實(shí)訓(xùn)39　食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)

一、實(shí)訓(xùn)目的

（1）學(xué)習(xí)食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)的一般程序。

（2）熟練掌握平板菌落計(jì)數(shù)法和乳糖發(fā)酵法。

（3）了解各種食品的國(guó)家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

二、實(shí)訓(xùn)原理

食品微生物檢驗(yàn)是研究食品中微生物的種類、分布、生物學(xué)特性、流行病學(xué)特點(diǎn)、微生物作用機(jī)理及檢驗(yàn)方法的一門技術(shù)科學(xué)，主要研究食品的污染與檢測(cè)范圍、衛(wèi)生指標(biāo)和檢驗(yàn)方法。

食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)一般檢驗(yàn)食品的菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母菌、致病菌等指標(biāo)。

菌落總數(shù)是食品檢樣經(jīng)過(guò)處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得1g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。菌落總數(shù)不能區(qū)別其中細(xì)菌的種類，所以也被稱作雜菌數(shù)、需氧菌數(shù)等。食品在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸、儲(chǔ)藏等過(guò)程中都有可能受到各種各樣的細(xì)菌污染。細(xì)菌可在食品中繁殖而引起食品腐敗變質(zhì)。菌落總數(shù)主要是用來(lái)作為判定食品被細(xì)菌污染程度的指標(biāo)。食品中細(xì)菌數(shù)的多少，不僅可以反映出食品被污染的程度，而且也反映出食品的新鮮程度和食品生產(chǎn)的一般衛(wèi)生狀況等，因此該項(xiàng)指標(biāo)是判定食品衛(wèi)生質(zhì)量的一項(xiàng)重要依據(jù)。

大腸菌群是糞便污染的指標(biāo)菌。糞便是人、畜腸道排泄物，其中有健康人畜的糞便，也有腸道患者或腸道病原攜帶者的糞便，所以糞便內(nèi)除一般正常細(xì)菌外，同時(shí)也含有一些腸道致病菌（如沙門氏菌、志賀氏菌和腸道病毒等）。大腸菌群包括大腸埃希氏菌屬、枸櫞酸菌屬、克雷伯氏菌屬、陰溝腸桿菌以及其他一些需氧及兼性厭氧、在37℃24h能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌群分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，但產(chǎn)氣量的多少與菌型、菌量的多少和樣品種類有關(guān)。在伊紅美藍(lán)平板上，該菌群的菌落均為光滑濕潤(rùn)或干燥兩類，邊緣整齊，但菌落的顏色有很大的差異，呈深紫黑色有金屬光澤或呈粉紅色，一般呈深紫黑色有金屬光澤的菌落檢出率較高。食品中檢出大腸菌群，說(shuō)明該食品近期或遠(yuǎn)期受到糞便的污染，也可能有腸道病原菌的存在。大腸菌群數(shù)檢出的高低，表明糞便污染的程度、食品衛(wèi)生的質(zhì)量和對(duì)人體健康危害性的大小。不同食品大腸菌群的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)是不同的，采用最可能數(shù)MPN進(jìn)行大腸菌群計(jì)數(shù)，MPN是基于泊松分布的一種間接計(jì)數(shù)方法。一般要求大多數(shù)食品1g（mL）大腸菌群的最可能數(shù)小于3或小于30。

食品中致病菌的檢驗(yàn)包括食品中腸道致病桿菌（沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌）的檢驗(yàn)、致病性球菌（金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌）的檢驗(yàn)和其他致病菌（副溶血性弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、空腸彎曲菌、變形桿菌、肉毒梭菌及肉毒毒素、產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、椰毒假單胞菌酵米面亞種、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌）的檢驗(yàn)。

食品中真菌的檢驗(yàn)包括食品中酵母菌和霉菌的檢驗(yàn)。本實(shí)訓(xùn)只檢驗(yàn)食品企業(yè)通常檢驗(yàn)的項(xiàng)目菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。

三、實(shí)訓(xùn)器材

1．設(shè)備

超凈工作臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋，電爐，恒溫水浴鍋，微波爐，菌落計(jì)數(shù)器，生化培養(yǎng)箱，均質(zhì)器。

