一、方法學(xué)簡介

定量測定的方法很多，中藥分析中常用的有分光光度法、薄層掃描法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。

（一）分光光度法（spectrophotometry）

分光光度法包括可見紫外分光光度法和紅外分光光度法兩種，其理論基礎(chǔ)是朗伯—比爾定律。對于中藥的各種有效成分或主成分，其本身有色，或與一定顯色試劑作用后可形成有色物質(zhì)，或在紫外或紅外區(qū)有吸收，而且在一定范圍內(nèi)，其溶液的吸收度與濃度的關(guān)系符合朗伯—比爾定律的，均可用此法分析。生物堿、醌類和黃酮類化合物常用此法，如石斛總生物堿的測定、黃柏中小檗堿的測定、決明子中蒽醌化合物和紫草中紫草素類化合物的測定、葛根中總黃酮的含量測定等（王強(qiáng)，1996）。

（二）薄層掃描法（TLCscanning）

1.測定原理

薄層掃描法（TLCscanning）又稱薄層光密度法（TLCden.sitometry），是在薄層色譜的基礎(chǔ)上，通過薄層掃描儀直接測定薄層板上色譜斑點(diǎn)的吸光度（透射光強(qiáng)度或反射光強(qiáng)度）的定量方法。它利用薄層掃描儀對薄層板上的斑點(diǎn)直接掃描，透射光或反射光被光電倍增管接受，放大并轉(zhuǎn)換為電信號后被記錄器記錄下來呈現(xiàn)出一個個峰。當(dāng)一定波長的光照射在薄層上無斑點(diǎn)的部位時，由于對光沒有吸收，記錄紙上畫出基線是平的；掃描至斑點(diǎn)部位時，由于斑點(diǎn)對光有了吸收，在記錄紙上呈現(xiàn)出一個峰。數(shù)據(jù)處理機(jī)會自動記錄峰面積（或峰高）的積分值。在一定濃度范圍內(nèi)，峰面積（或峰高）值與濃度呈線性關(guān)系，符合朗伯—比耳定律，以此可以計(jì)算出斑點(diǎn)中化合物的量。該方法簡便快速，測定結(jié)果較準(zhǔn)確、靈敏（可測定μg或ng級樣品）。

2.影響掃描測定結(jié)果的條件

用儀器對斑點(diǎn)直接進(jìn)行測量，尤其是近幾年采用的雙波長掃描儀減少了因薄層不均勻帶來的誤差，大大提高了薄層色譜定量的準(zhǔn)確度和自動化程度。但由于實(shí)驗(yàn)過程中許多因素，如點(diǎn)樣技術(shù)、薄層板質(zhì)量等都會直接影響掃描測定的結(jié)果，因此，薄層掃描中符合朗伯—比耳定律的濃度范圍一般較窄。

（1）吸附劑的性能和薄層板的質(zhì)量：吸附劑的大小、孔徑分布均勻性都會直接影響樣品分離度和檢測靈敏度，一般常用的硅膠直徑為10～40μm，另外鋪板技術(shù)及板的厚度也是影響測定結(jié)果的重要因素。鋪板均勻，分離效果好，重現(xiàn)性好，斑點(diǎn)整齊，有利于定量分析。藥典規(guī)定薄層厚度為0.1～0.3mm，若厚度太薄，則斑點(diǎn)容易發(fā)生擴(kuò)散，當(dāng)用透射法測定時，峰面積會偏?。挥梅瓷浞y定時，峰面積會偏大。薄層板暴露在空氣中，可導(dǎo)致pH值改變，水分增加，使性能變化?；罨蟮谋影鍛?yīng)保存在干燥器中，若放置時間較長，再用時應(yīng)先活化。為了使薄層色譜的重現(xiàn)性好，掃描結(jié)果穩(wěn)定可靠，薄層板制作規(guī)范化甚為重要。

（2）點(diǎn)樣方法：點(diǎn)樣要準(zhǔn)確，一般用微量注射器點(diǎn)樣，原點(diǎn)大小要控制一致，點(diǎn)樣量不宜過多。點(diǎn)樣方式則可根據(jù)樣品情況而定，有的點(diǎn)成圓點(diǎn)分離效果好，有的點(diǎn)成條狀分離效果較好。點(diǎn)樣量要固定，不宜多次重復(fù)點(diǎn)樣，否則原點(diǎn)樣品過濃，展開溶媒往往從原點(diǎn)的周圍通過，較難滲透內(nèi)部，會造成斑點(diǎn)形狀不規(guī)則。

