生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)_分子生物學(xué)技術(shù)

第一節(jié)　生物遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)

在人們居住的地球上，有大約1000萬(wàn)種生物。生命的奇跡之一是能代代相傳。通過(guò)對(duì)最高等生物——人類的不斷探索，終于了解了生命是通過(guò)遺傳信息的傳遞而延續(xù)的。遺傳信息的基本單位即基因，基因存在于細(xì)胞染色體的DNA中，一個(gè)生物所有遺傳信息的總和構(gòu)成了基因組。在遺傳信息的傳代中，DNA形成兩個(gè)拷貝，也就是DNA的復(fù)制。

一、基因的結(jié)構(gòu)與功能

從簡(jiǎn)單的病毒到復(fù)雜的高等動(dòng)、植物細(xì)胞，RNA和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息都是以基因的形式貯存在DNA（部分病毒是RNA）中的?；颍╣ene），原稱為遺傳因子，從分子生物學(xué)意義上說(shuō)，基因是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列?；虻幕竟δ芫褪琴A存、傳遞和表達(dá)遺傳信息，并可發(fā)生突變，從而決定生物體的性狀，甚至導(dǎo)致疾病。因此，基因作為分子醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容之一，將分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多門學(xué)科融合到一起，成為人們揭示生命奧妙的重要環(huán)節(jié)。

1.發(fā)展歷史　1865年，Mendel在他豌豆雜交試驗(yàn)的基礎(chǔ)上提出了生物體內(nèi)有某種遺傳顆粒或基本遺傳單位，稱為“遺傳因子”（genetic factor）。這些遺傳因子可以從親代傳遞給子代，并決定生物性狀。Mendel的遺傳規(guī)律在35年后得到另外3位植物學(xué)家的再次證實(shí)，并經(jīng)Bateson的系統(tǒng)介紹，才被人們所認(rèn)識(shí)。1902～1903年，Sutton和Boveri提出了染色體遺傳學(xué)（theory of chromosomal inheritance），即認(rèn)為染色體是“遺傳因子”的攜帶者。1905年，Johannsen首先使用“基因”一詞代替“遺傳因子”，并提出了基因型（gentoype）和表型（phenotype）的概念。1910年，Morgan首先提出基因定位于染色體上的論點(diǎn)。1944年Avery等人的工作證實(shí)了DNA是攜帶遺傳信息和構(gòu)成染色體的生物大分子。1952年，Hershey和Chase利用噬菌體證實(shí)了DNA的遺傳性質(zhì)。

最早闡明基因作用原理的是1945年Beedle和Tatum提出的“一個(gè)基因一種酶”的假說(shuō)。后來(lái)，這一假說(shuō)在許多蛋白質(zhì)中得到了驗(yàn)證，并被修正為“一個(gè)基因一條多肽鏈”的學(xué)說(shuō)。1953年，Watson和Crick在前人工作的基礎(chǔ)上建立DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，遺傳學(xué)進(jìn)入分子水平，標(biāo)志著現(xiàn)代分子生物學(xué)的誕生，基因結(jié)構(gòu)及功能的研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段。1958年Meselon和Stahl提出了DNA半保留復(fù)制，1961年Brenner等發(fā)現(xiàn)了mRNA，1965年Nirenberg和Khorana破譯了密碼子，因此20世紀(jì)60年代建立了較為完整的分子生物學(xué)理論體系——中心法則（central dogma）。20世紀(jì)70年代反轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步完善了中心法則。以后基因工程（Boyer和Cohen，1973）、測(cè)序技術(shù)（Maxam－Gilbert和Sanger，1977）、PCR（Mullins，1985）等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，不僅使染色體的基因定位及物理圖譜制作變得輕而易舉，而且能詳盡地知道定位于染色體DNA上的基因核苷酸順序。隨著2003年人類基因組計(jì)劃的完成和基因表達(dá)調(diào)控研究的進(jìn)展，對(duì)基因的了解也不斷加深。

20世紀(jì)90年代的研究，使Fire和Mello于1998年發(fā)現(xiàn)了RNA干擾。近年來(lái)，其他非編碼RNA（ncRNA）及其功能的不斷發(fā)現(xiàn)以及表觀遺傳學(xué)的發(fā)展，進(jìn)一步豐富了分子生物學(xué)理論，也讓人們意識(shí)到生命的復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了人們的想象。同時(shí)朊病毒和DNA遺傳信息的可編排性的發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)了DNA遺傳、表觀遺傳和遺傳框架之說(shuō)。對(duì)基因的研究也進(jìn)入了后基因組時(shí)代，出現(xiàn)了基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)和整體醫(yī)學(xué)等。這也正應(yīng)驗(yàn)了那句老話，“科學(xué)的發(fā)展是永無(wú)止境的”。

2.真核生物基因結(jié)構(gòu)　組成一個(gè)高等真核生物基因的DNA成分包括：①編碼初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的全部順序；②為正確啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄及進(jìn)行轉(zhuǎn)錄物加工所必需的最低要求的DNA順序；③調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率所必需的DNA順序，如涉及轉(zhuǎn)錄的誘導(dǎo)與抑制的順序以及組織與發(fā)育專一性表達(dá)的順序。

現(xiàn)代真核細(xì)胞編碼蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)如圖2－2所示，包括幾個(gè)重要元件：轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的外顯子和內(nèi)含子，以及對(duì)基因表達(dá)和調(diào)控具有重要作用的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等。

（1）轉(zhuǎn)錄單位（transcription unit）：又稱編碼區(qū)。真核生物的結(jié)構(gòu)基因的編碼區(qū)DNA序列由編碼序列和非編碼序列兩部分組成，編碼序列是不連續(xù)的，被非編碼序列分割開(kāi)來(lái)，稱為斷裂基因（split gene）。在結(jié)構(gòu)基因中，編碼序列稱為外顯子（exon），表達(dá)多肽鏈部分。非編碼序列稱為內(nèi)含子（intron），又稱插入序列。在每個(gè)外顯子和內(nèi)含子的接頭區(qū)都是一段高度保守的共有序列，內(nèi)含子的5′端是GT，3′端是AG，這種接頭方式稱為GT－AG法則，普遍存在于真核生物中，是RNA剪接的識(shí)別信號(hào)。

圖2－2　現(xiàn)代真核細(xì)胞編碼蛋白質(zhì)基因的結(jié)構(gòu)

真核生物內(nèi)含子和外顯子不是完全固定不變的，有時(shí)同一DNA鏈上的某一段DNA序列，當(dāng)它作為編碼某一多肽鏈的基因時(shí)是外顯子，而作為編碼另一多肽鏈時(shí)，則是內(nèi)含子。這樣，同一基因卻可以轉(zhuǎn)錄兩種或兩種以上的mRNA。真核生物某些結(jié)構(gòu)基因沒(méi)有內(nèi)含子，如組蛋白基因，干擾素基因等。它們多以基因簇形式存在，大多數(shù)的酵母結(jié)構(gòu)基因也沒(méi)有內(nèi)含子。