2．儀器與用具

φ90mm培養(yǎng)皿，錐形瓶（250mL、500mL），吸管（1mL、10mL），試管，燒杯，玻璃棒，量筒，天平，研缽，均質(zhì)杯或均質(zhì)袋，記號(hào)筆。

3．培養(yǎng)基與試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯，NaCl，SiO₂。

4．檢驗(yàn)樣品

塊狀食品（如糕點(diǎn)、加工肉制品、方便面、果凍等）；粉狀食品（如奶粉、嬰兒米粉、固體飲料等）；液態(tài)食品（果汁飲料、碳酸飲料、鮮牛奶等）。

四、實(shí)訓(xùn)步驟

（一）實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備

1．選擇檢樣為塊狀食品

（1）手術(shù)剪1把，包扎。

（2）研缽和適量石英砂（SiO₂），包扎。

（3）稱量紙若干，包扎。

（4）裝400mL生理鹽水的錐形瓶1瓶，包扎。

（5）500mL燒杯1個(gè)，試管3支，100mL量筒1個(gè)，分別包扎。

（6）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分別包扎。

（7）φ90mm培養(yǎng)皿10個(gè)，包扎。

（8）平板計(jì)數(shù)瓊脂（plate count agar，PCA）培養(yǎng)基200mL　1瓶，包扎。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的配方：胰蛋白胨5．0g，酵母浸膏2．5g，葡萄糖1．0g，瓊脂15．0g，蒸餾水1000mL，pH　7．0±0．2。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基的制法：將上述成分加于蒸餾水中，煮沸溶解，調(diào)節(jié)pH，分裝到錐形瓶中。

（9）10mL雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯3支，10mL單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6支，每支倒置小倒管，包扎。

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯配方：胰蛋白胨或胰酪胨20．0g，氯化鈉5．0g，乳糖5．0g，磷酸氫二鉀2．75g，磷酸二氫鉀2．75g，月桂基硫酸鈉0．1g，蒸餾水1000mL，pH　6．8±0．2。

月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯制法：將上述成分溶解于蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH，分裝。

單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯：依照月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯配方和制法配制。

雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯：依照月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯配方，加水量不變，其他成分稱量量加倍。

（10）配制煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯，配制試管支數(shù)依據(jù)初發(fā)酵結(jié)果確定，包扎。

煌綠乳糖膽鹽肉湯配方：蛋白胨10．0g，乳糖10．0g，牛膽粉（oxgall或oxbile）溶液200mL，0．1%煌綠水溶液13．3mL，蒸餾水800mL，pH　7．2±0．1。

煌綠乳糖膽鹽肉湯制法：將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200mL（將20．0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH至7．0～7．5），用蒸餾水稀釋到975mL，調(diào)節(jié)pH，再加入0．1%煌綠水溶液13．3mL，用蒸餾水補(bǔ)足到1000mL，用棉花過(guò)濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mL。

其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（5）、（6）、（7）準(zhǔn)備好后，置于121℃高壓滅菌20min，（8）、（9）、（10）置于121℃高壓滅菌15min。

2．選擇檢樣為粉狀食品

（1）稱量紙若干，金屬藥匙1把，分別包扎。

（2）裝400mL生理鹽水的錐形瓶1瓶，包扎。

（3）500mL燒杯1個(gè)，試管3支，100mL量筒1個(gè)，分別包扎。

（4）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分別包扎。

（5）φ90mm培養(yǎng)皿10個(gè)，包扎。

（6）平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基200mL　1瓶，包扎。

（7）10mL雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯3支，10mL單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6支，每支倒置小倒管，包扎。

（8）煌綠乳糖膽鹽肉湯：配制試管支數(shù)依據(jù)發(fā)酵結(jié)果確定，包扎。

其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（5）準(zhǔn)備好后，置于121℃高壓滅菌20min，（6）、（7）、（8）置于121℃高壓滅菌15min。

