四、環(huán)境樣品微生物活性的測(cè)定

在環(huán)境微生物研究中已發(fā)展出許多原位活性測(cè)定方法，但在實(shí)驗(yàn)室測(cè)定環(huán)境樣品的微生物活性仍然是監(jiān)測(cè)微生物在實(shí)際生態(tài)環(huán)境中活性的重要方法。微生物活性測(cè)定可用來(lái)估計(jì)基本的微生物群實(shí)際的或潛在的微生物活性水平，以及自然和人為可變參數(shù)的對(duì)其活性的影響。微生物活性被廣泛用于評(píng)價(jià)生態(tài)系統(tǒng)的健康程度，評(píng)估微生物過(guò)程(如污水處理、堆肥等過(guò)程)的反應(yīng)速率。

現(xiàn)代微生物學(xué)的特征是純培養(yǎng)，純培養(yǎng)的活性測(cè)定使我們能測(cè)出在給定條件下微生物所能達(dá)到的最高活性水平，而環(huán)境樣品的活性測(cè)定是純培養(yǎng)測(cè)定的進(jìn)一步發(fā)展。二種類型的活性測(cè)定從本質(zhì)上是一致的，但又有差異。在不同條件下二種活性測(cè)定都在環(huán)境微生物研究中得到廣泛的應(yīng)用。

圖15-3　亞硝酸鹽氧化菌的分離程序

1.純培養(yǎng)微生物活性測(cè)定

純培養(yǎng)微生物的活性實(shí)際上是生長(zhǎng)過(guò)程活性程度的表征。一般生理上的好氧微生物的生長(zhǎng)過(guò)程可表達(dá)為:

基質(zhì)+氮+磷+→─末端電子受體細(xì)胞質(zhì)量+CO₂+水

從這個(gè)方程中可以看出，測(cè)定微生物活性有幾種方法，包括基質(zhì)消減、末端電子受體利用、生物量產(chǎn)生和CO₂釋放。

基質(zhì)消減(substrate disappearance):是測(cè)定微生物所利用基質(zhì)消減的程度，對(duì)異養(yǎng)活性主要測(cè)定碳基質(zhì)，如測(cè)定芳香族化合物的消減可以說(shuō)明特定菌株降解這種化合物的活性;對(duì)化能自養(yǎng)活性則是測(cè)定作用基質(zhì)，如氨氧化成亞硝酸和硝酸鹽的硝化作用則通過(guò)測(cè)定氨氮和亞硝態(tài)氨的消減來(lái)驗(yàn)證。

末端電子受體(terminal electron acceptors，TEA)利用:各種末端電子受體都可被微生物有效利用，微生物活性水平可反映在TEA消減及還原性TEA的產(chǎn)生上。測(cè)定體系中氧的消耗是最常用的指示活性的方法，廣泛使用的BOD測(cè)定就是建立在O₂的消耗測(cè)定上。

細(xì)胞生物量(cell mass)增加:細(xì)胞生物量的增加是微生物生長(zhǎng)活性的直接指標(biāo)。純培養(yǎng)中細(xì)胞生物量增加的計(jì)數(shù)方法有直接的顯微鏡計(jì)數(shù)、間接的平板計(jì)數(shù)以及測(cè)定培養(yǎng)物的渾濁度或蛋白質(zhì)含量。通過(guò)測(cè)定細(xì)胞懸浮液的渾濁度，可以快速測(cè)定細(xì)胞量，一般用比色法或分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定渾濁度。蛋白質(zhì)含量和細(xì)胞生物量成正相關(guān)，測(cè)定蛋白質(zhì)含量可以推算細(xì)胞生物量。

CO₂的釋放(carbon dioxide evolution):CO₂釋放可以用于好氧和厭氧礦化作用的測(cè)定。堿性吸收劑(通常是NaOH或另一種強(qiáng)堿性溶液)可以用來(lái)吸收礦化過(guò)程產(chǎn)生的CO₂。堿溶液吸收CO₂后將其轉(zhuǎn)化成HCO－3，然后用滴定法測(cè)定。利用14C標(biāo)記的基質(zhì)，測(cè)定釋放的¹⁴CO₂是最科學(xué)的方法，因?yàn)檫@時(shí)產(chǎn)生的14CO₂是源于實(shí)際加入的有機(jī)碳化物。

2.環(huán)境樣品微生物活性的測(cè)定

環(huán)境樣品的活性測(cè)定不同于純培養(yǎng)，其更加集中在代謝活性的定量上，如呼吸作用或細(xì)胞大分子的合成，這些測(cè)定更加直接地反映樣品的代謝活性水平。環(huán)境樣品活性的測(cè)定方法可分為四種不同的類型:①碳呼吸;②放射性標(biāo)記物摻入細(xì)胞大分子;③腺苷能荷(AEC);④酶活性分析。

