá)水平的高低，同時(shí)以IFN-γ等細(xì)胞因子或Annexin V凋亡標(biāo)志等，可測(cè)定的功能性CTL、凋亡細(xì)胞的比例，以FITC等標(biāo)記靶細(xì)胞，通過(guò)熒光強(qiáng)度的減弱程度可測(cè)定CTL的殺傷活性。

（二）增殖試驗(yàn)

1．H-TdR摻入法　在PBMC中加入PHA共同培養(yǎng)，終止培養(yǎng)前8～15h加入氚標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），由于3H-TdR能摻入細(xì)胞合成的DNA中，細(xì)胞增殖水平越高，摻入的放射性核素越多。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，用液體閃爍儀測(cè)定樣品的放射活性，反映細(xì)胞的增殖狀況。

2．MTT法　MTT是一種噻唑鹽，化學(xué)名3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基溴化四唑。在細(xì)胞培養(yǎng)終止前數(shù)小時(shí)加入的MTT，作為細(xì)胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底物參與反應(yīng)，形成紫藍(lán)色的甲臢顆粒并沉積于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞周?chē)＜着N可被鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，用酶標(biāo)測(cè)定儀測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)物的OD值，反映細(xì)胞增殖水平的高低。

（三）細(xì)胞毒試驗(yàn)

是檢測(cè)CTL、NK等細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞活性的最為經(jīng)典可靠的細(xì)胞學(xué)技術(shù)。用特異性抗原和細(xì)胞因子刺激7d的效應(yīng)CTL和51Cr標(biāo)記的靶細(xì)胞相互作用4h，被殺傷的靶細(xì)胞可釋放51Cr，培養(yǎng)上清中的51Cr放射性，可代表效應(yīng)性CTL的細(xì)胞毒活性。其優(yōu)點(diǎn)是非常敏感、假陽(yáng)性低；缺點(diǎn)是有放射污染、51Cr半衰期很短且操作復(fù)雜、對(duì)技術(shù)要求很高。近年來(lái)，以FACS方法和乳酸脫氫酶（LDH）ELISA方法取代51Cr試驗(yàn)，但缺點(diǎn)是假陽(yáng)性很高。

（四）細(xì)胞凋亡檢測(cè)

凋亡是一種重要的生理和病理過(guò)程，凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞變圓，與周?chē)?xì)胞脫離，失去微絨毛，胞質(zhì)濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核仁消失，核染色質(zhì)濃縮呈半月形或斑塊狀，出現(xiàn)核著邊現(xiàn)象，最后細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為多個(gè)外有胞膜包繞的凋亡小體。

1．瓊脂糖凝膠電泳法。

2．FACS法。

3．TUNEL法。

（五）芯片技術(shù)

如蛋白質(zhì)微陣列，是指固定于支持介質(zhì)上的大量蛋白質(zhì)或基因構(gòu)成的微陣列。根據(jù)抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，可實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確、高通量的檢測(cè)?；驹硎菍⒏鞣N蛋白質(zhì)有序地固定于芯片，再用熒光標(biāo)記抗體與芯片上對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)結(jié)合，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度可指示對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)的含量。芯片技術(shù)廣泛用于大規(guī)模、高通量檢測(cè)病原體感染后或者特異性抗原刺激后細(xì)胞內(nèi)上調(diào)表達(dá)的抗原譜。

（六）細(xì)胞因子的生物活性檢測(cè)

根據(jù)細(xì)胞因子的生物學(xué)活性，選用相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，包括細(xì)胞增殖法、直接殺傷法、保護(hù)細(xì)胞免受病毒致病變法等。如選用細(xì)胞因子依賴的細(xì)胞株，其增殖反應(yīng)水平與細(xì)胞因子的含量成正相關(guān)，根據(jù)細(xì)胞株的增殖水平可確定樣品中細(xì)胞因子（如IL-1、IL-2、IL-4、IL-6等）的含量。

試題精選

欲檢測(cè)血清中一種微量的小分子肽，下列方法中最敏感的是

A．免疫熒光技術(shù)

B．ELISA法

C．雙向瓊脂擴(kuò)散法

D．單向瓊脂擴(kuò)散法

E．對(duì)流免疫電泳

答案：B