一、免疫原的制備

免疫原是能激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞的抗原。免疫原的純度可直接影響免疫血清的特異性，因此抗體制備的首要步驟是制備并純化免疫原。天然的免疫原絕大多數(shù)是多種成分的混合體，所以必須從復(fù)雜的混合體中提取出某種單一成分，經(jīng)純化后才可用做免疫原制備相應(yīng)的抗體。根據(jù)免疫原的性質(zhì)及來源不同，其純化方法也有所不同。

（一）顆粒性免疫原的制備

天然的顆粒性免疫原主要是指人、動物或寄生蟲的細胞以及細菌細胞抗原等，制備方法相對較簡單。

1.綿羊紅細胞的制備　綿羊紅細胞是制備溶血素的免疫原，制備方法是采集健康綿羊的靜脈血，立即注入無菌帶有玻璃珠的三角燒瓶內(nèi)，充分搖動15～20 min，除去纖維蛋白，即得抗凝綿羊全血。免疫動物前，取適量抗凝血于離心管中，以無菌生理鹽水洗滌細胞三次（2000 r/min，每次10 min），然后取壓積紅細胞，稀釋成10⁶/mL濃度的細胞懸液即可。

2.細菌免疫原的制備　選用經(jīng)鑒定合格的標(biāo)準(zhǔn)菌株，接種于固體或液體培養(yǎng)基，置溫箱37℃培養(yǎng)24 h。菌體抗原經(jīng)100℃水浴2～2.5 h殺菌并破壞鞭毛抗原即可應(yīng)用。而鞭毛抗原要選用有動力的菌株，菌液用0.3％～0.5％甲醛處理。有些寄生蟲卵也可制成抗原懸液供免疫用。

（二）可溶性免疫原的制備

蛋白質(zhì)、細菌毒素、糖蛋白、脂蛋白、酶類和核酸等均為可溶性抗原，它們大部分來源于組織和細胞，成分復(fù)雜，免疫動物前需要進行純化。其制備過程如下：①選取合適的組織和細胞并將其破碎。②選用適當(dāng)?shù)姆椒◤慕M織和細胞勻漿中提取目的蛋白或其他抗原。③采用層析法等將可溶性抗原進一步純化。④鑒定抗原的純度。

1.蛋白質(zhì)抗原的制備　不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不同，它們的溶解度也不相同，大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機溶劑。

（1）水溶液提取　由于蛋白質(zhì)大部分溶于水、稀酸和稀堿溶液，因此提取蛋白質(zhì)以水溶液為主，其中尤以稀鹽液和緩沖液對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性好，溶解度高。

（2）有機溶劑提取　一些不溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液的蛋白質(zhì)和酶，常用不同比例的有機溶劑來提取。如用70％～80％乙醇提取麩蛋白。

2.核酸抗原的制備　核酸分為兩大類：一類為核糖核酸（RNA），另一類為脫氧核糖核酸（DNA）。核酸是兩性化合物，在一定的pH值溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有機溶劑。細胞內(nèi)的核酸常和蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白，兩種核糖核蛋白的溶解度與溶液電解質(zhì)的濃度、酸堿度有關(guān)，調(diào)節(jié)電解質(zhì)溶液的濃度和酸堿度，可使核糖核蛋白和脫氧核糖核蛋白分離開來。

（1）RNA的提取　RNA在細胞中主要有三種類型：mRNA代謝不穩(wěn)定，提取時要求條件較嚴(yán)格；分離tRNA時，將細胞破碎，用酸處理即可得到沉淀物；rRNA占全部RNA的80％以上，比較穩(wěn)定，一般提取的大分子RNA主要來源此部分。提取核內(nèi)rRNA時常先將細胞核分離后再進行，以避免其他細胞組分RNA的干擾。

（2）DNA的提取　DNA主要存在于細胞核中，天然狀態(tài)的DNA絕大多數(shù)是以脫氧核糖核蛋白形式存在。常用的方法是以1 mol/L氯化鈉溶液抽提，得到的脫氧核糖核蛋白溶液與含有少量辛酸或戊醇的氯仿一起振蕩，除去蛋白質(zhì)即可。

3.脂多糖抗原的制備　脂多糖是革蘭陰性菌細胞壁中的重要成分，對宿主有毒性，即革蘭陰性菌的內(nèi)毒素。內(nèi)毒素只有當(dāng)細菌死亡裂解或用人工方法破壞細菌細胞后才能釋放出來。常用苯酚法提取脂多糖。