真核基因的外顯子與內(nèi)含子的順序組成有以下一些特點(diǎn)：①基因組內(nèi)由內(nèi)含子分隔的各個(gè)外顯子的排列順序與成熟mRNA中對(duì)應(yīng)的外顯子順序保持一致；②斷裂基因在個(gè)體所有組織細(xì)胞中，不論表達(dá)與否，其結(jié)構(gòu)不變；③絕大多數(shù)內(nèi)含子都含有3種可能序框的終止密碼，當(dāng)內(nèi)含子未被切除時(shí)，翻譯常常在內(nèi)含子內(nèi)終止，產(chǎn)生殘缺的多肽鏈；④不同種屬的同一基因中，外顯子的順序比較保守，而內(nèi)含子的順序變異較大；⑤外顯子的長(zhǎng)度一般＜300bp（堿基對(duì)，base pair），內(nèi)含子的長(zhǎng)度較大，可達(dá)50～60kb，甚至更長(zhǎng)。

（2）啟動(dòng)子（promotor）：為RNA聚合酶特異識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，具有方向性，一般位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的100～200bp范圍內(nèi)，啟動(dòng)子本身不被轉(zhuǎn)錄。人類許多基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游25～30bp的位置常有一段保守序列：TATAAAA或TATATAT，稱為TATA盒（TATA box）。典型啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－70～－80bp位置常還有一段保守序列：GGC（T）CAATCT，稱為CAAT盒，常稱為上游啟動(dòng)子元件。有一些基因沒(méi)有TATA盒與CAAT盒，但在起始點(diǎn)上游－35bp的位置含GGGCGG序列，稱為GC盒，發(fā)現(xiàn)于一些管家基因中。還有一些基因的啟動(dòng)子既沒(méi)有TATA盒，也沒(méi)有GC盒，它們的轉(zhuǎn)錄活性很低或沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，只是在細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和再生過(guò)程中受到調(diào)節(jié)而活化。

（3）增強(qiáng)子（enhancer）：是一段可以位于基因中任何位置的DNA序列，可以與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄，它可以位于基因的上游、下游，甚至內(nèi)含子內(nèi)。增強(qiáng)子無(wú)方向性，在任意位置都有效，但具有組織特異性。后來(lái)發(fā)現(xiàn)干擾素基因轉(zhuǎn)錄時(shí)，其增強(qiáng)子序列內(nèi)含有負(fù)調(diào)控序列，稱為負(fù)增強(qiáng)子，又稱為沉默子（silencer）。由于負(fù)增強(qiáng)子的發(fā)現(xiàn)，有人建議用調(diào)變子（modulator）取代增強(qiáng)子的概念。

（4）終止子（terminator）：基因模板鏈上的5′端還有終止信號(hào)，使RNA聚合酶在模板的特定部位停止作用，終止RNA的合成。無(wú)論原核細(xì)胞或真核細(xì)胞的DNA模板，其終止信號(hào)附近都是一個(gè)連續(xù)的AT堿基對(duì)序列區(qū)，緊挨著此區(qū)的上游則有兩段由多個(gè)G、C組成的所謂“斷裂反向重復(fù)區(qū)”（interrupted inverted repeat）。通過(guò)這兩個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA鏈，其堿基能自身配對(duì)互補(bǔ)而自動(dòng)形成發(fā)夾式結(jié)構(gòu)，阻止RNA聚合酶的前行。此外，5′端的AT富含區(qū)中一連串的A轉(zhuǎn)錄出來(lái)的RNA鏈的3′端為一連串的U。凡是具備了這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的新生RNA即能自動(dòng)脫離RNA聚合酶和DNA模板，而使RNA的轉(zhuǎn)錄終止（圖2－3）。

圖2－3　終止子結(jié)構(gòu)

二、基因組

基因組（genome），指細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和。人類基因組包含核基因組（23條染色體）和線粒體基因組（線粒體上的遺傳物質(zhì)）。真核生物的基因組一般比較龐大，例如人的單倍體基因組由3.2×10⁹bp組成，按1000個(gè)堿基編碼一種蛋白質(zhì)計(jì)，理論上可有300萬(wàn)個(gè)基因。但實(shí)際上，人細(xì)胞中所含基因總數(shù)大概不會(huì)超過(guò)10萬(wàn)個(gè)，根據(jù)人類基因組測(cè)序結(jié)果推測(cè)，大約有3.4萬(wàn)個(gè)基因，甚至更少。這就說(shuō)明在人細(xì)胞基因組中有許多DNA序列并不轉(zhuǎn)錄成mRNA用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的合成。DNA的復(fù)性動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這些非編碼區(qū)往往都是一些大量的重復(fù)序列，這些重復(fù)序列或集中成簇，或分散在基因之間。在基因內(nèi)部也有許多能轉(zhuǎn)錄但不翻譯的間隔序列（內(nèi)含子）。因此，在人細(xì)胞的整個(gè)基因組當(dāng)中只有很少一部分（約占2%）的DNA序列用以編碼蛋白質(zhì)（圖2－4）。

簡(jiǎn)而言之，真核生物基因組有以下特點(diǎn)：①真核生物基因組DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合形成染色體，儲(chǔ)存于細(xì)胞核內(nèi)，除配子細(xì)胞外，體細(xì)胞內(nèi)的基因組是雙份的（即雙倍體，diploid），即有兩份同源的基因組；②真核細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物多為單順?lè)醋樱粋€(gè)結(jié)構(gòu)基因經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯生成一個(gè)mRNA分子和一條多肽鏈；③存在大量重復(fù)序列，且大部分為非編碼序列；④基因組中不編碼的區(qū)域多于編碼區(qū)域；⑤大部分基因含有內(nèi)含子，因此，基因是不連續(xù)的；⑥基因組遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于原核生物的基因組，具有許多復(fù)制起點(diǎn)，而每個(gè)復(fù)制子的長(zhǎng)度較小。為了便于比較，表2－1列出了部分生物的染色體數(shù)和基因數(shù)目。

圖2－4　人類基因組組成

表2－1　部分生物基因組中正常染色體數(shù)及基因數(shù)

1.重復(fù)序列　真核基因組的一大特點(diǎn)就是存在大量的重復(fù)序列，除了編碼rRNA、tRNA、組蛋白和免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)基因外，大部分的重復(fù)序列為非編碼序列。一般根據(jù)重復(fù)基本單位的重復(fù)次數(shù)的多少，可將重復(fù)序列分成三類，即高度重復(fù)序列、中度重復(fù)序列和單拷貝序列；根據(jù)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)又可分為反向重復(fù)序列、串聯(lián)重復(fù)序列和散在重復(fù)序列。