3．選擇檢樣為液態(tài)食品

1）檢樣為非碳酸飲料

（1）裝400mL生理鹽水的錐形瓶1瓶，包扎。

（2）500mL燒杯1個(gè)，試管3支，100mL量筒1個(gè)，分別包扎。

（3）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分別包扎。

（4）φ90mm培養(yǎng)皿10個(gè)，包扎。

（5）平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基200mL　1瓶，包扎。

（6）10mL雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯3支，10mL單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6支，每支倒置小倒管，包扎。

（7）煌綠乳糖膽鹽肉湯：配制試管支數(shù)依據(jù)發(fā)酵結(jié)果確定，包扎。

其中，（1）、（2）、（3）、（4）準(zhǔn)備好后，置于121℃高壓滅菌20min，（5）、（6）、（7）置于121℃高壓滅菌15min。

2）檢樣為碳酸飲料

（1）裝400mL生理鹽水的錐形瓶1瓶，包扎。

（2）500mL燒杯1個(gè)，試管3支，100mL量筒1個(gè)，分別包扎。

（3）1mL吸管4支，10mL吸管2支，玻璃棒1支，分別包扎。

（4）φ90mm培養(yǎng)皿10個(gè)，包扎。

（5）平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基200mL　1瓶，包扎。

（6）10mL雙料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯3支，10mL單料月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯6支，每支倒置小倒管，包扎。

（7）煌綠乳糖膽鹽肉湯：配制試管支數(shù)依據(jù)發(fā)酵結(jié)果確定，包扎。

（8）500mL磨口瓶1個(gè)，紗布1塊，包扎。

其中，（1）、（2）、（3）、（4）、（8）準(zhǔn)備好后，置于121℃高壓滅菌20min，（5）、（6）、（7）置于121℃高壓滅菌15min。

（二）操作步驟

1．檢樣前處理

1）檢樣為塊狀食品

先將外包裝表面用75%酒精棉擦拭消毒，以無(wú)菌操作開封，用無(wú)菌剪刀剪取檢樣25 g，放入滅菌研缽中剪碎，用滅菌石英砂研磨后，用滅菌生理鹽水225mL制成均勻的1∶10稀釋液。最好將25g檢樣置于盛有225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000～10000r／min均質(zhì)1～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min，制成1∶10的樣品勻液。

2）檢樣為粉狀食品

先將外包裝表面用75%酒精棉擦拭消毒，以無(wú)菌操作開封，稱取檢樣25g，放入500 mL燒杯中，加入滅菌生理鹽水225mL，用滅菌玻璃棒充分?jǐn)嚢?，使溶解均勻，?∶10稀釋液。最好將25g檢樣置于盛有225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000～10000r／min均質(zhì)1～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2min，制成1∶10的樣品勻液。

3）檢樣為液態(tài)食品

（1）檢樣為非碳酸飲料。

先用75%酒精棉擦拭瓶口消毒，以無(wú)菌操作開蓋，用滅菌吸管吸取檢樣25mL，放入500mL燒杯中，加入滅菌生理鹽水225mL，用滅菌玻璃棒充分?jǐn)嚢?，使溶解均勻，?∶10稀釋液。或以無(wú)菌吸管吸取25mL檢樣置盛有225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

圖3－36　菌落總數(shù)測(cè)定流程圖

（2）檢樣為碳酸飲料。

先用75%酒精棉擦拭瓶口消毒，以無(wú)菌操作開蓋，將檢樣倒入500mL滅菌磨口瓶?jī)?nèi)，口勿蓋緊，其上覆蓋一層滅菌紗布，輕輕振搖，待CO₂氣體全部逸出后，用滅菌吸管吸取檢樣25mL，放入500mL燒杯中，加入滅菌生理鹽水225mL，用滅菌玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁谷芙饩鶆?，?∶10稀釋液?；蛞詿o(wú)菌吸管吸取25mL檢樣置盛有225mL滅菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。

