傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)檢測(cè)與鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)特征和生理性狀，需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及一系列復(fù)雜費(fèi)時(shí)的生化反應(yīng)或免疫學(xué)檢測(cè)。 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，細(xì)菌的檢測(cè)鑒定從傳統(tǒng)的形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)進(jìn)入DNA鑒定水平，如G＋C含量、DNA雜交、r DNA指紋、質(zhì)粒圖譜、16Sr DNA序列分析等，其檢測(cè)的準(zhǔn)確性、靈敏性和快捷性都得到極大的提高。

細(xì)菌的16Sr DNA相對(duì)分子量適中，具有保守性和普遍性等特點(diǎn)，序列變化與進(jìn)化距離相適應(yīng)，序列分析的重現(xiàn)性好，因此現(xiàn)在普遍利用細(xì)菌的16S r DNA序列比對(duì)來(lái)對(duì)細(xì)菌的種屬進(jìn)行鑒定。

一、目的要求

了解通過(guò)16Sr DNA的檢測(cè)與鑒定確定植物病原細(xì)菌種屬的原理，掌握PCR擴(kuò)增16Sr DNA的原理與基本操作技術(shù)。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

植物病原細(xì)菌菌株。

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

PCRBuffer、d NTP、Taq酶、細(xì)菌16Sr DNA特異性引物、瓊脂糖、電泳緩沖液、DNA染液等。

（三）實(shí)驗(yàn)儀器與用具

PCR儀、移液器、各種規(guī)格的Eppendorf管、冰臺(tái)、電泳儀、電泳槽等。

三、內(nèi)容和方法

（一）細(xì)菌基因組DNA的提取

1.挑單菌落接種到10m LLB培養(yǎng)液中，于37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

2.取2m L菌懸液到2m LEppendorf管中，8000r/min離心2min，取上清液。

3.加140μLTE打散細(xì)菌，再加60μL10mg/m L的溶菌酶，37℃放置10min。

4.加400μLDigestion Buffer，混勻，再加3μLProtein K，混勻，55℃放置5min。

5.加260μL無(wú)水乙醇，混勻，轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10吸附柱中，10000r/min離心1min，取上清液。

6.加500μL70%的乙醇，10000r/min離心30s，取上清液。

7.重復(fù)1次步驟6。

8.10000r/min離心2min，徹底甩干乙醇，吸附柱置于新的1.5m L Eppendorf管上。

9.加50μL60℃預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3min，12000r/min離心2min，即得細(xì)菌基因組DNA。

10.取3μL基因組DNA溶液電泳檢測(cè)質(zhì)量。

（二）16Sr DNA的PCR擴(kuò)增

1.細(xì)菌16Sr DNAPCR擴(kuò)增的引物

16S-F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’

16S-R5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’

2.PCR擴(kuò)增體系

3.PCR擴(kuò)增條件

94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s，50℃退火45s，72℃延伸100s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min。

4.PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)

取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

（三）PCR擴(kuò)增片段的回收

凝膠電泳結(jié)果若為1條帶，可直接回收產(chǎn)物。 否則需從瓊脂糖凝膠中切割目的條帶，并回收目的片段。

1.稱量2m LEppendorf管質(zhì)量，記錄。

2.在紫外燈下切割含目標(biāo)條帶的凝膠，放入2m LEppendorf管，稱量，計(jì)算凝膠質(zhì)量。

3.每100mg凝膠加入100μL Binding Buffer，混勻，60℃溫育至凝膠熔化。

4.轉(zhuǎn)入U(xiǎn)NIQ-10吸附柱中，10000r/min離心1min，取收集管中液體。

5.加500μLBinding Buffer，10000r/min離心1min，取收集管中液體。

6.加500μL70%的乙醇，10000r/min離心30s，取收集管中液體。

7.10000r/min離心2min，徹底甩干乙醇，吸附柱置于新的1.5m L Eppendorf管上。

8.加30μL60℃預(yù)熱的洗脫緩沖液，室溫放置3min，12000r/min離心2min，即得回收的DNA片段。

（四）DNA片段的測(cè)序

將回收的片段送至生物公司測(cè)序。

（五）序列比對(duì)

將所測(cè)16Sr DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)序列進(jìn)行比對(duì)和同源性分析，確定待測(cè)菌株的分類地位。

四、實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)

3~6學(xué)時(shí)。

五、作業(yè)與思考題

1.將實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果寫成實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

2.為了保證細(xì)菌基因組DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過(guò)程中應(yīng)注意什么？

3.利用16Sr DNA序列鑒定細(xì)菌具有哪些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？