（1）反向重復(fù)序列（inverted repetitive sequences）：由兩個(gè)相同順序的互補(bǔ)拷貝在同一DNA鏈上反向排列而成。變性后再?gòu)?fù)性時(shí)，同一條鏈內(nèi)的互補(bǔ)的拷貝可以形成鏈內(nèi)堿基配對(duì)，形成發(fā)夾式或“＋”字形結(jié)構(gòu)。反向重復(fù)可有一到幾個(gè)核苷酸的間隔，也可以沒(méi)有間隔。沒(méi)有間隔的又稱為回文結(jié)構(gòu)（palimdrome）。

（2）串聯(lián)重復(fù)序列（tanden repeats）：是以一個(gè)重復(fù)單位頭尾相連形成的，人類基因組中的串聯(lián)重復(fù)序列有大衛(wèi)星DNA（macrosatellite DNA）、小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）和微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）。大衛(wèi)星DNA屬于高度重復(fù)序列的串聯(lián)重復(fù)序列，也稱為經(jīng)典衛(wèi)星DNA，是由2～10bp組成，成串排列，在基因組中重復(fù)頻率高，可達(dá)百萬(wàn)（10⁶）以上。由于這類序列的堿基組成不同于其他部分，可用等密度梯度離心法將其與主體DNA分開(kāi)，因而稱為衛(wèi)星DNA或隨體DNA。在人基因組中衛(wèi)星DNA占5%～6%。按照它們的浮力密度不同，人的衛(wèi)星DNA可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ4種。衛(wèi)星DNA還有另一些分類的名稱，如α衛(wèi)星DNA是靈長(zhǎng)類特有的單元為171bp的高度重復(fù)序列，最初是在非洲青猴基因組中發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在已確定分布于人染色體的著絲粒區(qū)。β衛(wèi)星DNA家族是單元為68bp的串聯(lián)重復(fù)序列，富含GC。γ衛(wèi)星DNA是220bp的串聯(lián)重復(fù)。

小衛(wèi)星DNA是由中等大小的串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，一般為0.1～20kb長(zhǎng)，每個(gè)重復(fù)單位在15～70bp。與衛(wèi)星DNA不同，小衛(wèi)星DNA在染色體上分布于常染色質(zhì)區(qū)和端粒處，可分為具有GGGCGGAXG核心序列的高度可變的小衛(wèi)星DNA和具有TTAGGG重復(fù)序列的端粒DNA。小衛(wèi)星DNA重復(fù)單位的拷貝數(shù)在群體內(nèi)存在非常大的變異，有著高度的多態(tài)性。DNA指紋就是利用這一特性來(lái)區(qū)別同一種屬中不同的個(gè)體。這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展很快，目前在法醫(yī)學(xué)、分類學(xué)、生態(tài)學(xué)及動(dòng)、植物遺傳育種等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。

進(jìn)入20世紀(jì)90年代以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)有些串狀重復(fù)序列的重復(fù)單位僅僅有2～5bp，如（CA）n、（GT）n、（GAA）n等。由于重復(fù)單位的長(zhǎng)度比小衛(wèi)星更短，故稱為微衛(wèi)星DNA，又稱為短小串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeats，STRs）或簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs）。它們分布于染色體的常染色質(zhì)區(qū)，多位于編碼區(qū)附近，也可位于內(nèi)含子、啟動(dòng)子、Alu序列中。微衛(wèi)星DNA的生物學(xué)功能尚不清楚，可能對(duì)基因的調(diào)節(jié)起作用，也可能是重組的熱點(diǎn)所在。微衛(wèi)星DNA約占真核基因組的5%，在人類基因組中有（5×10⁴）～（1×10⁵）個(gè)（CA）n重復(fù)序列。每個(gè)微衛(wèi)星DNA序列的基本單元重復(fù)次數(shù)在不同基因型間差異很大，從而形成其座位的多態(tài)性，并按孟德?tīng)柟诧@性方式在人群中世代相傳。因此，這種多態(tài)性標(biāo)志已廣泛用于構(gòu)建人類遺傳連鎖圖譜、基因定位、遺傳病診斷、腫瘤細(xì)胞染色體分離與重組以及親子鑒定等法醫(yī)學(xué)檢查。

（3）散在重復(fù)序列：是指重復(fù)單位并不相連，而是散布在整個(gè)基因組中的序列。散在重復(fù)序列大致分為4種類型：LTR元件、長(zhǎng)散在核元件、短散在核元件和DNA轉(zhuǎn)座子，但主要以長(zhǎng)散在核元件、短散在核元件形式出現(xiàn)。

1）短散在核元件（short interspersed nuclear elements，SINES）：這類重復(fù)單位的平均長(zhǎng)度約為300bp，一般＜500bp，它們與平均長(zhǎng)度約為1000bp的單拷貝順序間隔排列。重復(fù)次數(shù)可達(dá)10⁵左右。如Alu家族，Hinf家族等屬于這種類型的中度重復(fù)序列。

2）長(zhǎng)散在核元件（long interspersed nuclear elements，LINES）：這類重復(fù)順序的長(zhǎng)度＞1000bp，平均長(zhǎng)度為3500～5000bp，它們與平均長(zhǎng)度為13000bp（個(gè)別長(zhǎng)幾萬(wàn)bp）的單拷貝順序間隔排列。也有的實(shí)驗(yàn)顯示人基因組中所有LINES之間的平均距離為2.2kb，重復(fù)次數(shù)一般在1×1⁴左右，如KpnⅠ家族等。

（4）單拷貝序列（single copy sequences）或低度重復(fù)順序：在單倍體基因組中只出現(xiàn)一次或數(shù)次，因而復(fù)性速度很慢。單拷貝順序在基因組中占50%～80%，如人基因組中有60%～65%的順序?qū)儆谶@一類。在絕大多數(shù)真核生物的單倍體基因組中，編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因都不重復(fù)，是單拷貝的基因。單拷貝順序中儲(chǔ)存了巨大的遺傳信息，編碼各種不同功能的蛋白質(zhì)。目前尚不清楚單拷貝基因的確切數(shù)量，但已經(jīng)清楚的是在單拷貝順序中只有一小部分用來(lái)編碼各種蛋白質(zhì)，其余部分的功能尚不清楚。

2.基因家族與假基因　基因家族（gene family）是指核苷酸序列和編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。這些由某一祖先基因經(jīng)過(guò)重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因，常又稱為多基因家族（multi－gene family）。根據(jù)基因家族內(nèi)各成員同源性的程度不同可分為以下幾種：①如rRNA、tRNA和組蛋白等序列相同的基因家族；②如人生長(zhǎng)激素（hGH）、胚胎促乳素（HCS）和催乳素基因核酸序列高度同源的家族；③編碼產(chǎn)物具有同源功能區(qū)的src家族；④如具有天谷丙天（DEAD）盒基因家族，編碼產(chǎn)物具有8個(gè)氨基酸保守基序。由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族，稱為基因超家族（gene superfamily），它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有一定程度的同源性，但功能并不一定相同。在多基因家族中，某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因（pseudo－gene）。假基因與有功能的基因同源，原來(lái)可能也是有功能的基因，但由于缺失、倒位或點(diǎn)突變等，使這一基因失去活性，成為無(wú)功能基因。