（三）半抗原免疫原的制備

半抗原是低相對分子質(zhì)量的化學(xué)物質(zhì)，例如多肽、多糖、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些藥物（包括抗生素）以及其他化學(xué)物品等。這些小分子物質(zhì)無免疫原性，只有把這些半抗原與蛋白質(zhì)載體或與高分子聚合物結(jié)合，才能刺激機體產(chǎn)生特異性抗體或致敏淋巴細胞。半抗原與載體結(jié)合的方法有物理法和化學(xué)法。物理吸附的載體有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸葡聚糖和羧甲基纖維素等，其通過電荷和微孔吸附半抗原。化學(xué)法則是利用功能基團將半抗原連接到載體上。

1.載體的選擇　載體有蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大分子聚合物和某些顆粒等。蛋白質(zhì)是一種良好的載體，常用的有人血白蛋白、牛血白蛋白和牛甲狀腺球蛋白等，其中牛血白蛋白溶解度大，免疫活性強，又易獲得，所以最為常用。

2.半抗原-載體連接方法　半抗原結(jié)合到載體上的數(shù)目與免疫原性有關(guān)。一般認為應(yīng)連接20個以上的半抗原，才能有效地產(chǎn)生抗體。根據(jù)半抗原的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，它們與載體連接的方法亦不同，主要有以下三種形式：

（1）帶有游離氨基或游離羧基以及兩種基團均有的半抗原，可直接與載體連接，如腦啡肽、胃泌素、胰高血糖素、前列腺素等多肽激素類。羧基可用碳化二亞胺法和混合酸酐法與載體氨基形成穩(wěn)定的肽鍵。而帶氨基的半抗原則可與載體羧基縮合，還可借助雙功能試劑如戊二醛等與載體氨基連接。

（2）帶有羥基、醛基、酮基的半抗原，如多糖、醇、酚、核苷以及甾族激素等，不能直接與載體連接，需要用化學(xué)方法改造成羧基后才能與載體連接。例如琥珀酸酐法可將帶羥基的半抗原改造成帶羧基的半抗原琥珀酸衍生物等。

（3）芳香族半抗原，由于其環(huán)上帶有羧基，它鄰位上的氫很活潑，極易取代，因此可先將羧基芳香胺與氨基苯丙酸或?qū)Π被R尿酸等進行重氮化反應(yīng)，然后用碳化二亞胺法使半抗原上的羧基與載體氨基縮合形成肽鍵；也可讓半抗原的羧基先與載體縮合，再進行重氮化反應(yīng)。

3.免疫原的鑒定　純化抗原的鑒定方法較多，常用的有聚丙烯酰胺凝膠電泳法、結(jié)晶法、免疫電泳法、免疫雙擴散法等。僅用一種方法無法作純度鑒定，只有幾種方法聯(lián)合應(yīng)用才較可靠。蛋白質(zhì)抗原的定量常用生化分析方法，根據(jù)測試抗原量的多少可用雙縮脲法或酚試劑法。如果抗原極為寶貴，可用紫外光吸收法。

（四）免疫佐劑

佐劑是指與抗原一起或預(yù)先注射于機體，能夠增強機體免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。佐劑本身可以有免疫原性，也可不具備免疫原性。

1.常用的佐劑　很多物質(zhì)都可作為佐劑，通常按有無免疫原性分為兩類：一種是本身具有免疫原性的佐劑，如細胞因子、微生物及其產(chǎn)物，包括百日咳桿菌、結(jié)核分枝桿菌以及細菌脂多糖等；另一種本身無免疫原性，如液狀石蠟、羊毛脂、氫氧化鋁、表面活性劑等。目前應(yīng)用最多的是弗氏佐劑。它是由液狀石蠟、羊毛脂和卡介苗混合而成。弗氏佐劑又可分為兩種：①不完全弗氏佐劑，是由液狀石蠟與羊毛脂按（1～5）∶1比例混合而成。②完全弗氏佐劑，在不完全佐劑中加入卡介苗（終濃度為2～20 mg/mL），即成為完全弗氏佐劑。在免疫動物時，應(yīng)先將弗氏佐劑與抗原按1∶1體積比混勻，制成“油包水”的乳化液。

2.佐劑的作用機理　佐劑的作用機理較為復(fù)雜，至今尚未完全清楚，歸納起來主要有以下幾種：①可以增加抗原的表面積和改變抗原活性基團構(gòu)型，從而增強抗原的免疫原性。②佐劑與抗原混合可改變抗原的物理性狀，易于刺激機體局部引起肉芽腫，延長抗原在局部組織的貯存時間，使抗原緩慢釋放。③增強巨噬細胞的吞噬作用，刺激淋巴細胞增生，從而促進體液免疫、細胞免疫和非特異性免疫功能。