注意：對(duì)酸性飲料，需用10%滅菌Na₂CO₃調(diào)節(jié)其pH至中性，再進(jìn)行檢驗(yàn)。

2．菌落總數(shù)測(cè)定

（1）檢樣稀釋。

無(wú)菌操作，將滅菌生理鹽水分裝于2支滅菌試管中，每支9mL，然后取1mL　1∶10（即10^－1）稀釋液注入第1管9mL無(wú)菌生理鹽水中，搖勻，得到10－2稀釋液，再自第1管取1mL　10－2稀釋液注入下一管無(wú)菌生理鹽水中，搖勻，得到10^－3稀釋液。每遞增稀釋一次，即換用1支1mL滅菌吸管。

（2）加樣。

自10－1、10－2、10^－3三個(gè)稀釋度的試管中各取1mL稀釋液加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，另吸取滅菌生理鹽水1mL加入空的滅菌培養(yǎng)皿中，同時(shí)做空白對(duì)照。每個(gè)稀釋度和空白對(duì)照做兩個(gè)培養(yǎng)皿。

（3）倒培養(yǎng)基。

各傾注約15mL已熔化并冷卻到45℃左右的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，立即在桌上做平面旋搖，使樣液與培養(yǎng)基充分混勻。

（4）培養(yǎng)。

待培養(yǎng)基凝固后，倒置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)塊狀食品和粉狀食品培養(yǎng)時(shí)間為（48±2）h，對(duì)液態(tài)食品培養(yǎng)時(shí)間為（24±2）h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

用菌落計(jì)數(shù)器計(jì)算平板內(nèi)菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得1g（mL）食品所含菌落總數(shù)。

菌落總數(shù)測(cè)定流程圖如圖3－36所示。

3．大腸菌群測(cè)定

（1）檢樣稀釋。

同菌落總數(shù)測(cè)定的檢樣稀釋，得到10^－1、10^－2、10^－3三個(gè)稀釋度的均勻稀釋液。

（2）初發(fā)酵試驗(yàn)。

每個(gè)樣品，選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），分別接種于月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯，每個(gè)稀釋度接種3支平行管，每管接種1mL（如接種量超過(guò)1mL，則用雙料LST肉湯）。置（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24±2）h，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，（24±2）h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至（48±2）h，產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。未產(chǎn)氣者報(bào)告大腸菌群陰性。

（3）復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。

用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯管中，（36±1）℃培養(yǎng)（48±2）h，觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，記錄為大腸菌群陽(yáng)性管。

（4）大腸菌群最可能數(shù)的報(bào)告。

按確證的大腸菌群LST陽(yáng)性管數(shù)，檢索MPN表（表3－31），報(bào)告1g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。

表3－31　大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表

續(xù)表

注1：本表采用0．1g（mL）、0．01g（mL）和0．001g（mL）三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3管。

注2：表內(nèi)所列檢樣量如改用1g（mL）、0．1g（mL）和0．01g（mL）時(shí)，表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)除以10；如改用0．01g（mL）、0．001g（mL）、0．0001g（mL）時(shí)，則表內(nèi)數(shù)字應(yīng)相應(yīng)乘以10，其余類推。

大腸菌群測(cè)定流程圖如圖3－37所示：

圖3－37　大腸菌群測(cè)定流程圖

五、結(jié)果記錄

食品檢樣：______批號(hào)：______生產(chǎn)廠家：______

請(qǐng)列表記錄原始數(shù)據(jù)并報(bào)告所測(cè)食品的菌落總數(shù)和大腸菌群的最可能數(shù)。

（1）食品的菌落總數(shù)（表3－32）。

表3－32　所測(cè)食品的菌落總數(shù)

（2）食品的大腸菌群數(shù)（表3－33）。

陽(yáng)性結(jié)果記“＋”，陰性結(jié)果記“－”。

表3－33　所測(cè)食品的大腸菌群最可能數(shù)

（3）結(jié)論：所檢測(cè)食品是否達(dá)到國(guó)家規(guī)定的食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)？

六、思考題

（1）食品檢驗(yàn)為什么要測(cè)定菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)？

（2）食品中大腸菌群檢驗(yàn)為什么首先要用LST肉湯管進(jìn)行初發(fā)酵？為什么要經(jīng)過(guò)復(fù)發(fā)酵才能證實(shí)？復(fù)發(fā)酵時(shí)為什么使用BGLB肉湯管需加膽鹽？