3.端?！【€性真核基因組DNA的末端有一種特殊的短而簡(jiǎn)單的重復(fù)序列，稱為端粒（telomere）。端粒的DNA序列相當(dāng)保守，由5～8bp的重復(fù)單位串聯(lián)而成，重復(fù)次數(shù)在不同的生物中變化較大，如小鼠的端粒DNA序列長(zhǎng)150kb，而人端粒DNA序列長(zhǎng)4～15kb，由5′－TTAGGG－3′的重復(fù)序列構(gòu)成，屬于小衛(wèi)星DNA中的一種。端粒在DNA復(fù)制時(shí)，由端粒酶（telomerase）來(lái)完成復(fù)制，以此來(lái)保證DNA的長(zhǎng)度不會(huì)因復(fù)制而變短，保護(hù)了DNA鏈的完整復(fù)制。人類的端粒酶是由端粒酶RNA（TR）、端粒酶相關(guān)蛋白和端粒酶催化亞基（TERT）3個(gè)部分組成。端粒酶以RNA為模板，在TERT的作用下催化合成端粒DNA。其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制都與反轉(zhuǎn)錄酶相似，人們因此也把它歸屬于反轉(zhuǎn)錄酶家族。最近研究表明，端粒由DNA和蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，其作用主要體現(xiàn)在以下4個(gè)方面：①可以使細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)機(jī)制正確區(qū)分正常的染色體末端和損傷DNA雙鏈的末端；②保證了染色體的完整性；③在基因組的功能方面起調(diào)控作用；④參與染色體在細(xì)胞核內(nèi)的定位與組織。端粒末端通常形成高度精密的復(fù)合體，防止被核酸酶等物質(zhì)降解，當(dāng)端粒末端的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞后，染色體便發(fā)生融合，這樣在細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂時(shí)染色體就會(huì)斷裂，造成基因組的不穩(wěn)定性。因此，端粒與細(xì)胞癌變、細(xì)胞的衰老和壽命的長(zhǎng)短密切相關(guān)。

4.轉(zhuǎn)座子　在真核生物基因組中，編碼序列在染色體中的位置相對(duì)比較穩(wěn)定，但也有一些中度重復(fù)序列往往可在染色體間或基因間移動(dòng)。這些存在于DNA上可自主復(fù)制和移位的基本單位稱為轉(zhuǎn)座子（transposon）。目前認(rèn)為，多數(shù)生物體有自發(fā)突變且有重要表型效應(yīng)出現(xiàn)的原因，可源于轉(zhuǎn)座子的可動(dòng)性，并且可以導(dǎo)致宿主基因組發(fā)生從點(diǎn)突變到染色體重排的一系列變化。在果蠅中已發(fā)現(xiàn)30多種可移動(dòng)成分。在人類中多存在反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子（retrotransposon），反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子不同于轉(zhuǎn)座子，是以DNA→RNA→DNA的途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)座的，在整合酶的作用下由RNA反轉(zhuǎn)錄生成的、以DNA狀態(tài)存在的反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子整合到宿主基因組中。這樣，反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在宿主基因組中的拷貝數(shù)得到不斷積累，從而使基因組增大。由于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子帶有增強(qiáng)子、啟動(dòng)子等調(diào)控元件，所以會(huì)影響宿主基因的表達(dá)，在生物進(jìn)化過(guò)程中反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子起著不可忽視的作用。

5.線粒體基因組　線粒體是生物氧化的場(chǎng)所，呼吸鏈中的某些蛋白質(zhì)或酶的編碼基因就在mtDNA上。線粒體還能獨(dú)立合成一些蛋白質(zhì)，因?yàn)榫€粒體有自己的rRNA、tRNA和核糖體等可以用來(lái)表達(dá)自己的基因。

動(dòng)物的線粒體基因組是共價(jià)閉合的雙鏈DNA（mtDNA），一般長(zhǎng)度為15.7～19.5kb核酸序列和組成比較保守。根據(jù)堿性氯化銫密度梯度離心中雙鏈密度不同分為重鏈（H鏈）和輕鏈（L鏈）。哺乳動(dòng)物mtDNA中除一個(gè)蛋白質(zhì)基因（ND6）和8個(gè)tRNA基因由L鏈編碼外，其余的大部分基因都由H鏈編碼。人的mtDNA由16569個(gè)堿基組成，果蠅由16019個(gè)堿基組成?，F(xiàn)已知線粒體的基因組至少含有13個(gè)蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA基因和2個(gè)rRNA基因。蛋白基因包括細(xì)胞色素b基因（Cytb）、細(xì)胞色素氧化酶3個(gè)亞基基因（COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）、NADH氧化還原酶7個(gè)亞基基因（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5、ND6）和ATP酶2個(gè)亞基基因（ATPase6、ATPase8），這13個(gè)蛋白或亞基都是線粒體內(nèi)膜呼吸鏈的組分。另外，還有一些抗藥性基因也在mtDNA上。哺乳動(dòng)物mtDNA基因組上基因之間無(wú)間隔區(qū)（spacer），基因中亦無(wú)內(nèi)含子，甚至有基因重疊現(xiàn)象。

三、染色體

人單倍體細(xì)胞基因組含有3.2×10⁹bp，若將所有染色體相連并充分伸展的話，其長(zhǎng)度可達(dá)2m左右。如此巨大的DNA鏈要全部貯存在小小的細(xì)胞核染色體中，必然存在著適宜的包裝形式。此外，染色體中還含有大量的蛋白質(zhì)和有限的RNA，它們與DNA共同構(gòu)成十分緊密的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)不僅能滿足貯存DNA的數(shù)量要求，而且還應(yīng)該有利于其功能的實(shí)現(xiàn)。

1.染色體的化學(xué)組成　DNA是染色體的主要化學(xué)成分，也是遺傳信息的載體。此外，在認(rèn)識(shí)DNA重要性之前，已經(jīng)知道染色體還含有大量的蛋白質(zhì)，后來(lái)又發(fā)現(xiàn)了RNA。生化研究表明：上述三類組成染色體的化學(xué)成分中，蛋白質(zhì)含量約為DNA的2倍，根據(jù)組成蛋白質(zhì)的氨基酸特點(diǎn)分為組蛋白和非組蛋白兩類。RNA含量很少，還不到DNA量的10%。

（1）組蛋白（histones）：是指染色體中的堿性蛋白質(zhì)，其特點(diǎn)是富含兩種堿性氨基酸（賴氨酸和精氨酸），堿性和酸性氨基酸之比為1.4～2.5，等電點(diǎn)（pI）為7.5～10.5。根據(jù)賴氨酸和精氨酸在蛋白質(zhì)分子中的相對(duì)比例，又將組蛋白分為5種小類型，即組蛋白H1、H2、H3、H4和H5。H1極富賴氨酸，H2A和H2B稍富賴氨酸，H3和H4富含精氨酸。這5種組蛋白的氨基酸全順序均已確定。在各種物種中，H3和H4的序列極少有差異，這種生物進(jìn)化上的高度保守性預(yù)示著其功能的重要性。其他3種組蛋白在不同種屬之間存在著較大的差異。所有真核生物染色體中均含有這五種組蛋白。組蛋白的含量與DNA含量之比約為1∶1。組蛋白中這些強(qiáng)極性氨基酸使蛋白質(zhì)帶上大量電荷，成為組蛋白與DNA結(jié)合及蛋白質(zhì)之間相互作用的主要化學(xué)力之一。

