課堂筆記

藥物的體外抗菌試驗是在體外測定微生物對藥物敏感程度的試驗，已廣泛應(yīng)用于科研、生產(chǎn)和臨床。如抗菌藥物的篩選、提取過程中的追蹤、抗菌譜的測定、藥物含量的測定、藥物血濃度測定、指導臨床用藥的藥敏試驗等。

一、常用的體外抑菌試驗★★★

體外抑菌試驗是最常用的抗菌試驗，方法簡便，需時短，用藥量少，不需要動物和特殊設(shè)備，一般是在玻璃器皿中進行。常用的方法有連續(xù)稀釋法和瓊脂擴散法。

（一）連續(xù)稀釋法

連續(xù)稀釋法可用于測定藥物的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。

1．液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法　在一系列試管中，將液體培養(yǎng)基按一定的倍數(shù)稀釋藥物，獲得藥物濃度遞減的系列試管，然后在每一管中加入定量的試驗菌，經(jīng)培養(yǎng)一定時間后，肉眼觀察試管混濁情況，記錄能抑制試驗菌生長的最低濃度（即MIC）。

2．固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法　分平板法和斜面法。平板法可同時測定大批試驗菌株的MIC，且不受藥物顏色及混濁度的影響，適于中藥制劑或評定新藥的藥效學（藥物的體外抗菌活性測定）試驗。斜面法也是固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法的一種，是將系列濃度的各藥物分別混入固體瓊脂培養(yǎng)基中制成斜面，在斜面上接種一定量的試驗菌，然后觀察斜面是否有菌生長，判斷MIC值。

（二）瓊脂擴散法

瓊脂擴散法是利用藥物可以在瓊脂培養(yǎng)基中擴散，在藥物有效濃度的范圍內(nèi)形成抑菌圈或抑菌距離，以抑菌圈直徑或抑菌距離的大小來評價藥物抗菌作用強弱的原理設(shè)計而成，具有各種不同的方法。

1．濾紙片法　濾紙片法是瓊脂擴散法中最常用的方法。適用于新藥的初篩試驗（初步判斷藥物是否有抗菌作用）及臨床的藥敏試驗（細菌對藥物的敏感性試驗，以便選擇用藥）。

2．打孔法　在含菌瓊脂平板上打孔，孔內(nèi)加入藥液，經(jīng)培養(yǎng)后可產(chǎn)生一定大小的抑菌圈。

3．挖溝法　先制備瓊脂平板，在平板上挖溝，溝兩邊垂直畫線接種各種試驗菌，再在溝內(nèi)加入藥液。適用于在一個平板上試驗一種藥物對幾種試驗菌的抗菌作用。

二、殺菌試驗★★

（一）最低殺菌濃度或最低致死濃度的測定

殺菌試驗用以評價藥物對微生物的致死活性。最低殺菌濃度指該藥物能殺死細菌的最低濃度。從對微生物廣義而言，也可稱之為最低致死濃度（MLC）。MLC的含義也可定義為在一定條件下，使絕大多數(shù)微生物被殺死，但允許有最少量微生物存活的藥物最低濃度。

（二）活菌計數(shù)法

活菌計數(shù)法是在一定濃度的定量藥物內(nèi)加入定量的試驗菌，作用一定時間后，取樣進行活菌計數(shù)，從存活的微生物數(shù)計算出藥物對微生物的致死率?；罹嫈?shù)的方法，一般是取試驗菌與藥物作用后的混合液，經(jīng)稀釋后取定量混入瓊脂培養(yǎng)基，傾注成平板。培養(yǎng)后計數(shù)長出的菌落數(shù)或菌落形成單位（CFU），再乘以稀釋倍數(shù)，即得藥物作用后每毫升內(nèi)存活的細胞數(shù)或CFU。

（三）苯酚系數(shù)測定法

苯酚系數(shù)是以苯酚為標準，在規(guī)定的試驗條件下，作用一定時間，將待測的化學消毒劑與苯酚對傷寒沙門菌或金黃色葡萄球菌的殺菌效力相比較，所得殺菌效力的比值。苯酚系數(shù)是了解消毒劑殺菌效力的一種方法。

三、聯(lián)合抗菌試驗★★

在藥學工作中，常需檢查兩種抗菌藥物在聯(lián)合應(yīng)用時的相互作用以及抗菌藥物與不同pH或不同離子溶液的相互影響。如加強藥物抗菌作用的為協(xié)同；減弱藥物作用的為拮抗；相互無影響的為無關(guān)；作用為二者之和的為累加。

（一）紙條試驗

紙條試驗即在已接種試驗菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強、減弱或無影響來判斷它們在聯(lián)合應(yīng)用時的效應(yīng)。

（二）梯度平板紙條試驗

梯度平板紙條試驗，需先制備含藥的梯度平板。梯度平板的制備是先將瓊脂培養(yǎng)基倒入平皿，平皿斜置待凝，再將平板放置水平，加入含抗菌藥物的瓊脂培養(yǎng)基。在重疊的雙層平板中含有梯度濃度的抗菌藥物，自高濃度（＋）至低濃度（-）依次遞減，要求其抑菌濃度的位置約處于平板的一半。將試驗菌懸液涂布于平板表面，取濾紙條浸透另一待檢藥液，按梯度平板中藥物濃度遞減的方向置于平板表面。

（三）棋盤格法

棋盤格法是由于在試驗時，含兩種不同濃度藥物的試管排列呈棋盤狀而得名，用以評價兩種藥物同時用不同濃度進行聯(lián)合試驗時的抗菌活性。實驗時排列6排試管，每排6管，共36管使成方塊（棋盤格式），A及B藥各以液體培養(yǎng)基進行稀釋，A藥各稀釋度按縱行定量加入各管，B藥各稀釋度定量按橫排加入，兩藥同時作單獨抗菌試驗對照。然后加入定量菌液，經(jīng)培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

四、體外抗菌試驗的影響因素★

1．試驗菌　在抗菌試驗中所用試驗菌一般應(yīng)該用標準菌株。

2．培養(yǎng)基　培養(yǎng)基的質(zhì)量須加控制。

3．抗菌藥物　藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗的結(jié)果，需要精確配制。

4．對照試驗　為準確判斷結(jié)果，實驗中應(yīng)設(shè)立各種對照，與抗菌試驗同時進行。

重點難點提示

1．掌握常用的體外抑菌實驗。

2．熟悉殺菌實驗和聯(lián)合抗菌實驗。

3．熟悉體外抗菌實驗的影響因素。

測試及考研

簡答題

哪些因素會影響體外抗菌試驗的結(jié)果？

答案：

①試驗菌：在抗菌試驗中所用試驗菌一般應(yīng)該用標準菌株。試驗菌應(yīng)合理保藏，使用前應(yīng)加以純化及必要的生物學特征鑒定。②培養(yǎng)基：原料、成品的外觀及性能應(yīng)符合要求，并經(jīng)無菌檢查合格后供用。③抗菌藥物：藥物的濃度和總量直接影響抗菌試驗的結(jié)果，需要精確配制。④對照試驗：為準確判斷結(jié)果，實驗中應(yīng)設(shè)立各種對照，與抗菌試驗同時進行。

（徐慰倬）