在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意以下幾點(diǎn)。

1．抗體的特性 免疫共沉淀的使用的任何抗體應(yīng)該是已經(jīng)被明確定義的。也就是說(shuō)，它應(yīng)該明確說(shuō)明可以從粗細(xì)胞抽提物中免疫共沉淀所對(duì)應(yīng)的蛋白。有很多方法可以說(shuō)明：①很多抗體，彼此獨(dú)立地識(shí)別相同的蛋白和相同的肽段。②在沒(méi)有目標(biāo)蛋白的情況下，抗體不能識(shí)別目標(biāo)蛋白。缺乏某種蛋白的細(xì)胞系可以來(lái)自具有癌癥易感性個(gè)體的細(xì)胞系或基因敲除的小鼠。③將35 S標(biāo)記的免疫共沉淀蛋白酶解后的肽譜與定義的cDNA體外翻譯并被35 S標(biāo)記的蛋白進(jìn)行比較。如果細(xì)胞抽提物中沉淀的蛋白與cDNA編碼的蛋白相同，肽譜也應(yīng)該相同。

2．抗體對(duì)照 即使是小鼠的單抗也可能和不同抗原有非特異的相互作用。任何關(guān)于在免疫共沉淀物中可能存在相互作用的蛋白的推斷都需要有特異性的抗體以及非特異結(jié)合抗體的對(duì)照。很明顯，對(duì)照抗體和特異性抗體的特性越接近，越可以起到鑒定非特異相互作用蛋白的效果。對(duì)于一個(gè)小鼠的單抗，同一個(gè)亞類的另一個(gè)小鼠單抗是適合的抗體對(duì)照，對(duì)于兔血清，應(yīng)該選擇同一只兔子的免疫前血清，而對(duì)于純化的兔多抗應(yīng)該選用另一個(gè)純化的兔多抗作為對(duì)照。

3．多種抗體 與抗體識(shí)別的主要目標(biāo)蛋白相互作用的蛋白，而不是與抗體發(fā)生交叉作用的蛋白，也可能被免疫共沉淀下來(lái)。因此，如果多種抗體都可以免疫共沉淀同一種蛋白，那么復(fù)合體中存在特定相關(guān)蛋白的可信性將大大提高。同樣地，免疫共沉淀復(fù)合物中的任何一個(gè)蛋白都應(yīng)該可以觀測(cè)到生理狀態(tài)下的相互作用。這里存在一個(gè)問(wèn)題，不同的抗體識(shí)別不同的抗原表位，一些表位可能隱藏在某一特定的蛋白復(fù)合物內(nèi)部。相反地，一些抗體可能會(huì)影響復(fù)合體中某些蛋白的相互作用。因此，不是所有抗體都能共沉淀出相同的相關(guān)蛋白。

4．使用不表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系 除了非特異結(jié)合于抗體的蛋白，與共沉淀蛋白相關(guān)的蛋白在不表達(dá)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系中應(yīng)該不會(huì)被共沉淀下來(lái)。因此，如果可能的話應(yīng)該用不表達(dá)那個(gè)目標(biāo)蛋白的細(xì)胞系做免疫共沉淀的對(duì)照。

5．驗(yàn)證生物學(xué)相關(guān)突變 在功能上有意義的免疫共沉淀蛋白相關(guān)的蛋白可能在蛋白突變后就無(wú)法發(fā)生生物學(xué)的相互作用。因此，如果可能的話，應(yīng)該檢測(cè)免疫共沉淀蛋白與生物學(xué)失活突變蛋白的相互作用。這種突變可以是在特定的人細(xì)胞系中自然表達(dá)的（例如，腫瘤細(xì)胞中含有突變蛋白）或者可以是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的帶表位標(biāo)簽的突變蛋白。

6．驗(yàn)證相互作用發(fā)生在細(xì)胞裂解前還是裂解后 細(xì)胞裂解很大程度上影響細(xì)胞分區(qū)，細(xì)胞裂解后可能將正常狀態(tài)亞細(xì)胞定位不同的蛋白拉近到一起。這樣就提供了形成細(xì)胞裂解后非生理狀態(tài)蛋白復(fù)合物的機(jī)會(huì)。理論上，可以通過(guò)在裂解緩沖液中加入可能的相互作用蛋白競(jìng)爭(zhēng)裂解后的相互作用。

7．降低背景和非特異性相互作用蛋白 非特異性相互作用的數(shù)量或非生理狀態(tài)下的相關(guān)蛋白可以通過(guò)優(yōu)化免疫共沉淀的條件來(lái)減少。