（2）非組蛋白（non－h(huán)istone protein，NHP）：是指染色體中組蛋白以外的其他蛋白質(zhì)，它是種類繁雜的各種蛋白質(zhì)的總稱。估計(jì)總數(shù)為300～600，分子量為7000～80000，等電點(diǎn)為3.9～9.2。對(duì)于其中許多單個(gè)成分的結(jié)構(gòu)和功能，目前還了解甚少。已經(jīng)知道，一些非組蛋白與基因表達(dá)及染色體高級(jí)結(jié)構(gòu)的維持有關(guān)。參與基因復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及核酸修飾的酶類（如各種DNA和RNA聚合酶等）就是一類重要的非組蛋白。另外，非組蛋白中還包括一類高遷移率組（high mobility group，HMG）蛋白質(zhì)，此類蛋白質(zhì)因在凝膠電泳上泳動(dòng)速度快而得名。已經(jīng)明確其中的一些蛋白質(zhì)（如HMG14和HMG17）在轉(zhuǎn)錄活性區(qū)含量豐富，可以認(rèn)為是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的蛋白質(zhì)。

2.核小體的結(jié)構(gòu)　通過(guò)電子顯微鏡觀察破裂的間期細(xì)胞流出的染色質(zhì)，可以看到染色質(zhì)纖維呈非連續(xù)性顆粒狀，就像一條細(xì)線上串聯(lián)著許多有一定間隔的小珠，這些小珠狀顆粒被稱為核小體（nucleosomes），由Kornberg于1974年發(fā)現(xiàn)。核小體由核心顆粒（core particle）和連接區(qū)DNA（linker DNA）兩部分組成，146bp的DNA片段和H2A、H2B、H3和H4各兩分子組成核心顆粒（圖2－5），而60bp左右連接區(qū)DNA則與H1結(jié)合。DNA與組蛋白八聚體的這種相互作用，對(duì)保護(hù)DNA鏈免受細(xì)胞核中核酸酶的消化十分重要。

圖2－5　核小體結(jié)構(gòu)

3.染色體的包裝　實(shí)際上是指細(xì)胞核DNA在雙螺旋基礎(chǔ)上的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)變化，這些結(jié)構(gòu)變化總的看是更高層次的超螺旋形成。上面討論的核小體，可視為染色體DNA的一級(jí)包裝，即由直徑2nm的DNA雙螺旋鏈繞組蛋白形成直徑11nm的核小體“串珠”結(jié)構(gòu)。若增大離子強(qiáng)度，并保留H1，通過(guò)電鏡可觀察到10nm纖維會(huì)折轉(zhuǎn)成較粗的30nm纖維，這種纖維即染色體DNA的二級(jí)包裝，目前較公認(rèn)的二級(jí)包裝結(jié)構(gòu)模型是螺線管纖維（solenoid fiber）。它是由核小體纖維盤(pán)繞形成的一種中空螺線管，其外徑為30nm，每圈含6個(gè)核小體。螺線管纖維基礎(chǔ)上的更高一級(jí)包裝是形成環(huán)狀螺線管，這種結(jié)構(gòu)是30nm纖維纏繞在一個(gè)由某些非組蛋白構(gòu)成的中心軸（central axis）骨架上形成的。即螺線管纖維相隔一定間距的某些區(qū)段被“拉攏”固定在蛋白軸上，從而產(chǎn)生了許多從骨架上伸出的纖維環(huán)（loops）。螺線管纖維需進(jìn)一步以某種方式盤(pán)繞、折疊，最終完成細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的不同時(shí)期的染色體包裝。這種在更高層次上的復(fù)雜的包裝是以何種方式進(jìn)行的，目前尚無(wú)明確定論。從螺線管纖維環(huán)到包裝形成染色體，應(yīng)該是DNA壓縮程度最高的階段，估計(jì)在200～240倍。經(jīng)各級(jí)包裝后染色體DNA總共被壓縮了數(shù)千倍，這樣，才能使每個(gè)染色體中幾厘米長(zhǎng)的DNA分子容納在直徑數(shù)微米（如人細(xì)胞核的直徑為6～7μm）的細(xì)胞核中。

四、DNA復(fù)制及損傷修復(fù)

（一）DNA復(fù)制

體細(xì)胞有絲分裂的間期，在DNA聚合酶的作用下，以一個(gè)親代DNA分子的兩條鏈為模板，合成兩個(gè)結(jié)構(gòu)上完全相同的子代DNA分子的過(guò)程稱為DNA復(fù)制。1953年，Watson和Crick在提出DNA雙螺旋模型時(shí)就指出，由于互補(bǔ)堿基的配對(duì)原則，在DNA復(fù)制時(shí)，只要雙鏈DNA解開(kāi)，以每一條鏈為模板以合成其互補(bǔ)鏈，即可形成兩個(gè)與親代完全一樣的DNA分子。在此過(guò)程中，每個(gè)子代DNA的一條鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制（semi conservation replication）。1958年，Meselson和Stanl采用含¹⁵N的NH₄Cl培養(yǎng)大腸埃希菌，再放入于以¹⁴N為氮源的普通培養(yǎng)液中繁殖，然后用CsCl密度離心方法測(cè)定分裂時(shí)DNA復(fù)制后的密度變化，證實(shí)了DNA的半保留復(fù)制機(jī)制。通過(guò)DNA分子的復(fù)制，把親代的遺傳信息傳給子代，從而使得前后代保持了一定的連續(xù)性。

DNA復(fù)制的基本過(guò)程正如Watson和Crick所預(yù)測(cè)的那樣，但是在DNA復(fù)制中涉及了許多細(xì)胞成分。DNA的復(fù)制過(guò)程大體上可以分為復(fù)制的啟動(dòng)、復(fù)制的延伸和復(fù)制的終止3個(gè)階段。DNA復(fù)制過(guò)程極其復(fù)雜，至今對(duì)其詳細(xì)過(guò)程的了解還很不全面，多數(shù)資料來(lái)源于原核生物。近幾年，對(duì)于真核生物的DNA復(fù)制也有所認(rèn)識(shí)。真核生物的DNA復(fù)制基本上與原核生物相似，但更為復(fù)雜。