（3）層析條件：展開劑最好為單一溶劑，若需用混合溶劑則配比要固定，這樣才能保證層析后斑點(diǎn)集中、規(guī)則、對稱、分離效果好。被測物的Rf值一般要求在0.25～0.75之間，因?yàn)橥瑯恿康臉悠氛咕嘣介L，斑點(diǎn)就越大，積分值就越大，直接影響測定結(jié)果，故應(yīng)特別注意。應(yīng)盡量防止邊緣效應(yīng)，由于邊緣效應(yīng)，會造成點(diǎn)在薄板中部的斑點(diǎn)比點(diǎn)在兩邊緣處的Rf值小，峰面積會有差異，因此應(yīng)盡可能使層析缸中展開劑蒸氣飽和。

（4）顯色方法：紫外區(qū)有吸收或可見光下有色的斑點(diǎn)無需顯色，若必需顯色，要求顯色后背景色很淺，背景與斑點(diǎn)顏色應(yīng)反差較大，斑點(diǎn)顏色的深度與樣品量成正比關(guān)系，重現(xiàn)性好；顯色劑霧滴應(yīng)小而分布均勻，且不宜噴量過多，并應(yīng)選擇最佳顯色時間及最佳放置時間；樣品與對照品應(yīng)在同一板上顯色。

（5）誤差來源：誤差來源于儀器本身誤差、儀器操作誤差以及異板誤差等，一般上述誤差可達(dá)5%左右（變異系數(shù)）。

（三）氣相色譜法（gaschromatography，GC）

1.基本原理

當(dāng)一種不與被分析物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的被稱為載氣流動相的永久性氣體（如H2、N2、He、Ar、CO2等）攜帶樣品中的若干組分，通過裝有固定相的色譜柱時，由于各組分分子與固定相分子間發(fā)生吸附或溶解或離子交換等物理化學(xué)過程，使那些性能結(jié)構(gòu)相近的組分由于各自的分子在兩相間反復(fù)多次分配發(fā)生很大的分離效果，從而使混合樣品中的各組分得到完全分離。

氣相色譜（GC）的優(yōu)點(diǎn)是快速、選擇性好、靈敏度高、分離效能高。

氣相色譜的主要缺點(diǎn)為受樣品蒸氣壓限制和鑒定較困難。

2.定量分析誤差

在氣相色譜中，誤差主要來自取樣、樣品在色譜儀里的吸附或分解、檢測器、記錄器等幾方面。

（1）取樣技術(shù)：誤差來源于兩個方面，一是取樣的代表性、準(zhǔn)確度與精度；二是所取樣品是否能確保真正進(jìn)入氣相色譜儀，即從取樣到樣品進(jìn)入氣相色譜儀這段時間內(nèi)，樣品是否發(fā)生分解、蒸發(fā)或發(fā)生某些化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生了變化。若在這其中樣品發(fā)生任何變化，都會直接影響峰面積。

（2）樣品的吸附或分解：有的化合物在分析過程中可能在進(jìn)樣口、色譜柱或檢測器里一部分被吸附或分解，這樣就使得注射進(jìn)去的樣品不能完全形成相應(yīng)的吸收峰，從而造成計(jì)算上的誤差。

（3）檢測器的性能：每一種檢測器對不同的化合物有不同的響應(yīng)，如操作條件變化則檢測器的響應(yīng)也要變化，在作校正曲線時應(yīng)予注意。

（4）記錄器：記錄器是一種機(jī)械電器裝置，和其他儀器一樣，也會產(chǎn)生系統(tǒng)誤差。使用時必須校正線性、量程、記錄筆速和電器零點(diǎn)，才能保證定量結(jié)果準(zhǔn)確。

3.計(jì)算方法

（1）外標(biāo)法（絕對檢量線法）：配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，在同一條件，同量注入色譜柱，測量其峰面積（或峰高），作出峰面積（或峰高）與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后同條件下，注入同量樣品，測量其峰面積（或峰高），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中該成分的濃度。此法簡單，但要進(jìn)樣量準(zhǔn)確，適用于氣樣分析。

（2）歸一法：測量每一個峰的面積，單個峰面積除以峰的總面積，就得到組分的百分?jǐn)?shù)A：

A＝（A的面積／總面積）×100%

這是一種簡便的定量方法，但要求樣品中所有組分都要產(chǎn)生色譜峰。

（3）內(nèi)標(biāo)法：準(zhǔn)確稱取樣品，加入一定量純物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，然后進(jìn)行氣相色譜分析，根據(jù)試樣和內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)量比和相應(yīng)的峰面積比，求出某組分的含量。

