實(shí)訓(xùn)41　藥品無菌檢查

一、實(shí)訓(xùn)目的

（1）掌握用直接接種法進(jìn)行注射液或供注射用原料藥的無菌檢查的方法和程序。

（2）掌握無菌檢查法結(jié)果的判斷及檢驗(yàn)報(bào)告的書寫。

二、實(shí)訓(xùn)原理

無菌檢查法是用于確定要求無菌的藥品、醫(yī)療器具、原料、輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明了供試品在該檢驗(yàn)條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。

無菌檢查法包括直接接種法和薄膜過濾法。直接接種法適用于非抗菌作用的供試品；薄膜過濾法適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。本實(shí)訓(xùn)采用直接接種法。

無菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下和局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行，其全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止微生物污染。單向流空氣區(qū)、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》（GB／T　16292～16294—2010）的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。隔離系統(tǒng)按相關(guān)的要求進(jìn)行驗(yàn)證，其內(nèi)部環(huán)境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。

三、實(shí)訓(xùn)器材

1．設(shè)備

無菌室，超凈工作臺(tái)，高壓蒸汽滅菌鍋，生化培養(yǎng)箱，電爐，冰箱。

2．儀器與用具

燒杯，量筒，試管，吸管（1mL、2mL），漏斗，接種環(huán)，記號(hào)筆，小砂輪，酒精燈，玻璃棒，天平。

3．培養(yǎng)基與試劑

硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，改良馬丁氏培養(yǎng)基，NaCl，碘酒。

4．檢驗(yàn)樣品

注射用水。

四、實(shí)訓(xùn)步驟

（一）實(shí)訓(xùn)準(zhǔn)備

1．硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基（用于培養(yǎng)好氧菌、厭氧菌）250mL

依照硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基試劑瓶上說明方法配制。配制250mL，分裝于12支試管中，每支裝量20mL，包扎，置于121℃滅菌20min。

2．改良馬丁氏培養(yǎng)基（用于真菌培養(yǎng)）250mL

依照改良馬丁氏培養(yǎng)基試劑瓶上說明方法配制。配制250mL，分裝于11支試管中，每支裝量20mL，包扎，置于121℃滅菌20min。

3．0．9%無菌NaCl溶液

稱取NaCl　9．0g，加水溶解成1000mL，置于121℃滅菌20min。

4．其他

2mL吸管2支，1mL吸管1支，分別包扎，置于121℃滅菌20min。

（二）操作步驟

1．菌液制備

接種金黃色葡萄球菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，置于30～35℃培養(yǎng)18～24h，上述培養(yǎng)物用0．9%無菌NaCl溶液制成1mL含菌50～100CFU的菌懸液，用作陽性對(duì)照。

2．供試品的加入

取供試品11支，用碘酒棉球擦拭安瓿瓶外部，用小砂輪在安瓿瓶頸部劃一環(huán)行線，再用75%酒精棉球?qū)⒌饩撇羶?，打開安瓿瓶頸部，按表3－37中接種的要求用無菌吸管吸取供試品、陽性對(duì)照液分別接種于不同培養(yǎng)基（要求嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作），混勻。陰性對(duì)照為空白培養(yǎng)液，未加其他成分。

表3－37無菌檢查接種量

3．培養(yǎng)與觀察

將接種的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基置于30～35℃，接種的改良馬丁氏培養(yǎng)基置于23～28℃培養(yǎng)14天。培養(yǎng)期間應(yīng)逐日觀察并記錄是否有菌生長(zhǎng)。如在加入供試品后或在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基出現(xiàn)渾濁，培養(yǎng)14天后，不能從外觀上判斷有無微生物生長(zhǎng)，可取該培養(yǎng)液適量轉(zhuǎn)接種至同種新鮮培養(yǎng)基中或劃線于斜面培養(yǎng)基上，細(xì)菌培養(yǎng)48h，真菌培養(yǎng)72 h，觀察接種的同種新鮮培養(yǎng)基是否再出現(xiàn)渾濁或斜面培養(yǎng)基上是否有菌生長(zhǎng)；或取培養(yǎng)液涂片、染色、鏡檢，判斷是否有菌，記錄于表3－38中。

表3－38　無菌檢查培養(yǎng)觀察

五、結(jié)果記錄

若供試品管均澄清，或雖渾濁但經(jīng)確證無菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若供試品管中任何一管顯渾濁并確證有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定，除非能充分證明實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效，即生長(zhǎng)微生物非供試品所含有。

當(dāng)符合下列至少一個(gè)條件時(shí)，方可判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果無效：①實(shí)驗(yàn)設(shè)備及環(huán)境不符合要求；②回顧過程中，發(fā)現(xiàn)有可能引起微生物污染的因素；③陰性對(duì)照管有菌生長(zhǎng)；④供試品管中生長(zhǎng)的微生物經(jīng)鑒定后，確證是因無菌試驗(yàn)中所使用的物品或無菌操作不當(dāng)引起的；⑤陽性對(duì)照管無菌生長(zhǎng)。

試驗(yàn)若經(jīng)確認(rèn)無效，應(yīng)重做。重做時(shí)，重新取同量供試品，依法操作，若無菌生長(zhǎng)，判供試品符合規(guī)定；若有菌生長(zhǎng)，判供試品不符合規(guī)定。

結(jié)論：你所檢驗(yàn)的注射用水是否達(dá)到國(guó)家藥典規(guī)定的無菌標(biāo)準(zhǔn)？

六、思考題

（1）哪些藥品制劑需做無菌檢查，怎樣正確判斷結(jié)果？

（2）無菌檢查法為何要做陽性對(duì)照？若陽性對(duì)照管出現(xiàn)陰性結(jié)果是何原因？應(yīng)如何處理？