1.起始點(diǎn)　DNA復(fù)制在生物細(xì)胞中要從DNA分子上特定位置開(kāi)始。這個(gè)特定的位置就稱為復(fù)制起點(diǎn)（origin of replication），用ori表示。DNA復(fù)制從起點(diǎn)開(kāi)始雙向進(jìn)行直到終點(diǎn)為止，每一個(gè)這樣的DNA單位稱為復(fù)制子或復(fù)制單元。在原核生物中每個(gè)DNA分子上就有一個(gè)復(fù)制子；而在真核生物中每個(gè)DNA分子有許多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子長(zhǎng)50～200kb。因此，真核細(xì)胞DNA的復(fù)制是由許多個(gè)復(fù)制子共同完成的，而且形成兩個(gè)復(fù)制叉進(jìn)行雙向復(fù)制。DNA復(fù)制不是隨機(jī)的從DNA分子上的任何一點(diǎn)起始，而是從特定的區(qū)域開(kāi)始，這說(shuō)明復(fù)制起點(diǎn)有其結(jié)構(gòu)上的特殊性。分子遺傳學(xué)者們利用分子克隆技術(shù)，分離出大腸埃希菌染色體DNA復(fù)制起點(diǎn)oriC。它由422bp的DNA片段組成，其核苷酸序列已經(jīng)搞清。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：①在oriC區(qū)域內(nèi)有一系列對(duì)稱排列的反向重復(fù)序列，即回文結(jié)構(gòu)（palindrome），與復(fù)制酶系統(tǒng)的識(shí)別有關(guān)；②在oriC區(qū)中還有兩個(gè)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)（啟動(dòng)子）的核苷酸序列，這暗示了轉(zhuǎn)錄可能在大腸埃希菌染色體DNA復(fù)制起始中有著重要的作用。目前已有許多實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)錄確實(shí)是復(fù)制的起始所必需的，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。

對(duì)人及高等哺乳動(dòng)物DNA復(fù)制起始位點(diǎn)的了解遠(yuǎn)不如對(duì)原核生物及酵母的復(fù)制起始位點(diǎn)的了解。1998年，Aladjem等發(fā)現(xiàn)在人珠蛋白基因的一個(gè)片段中的幾個(gè)基本位點(diǎn)具有較高的復(fù)制起始功能，可能是DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。

2.復(fù)制過(guò)程　分為4個(gè)階段。

第一階段：親代DNA分子超螺旋的構(gòu)象變化及雙螺旋的解鏈，將復(fù)制的模板展現(xiàn)出來(lái)。參與的酶包括拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA topisomerase）、螺旋酶（helicase）、解鏈酶及單鏈結(jié)合蛋白（single strand DNA binding protein，SSBP）等。

第二階段：為復(fù)制的引發(fā)階段，由復(fù)制因子X(jué)（n蛋白），復(fù)制因子Y（n′蛋白），n″蛋白，i蛋白，DnaB蛋白和DnaC蛋白等6種蛋白質(zhì)組成的引發(fā)前體（preprimosome），在單鏈DNA結(jié)合蛋白的作用下與單鏈DNA結(jié)合生成中間物，這是一種前引發(fā)過(guò)程。引發(fā)前體進(jìn)一步與引物酶（primase）組裝成引發(fā)體（primosome）。引發(fā)體可以在單鏈DNA上移動(dòng)，在DnaB亞基的作用下識(shí)別DNA復(fù)制起點(diǎn)位置。首先在前導(dǎo)鏈上由引物酶催化合成一段RNA引物，然后，引發(fā)體在滯后鏈上沿5′→3′方向不停地移動(dòng)，合成RNA引物。

第三階段：為DNA鏈的延長(zhǎng)（圖2－6），在引物RNA合成基礎(chǔ)上，以每條鏈為模板，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則（A∶T，G∶C），由DNA聚合酶催化進(jìn)行DNA鏈的5′→3′方向合成，前導(dǎo)鏈連續(xù)地合成出一條長(zhǎng)鏈，隨從鏈合成出岡崎片段。真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ及ε5種，DNA復(fù)制是在DNA聚合酶α與DNA聚合酶δ相互配合下催化進(jìn)行的，還有一些酶及蛋白質(zhì)因子參與反應(yīng)。DNA Polα與引發(fā)酶共同起引發(fā)作用，然后由DNA Polδ催化前導(dǎo)鏈及隨從鏈的合成。DNA Polγ是線粒體中DNA復(fù)制酶。DNA Polδ及ε均有外切酶活性，校正復(fù)制中的錯(cuò)誤。它們的5′→3′外切酶活性可能在切除引物RNA中也有作用。去除RNA引物后，片段間形成了空隙，由DNA聚合酶補(bǔ)上。在連接酶作用下，各片段連接成為一條長(zhǎng)鏈。

圖2－6　DNA鏈的延伸過(guò)程

第四階段：為終止階段，復(fù)制叉行進(jìn)到一定部位就停止前進(jìn)，最后前導(dǎo)鏈與隨從鏈分別與各自的模板形成兩個(gè)子代DNA分子，到此復(fù)制過(guò)程就完成了。過(guò)去認(rèn)為，DNA一旦復(fù)制開(kāi)始，就會(huì)將該DNA分子全部復(fù)制完畢，才終止其DNA復(fù)制。但最近的實(shí)驗(yàn)表明，在DNA上也存在著復(fù)制終止位點(diǎn)，DNA復(fù)制將在復(fù)制終止位點(diǎn)處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。但目前對(duì)復(fù)制終止位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少。

在DNA復(fù)制終止階段令人困惑的一個(gè)問(wèn)題是，線性DNA分子兩端是如何完成其復(fù)制的？已知DNA復(fù)制都要有RNA引物參與。當(dāng)RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合酶Ⅰ所填充。但是，在線性分子的兩端以5′→3′為模板的合成，其末端的RNA引物被切除后是無(wú)法被DNA聚合酶所填充的。因?yàn)镈NA聚合酶不具備從頭合成的能力和3′→5′方向的合成能力，這就存在“末端復(fù)制問(wèn)題”。這個(gè)問(wèn)題的解決有賴于端粒和端粒酶的發(fā)現(xiàn)，原來(lái)DNA末端存在一個(gè)重復(fù)序列的結(jié)構(gòu)，并通過(guò)端粒酶依賴機(jī)制和端粒替代延長(zhǎng)機(jī)制來(lái)保證DNA鏈的完整復(fù)制。

（二）DNA損傷及其修復(fù)

DNA分子的完整性和穩(wěn)定性是復(fù)制的高度真實(shí)性的基礎(chǔ)，但生物體內(nèi)外環(huán)境都存在著使DNA分子損傷的因素，引起DNA突變（mutation）。如若不加以糾正，則細(xì)胞就會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤的表達(dá)信息或表達(dá)變異的產(chǎn)物，這往往是疾病和衰老發(fā)生的原因。但生物體內(nèi)也有一套有效的糾正機(jī)制，以恢復(fù)正常DNA結(jié)構(gòu)和功能，稱為DNA修復(fù)（DNA repair）。

