真菌的傳統(tǒng)分類鑒定是以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)的，但真菌種類多，形態(tài)學(xué)特征又極為復(fù)雜，鑒定技術(shù)的掌握需要很強(qiáng)的專業(yè)背景，這給真菌的分類鑒定帶來一定的難度。 隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展和真菌分類學(xué)自身發(fā)展的客觀要求，在真菌現(xiàn)代分類中引入了操作簡便、特異性好且準(zhǔn)確可靠的分子生物學(xué)技術(shù)鑒定方法。

真菌的核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)位于rDNA片段上，包含兩個不同的非編碼區(qū)域，即ITS1和ITS2。ITS序列在物種屬內(nèi)、近緣屬間及科內(nèi)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系研究中有一定的價值。 真菌核糖體基因由小的亞單元（18S）、ITS1區(qū)、5.8S區(qū)、ITS2區(qū)和大的亞單元（28S）構(gòu)成（圖10-1），頭尾串聯(lián)形成重復(fù)序列，個基因組內(nèi)有60~200個拷貝。真菌ITS區(qū)域長度一般為650~750bp。r DNA多復(fù)制的特性，有利于低濃度DNA樣品中ITS區(qū)域的擴(kuò)增。

圖10-1 ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增引物示意圖(仿Vilgalyslab)

在ITS應(yīng)用中，設(shè)計和選用引物非常重要。 特異引物ITS1（5’-TC-CGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）可用于大多數(shù)擔(dān)子菌和子囊菌的檢測，不過這些引物也能擴(kuò)增一些植物ITS區(qū)域。ITS1-F（5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’）和ITS4-B（5’-CAGGAGACTTGTACGGTCCAG-3’）是真菌和擔(dān)子菌的特異引物，能夠顯著提高特異性。 引物ITS1和ITS2（5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’）用于擴(kuò)增18Sr DNA和5.8Sr DNA之間的ITS1區(qū)，引物ITS3（5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’）和ITS4用于擴(kuò)增5.8Sr DNA和28S r DNA之間的ITS2區(qū)，其中引物ITS1和ITS4組合被大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采用，用于擴(kuò)增全部ITS區(qū)和5.8Sr DNA。

一、目的要求

了解利用ITS序列檢測與鑒定植物病原真菌的原理，掌握PCR擴(kuò)增真菌ITS的原理與基本操作技術(shù)。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

植物病原真菌菌株。

（二）實(shí)驗(yàn)試劑

CTAB、Tris飽和酚、苯酚、氯仿、異丙醇、PCRBuffer、d NTP、Taq酶、真菌ITS特異性引物、瓊脂糖、電泳緩沖液、DNA染液、異戊醇、醋酸鈉、無水乙醇等。

（三）儀器與用具

培養(yǎng)箱、超凈工作臺、電子天平、水浴鍋、微波爐、PCR儀、移液器、各種規(guī)格的Eppendorf管、PCR管、冰臺、電泳儀、電泳槽等。

三、內(nèi)容和方法

（一）真菌基因組DNA的提?。⊿DS-CTAB法）

1.取適量菌絲，加入少量石英砂，加液氮，研磨成粉末。

2.加入2%的CTAB750μL，1/10體積的10%的SDS，1/100體積的β-巰基乙醇，65℃水浴1h,12000r/min離心5min。

3.吸取上清液，加入等體積苯酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液，充分混合振蕩，12000r/min離心5min，再吸取上清液。

4.加入等體積氯仿，充分混合，12000r/min離心10min，取上清液。

5.加入1/10體積的醋酸鈉（3mol/L），再加入2倍體積的無水乙醇，-20℃沉淀（過夜）。

6.12000r/min離心8min，倒去上清液，倒扣在吸水紙上。

7.加入1m L70%的乙醇（清洗，去鹽），12000r/min離心8min,倒去上清液（2次）。

8.自然晾干（如管壁有液體，略微離心后用槍頭小心吸出）。

9.根據(jù)DNA量加入去離子水（50~200μL），室溫過夜溶解。

10.取3μL基因組DNA溶液電泳檢測質(zhì)量。

（二）真菌ITS片段的PCR擴(kuò)增

1.PCR擴(kuò)增體系

2.PCR擴(kuò)增條件

94℃預(yù)變性5min；94℃變性15s，50℃退火45s，72℃延伸45s，共34個循環(huán)；72℃延伸5min。

3.PCR產(chǎn)物電泳檢測

取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果。

（三）PCR擴(kuò)增片段的回收

目的片段的純化通過切膠回收實(shí)現(xiàn)。 切膠之前需要進(jìn)行PCR產(chǎn)物的檢測，確認(rèn)目的片段的位置，以免在切膠時切錯條帶。

將30μLPCR產(chǎn)物和6×Lodaing Buffer的混合液（比例為5∶1）點(diǎn)入瓊脂糖凝膠板中，電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)下用刀片切取目的條帶，放入2m L離心管中，用DNA凝膠回收試劑盒回收純化。

（四）DNA片段的測序

將回收的片段送至生物公司測序。

（五）序列比對

將測序結(jié)果在Gen Bank（http://www.ncbi.nlm.gov）中進(jìn)行Blast比對，序列分析后對病原菌進(jìn)行分類鑒定。

四、實(shí)驗(yàn)學(xué)時

3~6學(xué)時。

五、作業(yè)與思考題

1.將實(shí)驗(yàn)過程及結(jié)果寫成實(shí)驗(yàn)報告。

2.為了保證真菌基因組DNA的完整性，在吸取樣品、抽提過程中應(yīng)注意什么？

3.利用ITS序列鑒定真菌具有哪些優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)？