因?yàn)椋?/p>

W_i／W_s＝（f_i·A_i）／（f_s·A_s），Wi＝（W_s·f_i·A_i）／（f_s·A_s）

故： i＝W_i／W_m×100%＝［（W_s·f_i）·A_i／（W_m·f_s·A_s）］×100%

式中：W_s、W_m為內(nèi)標(biāo)物和樣品質(zhì)量；Wi為組分i的質(zhì)量。

此法要求選擇一個適宜的內(nèi)標(biāo)物，此內(nèi)標(biāo)物在樣品中不存在，與樣品各組分可完全分離；其峰與被測組分的峰靠近，而且內(nèi)標(biāo)物的量與被測組分的量接近。

（4）追加法：無適宜的內(nèi)標(biāo)物時，可取一定量的樣品作一色譜圖，再于同量樣品中準(zhǔn)確加入一定量待測組分的純品，再作一色譜圖。測量峰面積，兩次峰面積之差即為追加的純品峰面積，再按內(nèi)標(biāo)法同樣計(jì)算。

（四）高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatography，HPLC）

經(jīng)典色譜法及氣相色譜法雖然足以分析很多化學(xué)成分，但因?yàn)榛衔锞哂胁环€(wěn)定性及難揮發(fā)性，有效成分中大約只有20%適用于氣相色譜法（無需衍生化），其余80%的成分卻無法分析，尤其是一些組成復(fù)雜極性大的組分。因此，中藥分析需要更靈敏、更具有選擇性的方法。在這種情況下，引入了高效液相色譜法（HPLC），它是一液體為流動相的色譜。

1.基本原理

高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法。高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點(diǎn)作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn)；進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密；由于液體流動相黏度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。HPLC的基本組成相像GC，不同之處在于流動相是液體而非氣體。

2.檢測器類型

檢測器是液相色譜儀的三大關(guān)鍵部件之一。它的作用是將色譜柱中流出的樣品組分含量隨時間的變化連續(xù)地轉(zhuǎn)變成易于測量的電信號，以便在記錄儀上記錄下來，得到樣品組分分離的色譜圖。目前，液相色譜中使用最廣泛的檢測器是紫外檢測器，其次是示差折光檢測器。另外，近幾年發(fā)展起來的蒸發(fā)激光光散射檢測器也逐漸被廣泛地應(yīng)用于測定無紫外吸收的成分的含量。

（1）示差檢測器：示差檢測器是一種通用型檢測器，它是通過連續(xù)地測定流出液的折光指數(shù)變化來測定樣品濃度。由于它測定的是任何液體都存在的物理量，所以適用范圍很廣。但因?yàn)樗鼘θ軇┍旧硪灿许憫?yīng)，因此易受溫度變化、流量波動等因素的影響，產(chǎn)生較大的噪音和漂移，靈敏度低，不適用于痕量分析，并且不能用于梯度洗脫。

（2）紫外吸收檢測器：紫外吸收檢測器是一種選擇型檢測器，是高效液相色譜最廣泛使用的檢測器，幾乎所有的液相色譜裝置都配有紫外檢測器。它屬于溶質(zhì)性質(zhì)檢測器，只能用于檢測有紫外吸收的物質(zhì)，要選用無紫外吸收的溶劑。其工作原理基于朗伯—比耳定律。紫外檢測器結(jié)構(gòu)簡單，使用方便；靈敏度較高，可檢測納克級物質(zhì)；對流速和溫度的變化不敏感，適用于梯度洗脫；線性范圍寬，約105；不破壞樣品，可用于制備色譜。在各種檢測器中，其使用率占70%左右，對占物質(zhì)總數(shù)約80%的有紫外吸收的物質(zhì)均有響應(yīng)。

使用紫外檢測器時，溶劑不應(yīng)吸收測定波長的紫外光，樣品測定波長應(yīng)當(dāng)在溶劑紫外吸收波長上限以上，才能保證檢測靈敏度。當(dāng)溶劑含有吸收紫外光的雜質(zhì)時會使檢測背景提高，靈敏度降低；用作梯度洗脫時，會引起信號嚴(yán)重漂移。所以，必要時使用分光純?nèi)軇驅(qū)θ軇┻M(jìn)行專門的純化處理。

（3）蒸發(fā)激光光散射檢測器：這也是一種通用檢測器，其檢測基于以下原理：洗脫液由熱氣流使之熱氣化噴霧，再進(jìn)入加熱管，溶劑在此揮發(fā)，從而在載氣流中留下待分析檢測的物質(zhì)顆粒；這些顆粒通過一激光束，使光發(fā)生散射，散射光由光電倍增管收集檢測。其響應(yīng)的大小與通過檢測器的被分析質(zhì)粒的數(shù)量和大小有關(guān)（郭玉寧等，2000）。