1.DNA損傷和突變的引發(fā)因素

（1）DNA分子的自發(fā)性損傷：以DNA為模板按堿基配對(duì)進(jìn)行DNA復(fù)制是一個(gè)嚴(yán)格而精確的事件，但也不是完全不發(fā)生錯(cuò)誤的。堿基配對(duì)的錯(cuò)誤頻率約為10^－1～10^－2，經(jīng)DNA聚合酶校正后的錯(cuò)配率仍約在10^－10左右，即每復(fù)制10¹⁰個(gè)核苷酸大概會(huì)有一個(gè)堿基的錯(cuò)誤。此外，體內(nèi)DNA修復(fù)系統(tǒng)在對(duì)DNA損傷進(jìn)行修復(fù)時(shí)的DNA合成同樣也會(huì)發(fā)生堿基配對(duì)錯(cuò)誤，造成DNA損傷。

生物體內(nèi)DNA分子可以由于各種原因發(fā)生變化，至少有以下類型：①堿基的異構(gòu)互變：DNA中的4種堿基各自的異構(gòu)體間都可以自發(fā)地相互變化（如烯醇式與酮式堿基間的互變），這種變化就會(huì)使堿基配對(duì)間的氫鍵改變，可使腺嘌呤能配上胞嘧啶、胸腺嘧啶能配上鳥(niǎo)嘌呤等，如果這些配對(duì)發(fā)生在DNA復(fù)制時(shí)，就會(huì)造成子代DNA序列與親代DNA不同的錯(cuò)誤性損傷；②堿基的脫氨基作用：堿基的環(huán)外氨基有時(shí)會(huì)自發(fā)脫落，從而胞嘧啶會(huì)變成尿嘧啶、腺嘌呤會(huì)變成次黃嘌呤（H）、鳥(niǎo)嘌呤會(huì)變成黃嘌呤（X）等，遇到復(fù)制時(shí)，U與A配對(duì)、H和X都與C配對(duì)就會(huì)導(dǎo)致子代DNA序列的錯(cuò)誤變化；③脫嘌呤與脫嘧啶：自發(fā)的水解可使嘌呤和嘧啶從DNA鏈的核糖磷酸骨架上脫落下來(lái)；④堿基修飾與鏈斷裂：細(xì)胞呼吸的副產(chǎn)物O^2－、H₂O₂等會(huì)造成DNA損傷，能產(chǎn)生胸腺嘧啶乙二醇、羥甲基尿嘧啶等堿基修飾物，還可能引起DNA單鏈斷裂等損傷。

（2）物理因素引起的損傷：DNA分子損傷最早就是從研究紫外線的效應(yīng)開(kāi)始的。當(dāng)DNA受到最易被其吸收波長(zhǎng)（260nm左右）的紫外線照射時(shí)，主要是使同一條DNA鏈上相鄰的嘧啶以共價(jià)鍵連成二聚體，相鄰的兩個(gè)T或兩個(gè)C，或C與T間都可以連成二聚體，其中最容易形成的是TT二聚體，從而影響DNA的復(fù)制。254nm紫外線還可引起DNA鏈的斷裂。

電離輻射損傷DNA有直接和間接的效應(yīng)，直接效應(yīng)是DNA直接吸收射線能量而遭損傷，間接效應(yīng)是指DNA周圍其他分子（主要是水分子）吸收射線能量產(chǎn)生具有很高反應(yīng)活性的自由基進(jìn)而損傷DNA。電離輻射可導(dǎo)致DNA分子的多種變化，包括DNA鏈上的堿基氧化修飾、過(guò)氧化物的形成、堿基環(huán)和脫氧核糖的破壞、DNA鏈斷裂、DNA鏈交聯(lián)和DNA－蛋白質(zhì)交聯(lián)等。

（3）化學(xué)因素引起的損傷：許多化學(xué)因素，包括烷化劑、堿基類似物、修飾劑和一些人工合成或環(huán)境中存在的化學(xué)物質(zhì)（例如亞硝酸鹽、羥胺、黃曲霉素等），這些都是誘發(fā)突變的化學(xué)物質(zhì)或致癌劑，使DNA堿基烷基化后錯(cuò)配或脫落斷裂。其中雙功能烷化劑如氮芥、硫芥等、一些抗癌藥物如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、絲裂霉素等、某些致癌物如二乙基亞硝胺等，其兩個(gè)功能基可同時(shí)使兩處烷基化，結(jié)果就能造成DNA鏈內(nèi)、DNA鏈間以及DNA與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)。而堿基類似物如溴尿嘧啶（5－BU）、氟尿嘧啶（5－FU）、2－氨基腺嘌呤（2－AP）等，由于其結(jié)構(gòu)與正常的堿基相似，進(jìn)入細(xì)胞能替代正常的堿基摻入到DNA鏈中而干擾DNA復(fù)制合成，例如5－BU結(jié)構(gòu)與胸腺嘧啶十分相近，在酮式結(jié)構(gòu)時(shí)與A配對(duì)，卻又更容易成為烯醇式結(jié)構(gòu)與G配對(duì)，在DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致A－T轉(zhuǎn)換為G－C。

2.DNA損傷、突變的類型及其意義　上述各種因素造成DNA損傷（DNA damage），引起基因突變（gene mutation）。歸納DNA損傷后分子最終的改變，有以下幾種類型：①點(diǎn)突變：指DNA上單一堿基的變異。嘌呤替代嘌呤（A與G之間的相互替代）、嘧啶替代嘧啶（C與T之間的替代）稱為轉(zhuǎn)換（transition）；嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤則稱為顛換（transvertion）。②缺失：指DNA鏈上一個(gè)或一段核苷酸的消失。③插入：指一個(gè)或一段核苷酸插入到DNA鏈中。在為蛋白質(zhì)編碼的序列中如缺失及插入的核苷酸數(shù)不是3的整倍數(shù)，則發(fā)生讀框移動(dòng)（reading frame shift），使其后所譯讀的氨基酸序列全部混亂，稱為移碼突變（frame－shift mutation）。④倒位或轉(zhuǎn)位：指DNA鏈重組使其中一段核苷酸鏈方向倒置，或從一處遷移到另一處。⑤雙鏈斷裂。

突變或誘變對(duì)生物可能產(chǎn)生3種后果：①喪失某些功能甚至致死性，是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)；②改變基因型而不改變表現(xiàn)型，形成了個(gè)體之間的多態(tài)性；③發(fā)生了有利于物種生存的結(jié)果，使生物進(jìn)化。

3.DNA損傷的修復(fù)　DNA修復(fù)（DNA repairing）是細(xì)胞對(duì)DNA受損傷后的一種反應(yīng)，這種反應(yīng)可能使DNA結(jié)構(gòu)恢復(fù)原樣，重新能執(zhí)行它原來(lái)的功能。但有時(shí)并非能完全消除DNA的損傷，只是使細(xì)胞能夠耐受這DNA的損傷而能繼續(xù)生存。對(duì)不同的DNA損傷，細(xì)胞可以有不同的修復(fù)反應(yīng)。