影響光散射檢測器檢測性能的基本因素：

①漂移管溫度對基線噪音的影響：溫度對基線水平和噪音的影響并沒有明顯的規(guī)律。低于某一溫度時，流動相得不到充分的揮發(fā)，基線水平就較高，但并不是溫度越高越好，因?yàn)楦邷乜赡軙砀蟮脑胍?。最?yōu)溫度應(yīng)該是在流動相（包括其中所含的鹽）基本揮發(fā)的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生可接受噪音的最低溫度。

②氣體流速對響應(yīng)值的影響：氣體流速越大，漂移顆粒越小，散射光越弱，從而響應(yīng)值越小。最優(yōu)氣體流速應(yīng)是在可接受噪音的基礎(chǔ)上，產(chǎn)生最大響應(yīng)值的最低氣體流速。

③鹽對基線噪音的影響：絕大多數(shù)酸堿性化合物的檢測都需要緩沖液，緩沖液中鹽的揮發(fā)性與純度對基線影響較大，如磷酸鹽難以揮發(fā)，就會得到較高的基線水平和較大的基線漂移。

④響應(yīng)值與濃度的關(guān)系：響應(yīng)值與濃度的關(guān)系并不成簡單的線性關(guān)系，而是峰面積和峰高的自然對數(shù)分別與濃度的自然對數(shù)有較好的線性關(guān)系（馮埃生等，1996）。

由于蒸發(fā)光散射檢測器為質(zhì)量型通用檢測器，不受被檢測成分有無紫外吸收限制，所以已被廣泛應(yīng)用于一些無紫外吸收植物成分的檢測，如倍半萜內(nèi)酯（田南卉等，1997）、皂苷（ParkMK，1996；李會軍等，2000）、生物堿（朱丹妮等，2000）等。另外，蒸發(fā)光散射檢量測器也被成功地應(yīng)用于不揮發(fā)性成分，如糖類、脂類及表面活性劑的分析（馮埃生等，1996）。

3.定量分析誤差

液相色譜定量總是通過被測組分峰的峰高或峰面積的測量進(jìn)行的，故分析的準(zhǔn)確度和重復(fù)性受到影響峰面積的許多相關(guān)因素的影響。

（1）樣品的準(zhǔn)備：試樣是影響定量結(jié)果的重要因素之一。在樣品的準(zhǔn)備過程中，造成誤差的原因主要有：取樣不具代表性，配制樣品的溶劑選擇不合適，貯藏樣品不當(dāng)及樣品預(yù)處理不合理等。因此，首先取樣應(yīng)當(dāng)具有代表性，其次配制樣品的溶劑除了要能使樣品完全溶解，溶液透明外，還要與流動相互溶，不能與流動相和固定相發(fā)生反應(yīng)。一般分析溶液都具有揮發(fā)性，保存不當(dāng)則濃度會發(fā)生變化。最后試樣的預(yù)處理也相當(dāng)重要，有時要進(jìn)行化學(xué)衍生反應(yīng)。

（2）進(jìn)樣技術(shù)：進(jìn)樣引起的誤差主要是由于不能準(zhǔn)確地重復(fù)進(jìn)樣量和由于進(jìn)樣技術(shù)不佳而引起的峰擴(kuò)展。

（3）色譜分離：色譜柱和流動相的穩(wěn)定性皆能影響定量結(jié)果。在定量分析中，選用物理強(qiáng)度好、色譜性能穩(wěn)定的固定相是有利的。重要的是在校正和分析過程中，固定相、流動相和溶質(zhì)之間的平衡能嚴(yán)格一致。為此，常采用預(yù)柱保護(hù)色譜柱。流動相流速或組成的變化總要使洗脫峰的面積或高度發(fā)生變化，從而影響分析結(jié)果。精確的定量分析要求嚴(yán)格控制流動相的流量和組成。

（4）檢測器的特性：首先應(yīng)根據(jù)待測組分的性質(zhì)選擇合適的檢測器，另外，進(jìn)樣量決不可以超出所用檢測器的線性范圍。

（5）分離度：分離度大小直接影響峰高和峰面積測量的準(zhǔn)確度。

4.計(jì)算方法

氣相色譜的定量計(jì)算方法一般認(rèn)為都可用于高效液相色譜，常用的方法有：外標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法、內(nèi)部歸一化法及內(nèi)加法。