（1）光修復(fù)（light repair）：是最早發(fā)現(xiàn)的DNA修復(fù)方式。修復(fù)是由細(xì)菌中的DNA光復(fù)活酶（photolyase）完成，此酶能特異性識(shí)別紫外線造成的核酸鏈上相鄰嘧啶二聚體，并與其結(jié)合，在光激活下將二聚體分解為兩個(gè)正常的嘧啶單體，然后酶從DNA鏈上釋放，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)。已發(fā)現(xiàn)多種生物含有光復(fù)活酶，但未發(fā)現(xiàn)人類有此類酶。

（2）切除修復(fù)（excision repair）：是修復(fù)DNA損傷最為普遍的方式，對(duì)多種DNA損傷包括堿基脫落形成的無(wú)堿基位點(diǎn)、嘧啶二聚體、堿基烷基化、單鏈斷裂等都能起修復(fù)作用。這種修復(fù)方式普遍存在于各種生物細(xì)胞中，也是人體細(xì)胞主要的DNA修復(fù)機(jī)制。修復(fù)過(guò)程需要多種酶的一系列作用（如人體的切除修復(fù)需30多種因子的參與），首先由核酸酶識(shí)別DNA的損傷位點(diǎn)，在損傷部位的5′側(cè)切開(kāi)磷酸二酯鍵，由3′→5′核酸外切酶將有損傷的DNA片段切除。然后在DNA聚合酶的催化下，以完整的互補(bǔ)鏈為模板，按3′→5′方向合成DNA鏈，填補(bǔ)已切除的空隙。最后，由DNA連接酶將新合成的DNA片段與原來(lái)的DNA斷鏈連接起來(lái)。這樣完成的修復(fù)能使DNA恢復(fù)原來(lái)的結(jié)構(gòu)。切除修復(fù)包括堿基切除修復(fù)（base excision repair，BER）和核苷切除修復(fù)（nucleotide excision repair，NER）兩種形式。

（3）錯(cuò)配修復(fù)（mismacth repair，MMR）：是一種特殊的切除修復(fù)形式。DNA復(fù)制時(shí)出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配可有DNA聚合酶進(jìn)行糾正，該糾正機(jī)制被稱為首次糾正機(jī)制。但首次糾正機(jī)制不能保證修復(fù)所有的錯(cuò)配，部分錯(cuò)誤堿基可逃脫該糾正機(jī)制，遺留在DNA鏈上。遺留錯(cuò)誤堿基的糾正由錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)來(lái)完成。DNA錯(cuò)配修復(fù)基因首先在細(xì)菌和酵母中發(fā)現(xiàn)，隨后在用連鎖分析方法研究HNPCC家系易感基因的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)了人類的類似基因。涉及人類DNA錯(cuò)配修復(fù)的主要有6個(gè)蛋白質(zhì)，即hMSH2、hMSH3、hMSH6、hMLH1、hMLH3、hPMS1。堿基錯(cuò)配后，首先被兩種MutS同源蛋白異二聚體復(fù)合物MSH2/hMSH6（MutSα）和MSH2/MSH3（MutSβ）識(shí)別。其中MutSα識(shí)別并結(jié)合于堿基－堿基錯(cuò)配的位置，MutSβ識(shí)別并結(jié)合于較大片段插入/缺失錯(cuò)配的位置。錯(cuò)配堿基被識(shí)別后，MMR系統(tǒng)中另外的一種MutL同源蛋白異二聚體MLH1/PMS1就與已結(jié)合到錯(cuò)配堿基位置的MutSα或MutSβ相互作用形成一種暫時(shí)性的復(fù)合物，從而啟動(dòng)錯(cuò)配修復(fù)，并在系統(tǒng)其他協(xié)同蛋白，如hEXO1等的相互配合下切除含有錯(cuò)配堿基的一段DNA鏈，合成與母鏈完全匹配的新鏈，以代替被切除的DNA鏈片段，從而完成對(duì)含有錯(cuò)配堿基的DNA鏈的修復(fù)。

（4）重組修復(fù)（recombinational repair）：上述的切除修復(fù)在切除損傷段落后是以原來(lái)正確的互補(bǔ)鏈為模板來(lái)合成新的段落而做到修復(fù)的。但在某些情況下沒(méi)有互補(bǔ)鏈可以直接利用，例如在DNA復(fù)制進(jìn)行時(shí)發(fā)生DNA損傷，此時(shí)DNA兩條鏈已經(jīng)分開(kāi)，其修復(fù)可用以下的DNA重組方式：①受損傷的DNA鏈復(fù)制時(shí)，產(chǎn)生的子代DNA在損傷的對(duì)應(yīng)部位出現(xiàn)缺口；②完整的另一條母鏈DNA與有缺口的子鏈DNA進(jìn)行重組交換，將母鏈DNA上相應(yīng)的片段填補(bǔ)子鏈缺口處，而母鏈DNA出現(xiàn)缺口；③以另一條子鏈DNA為模板，經(jīng)DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填補(bǔ)母鏈DNA的缺口，最后由DNA連接酶連接，完成修補(bǔ)（圖2－7）。

重組修復(fù)不能完全去除損傷，損傷的DNA段落仍然保留在親代DNA鏈上，只是重組修復(fù)以后新合成的DNA分子是不帶有損傷的，但經(jīng)多次復(fù)制后，損傷就被“沖淡”了，在子代細(xì)胞中只有一個(gè)細(xì)胞是帶有損傷DNA的。

圖2－7　重組修復(fù)示意圖

（5）SOS修復(fù)：是指DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時(shí)所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式。此時(shí)，細(xì)胞的正常修復(fù)機(jī)制被抑制，損傷處的DNA鏈空缺，再由損傷誘導(dǎo)產(chǎn)生的一整套的特殊DNA聚合酶——SOS修復(fù)酶類，催化空缺部位DNA的合成。這時(shí)補(bǔ)上去的核苷酸幾乎是隨機(jī)的，不能保證序列的正確性，然而還是保持了DNA雙鏈的完整性，使細(xì)胞得以生存。但留下的錯(cuò)誤較多，故又稱為錯(cuò)誤傾向修復(fù)（error－prone repair），使細(xì)胞有較高的突變率。

應(yīng)該說(shuō)目前對(duì)真核細(xì)胞DNA修復(fù)的反應(yīng)類型、參與修復(fù)的酶類和修復(fù)機(jī)制了解還不多，但DNA損傷修復(fù)與細(xì)胞突變、壽命、衰老、腫瘤發(fā)生、輻射效應(yīng)、某些毒物的作用都有密切的關(guān)系。人類遺傳性疾病已發(fā)現(xiàn)4000多種，其中不少與DNA修復(fù)缺陷有關(guān)，這些DNA修復(fù)缺陷的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)輻射和致癌劑的敏感性增加。例如著色性干皮?。▁erodermappigmentosum，XP）、運(yùn)動(dòng)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥（ataxiatelangiectasia，AT）、遺傳性非息肉結(jié)腸癌（hereditarynon－polyposiscoloncancer，HN－PCC）和乳腺癌等均與DNA修復(fù)缺陷相關(guān)。