(1)碳呼吸

碳呼吸(carbon respiration)是指微生物在好氧、厭氧條件下利用有機(jī)碳基質(zhì)作為碳源和能源的過(guò)程。環(huán)境樣品中的這種微生物活性可以通過(guò)測(cè)定TEA消耗量或CO₂釋放量來(lái)檢測(cè)。碳呼吸過(guò)程中形成的生物量會(huì)因不同種類的微生物、不同的利用基質(zhì)、不同的環(huán)境條件而有不同，實(shí)際上微生物活性的絕對(duì)值不能確定，但測(cè)定呼吸氣體的流量可以提供微生物活性的相對(duì)水平。

1)實(shí)驗(yàn)室和野外研究中呼吸作用氣體(CO₂和O₂)的測(cè)定。許多純培養(yǎng)條件下使用的測(cè)定CO₂和TEA的方法也適用于環(huán)境樣品。土壤或地下物質(zhì)中微生物活性測(cè)定可以在實(shí)驗(yàn)室受控條件或原位(野外)條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室研究多采用微宇宙(microcosm)方法，微宇宙實(shí)際上是一個(gè)模擬野外條件的微生境。野外原位研究一般是建立一個(gè)野外室(field chamber)，用這個(gè)裝置進(jìn)行原位測(cè)定。一般來(lái)說(shuō)原位研究可以得到比微宇宙更可靠的測(cè)定結(jié)果。

水環(huán)境中微生物活性也可以以氧的消耗來(lái)說(shuō)明，但要考慮水體中的營(yíng)養(yǎng)物水平、光合作用生物的影響以及各類生物之間相互作用的影響。一般測(cè)定工作在短時(shí)間內(nèi)完成，同時(shí)對(duì)結(jié)果的解釋也要謹(jǐn)慎。

2)呼吸測(cè)定在環(huán)境微生物學(xué)中的應(yīng)用。呼吸測(cè)定在環(huán)境微生物學(xué)中的主要應(yīng)用包括土壤樣品中微生物活性的基礎(chǔ)速率、基質(zhì)誘導(dǎo)的微生物活性、微生物生物量、生化需氧量等方面的測(cè)定。測(cè)定土壤樣品中微生物活性的基礎(chǔ)速率可以預(yù)示特定位點(diǎn)通過(guò)呼吸作用顯示出的微生物活性。此外還可以作為土壤健康的指示物。測(cè)定基質(zhì)誘導(dǎo)的微生物活性可以評(píng)估有機(jī)污染物(如石油烴)對(duì)微生物群體的影響，例如在受石油烴污染的現(xiàn)場(chǎng)，我們預(yù)計(jì)微生物會(huì)利用這些烴作為一種碳源。這種利用可以通過(guò)原位呼吸相對(duì)于土著微生物群體呼吸所增加的尺度來(lái)測(cè)定。微生物生物量可以指示土壤條件和微生物潛力。以碳呼吸為基礎(chǔ)的測(cè)定微生物生物量的方法有二種，其一是以生物量作為有機(jī)碳基質(zhì)的氯仿熏蒸-培養(yǎng)法，即先以氯仿殺死樣品中的微生物，再接種微生物利用這部分有機(jī)碳，礦化產(chǎn)生的CO₂即為生物量的量值。計(jì)算公式為:

式中，生物量(C)為被綜合到微生物生物量中的C量;Fc為熏蒸樣品產(chǎn)生的CO₂; UFc為未熏蒸樣品產(chǎn)生的CO₂，Kc為生物量C礦化為CO₂的比例。文獻(xiàn)中Kc值范圍為0.41～0.45。其二是基質(zhì)誘導(dǎo)呼吸法(substrate-induced respiration method)。把容易分解的有機(jī)碳源葡萄糖加到土壤中，這樣土壤中所有的微生物的活性都被激發(fā)出來(lái)，通過(guò)測(cè)定最初的呼吸反應(yīng)來(lái)測(cè)定活的、非休眠異養(yǎng)細(xì)胞所含有的C量。培養(yǎng)時(shí)間限制在幾小時(shí)以內(nèi)，最低的和通常最初的葡萄糖呼吸速率被用作土壤樣品中出現(xiàn)的微生物生物量的指示物。生化需氧量(BOD)是表征有機(jī)碳化物含量的重要指標(biāo)，這也被稱為BOD物質(zhì)。BOD的測(cè)定也是碳呼吸測(cè)定的明顯應(yīng)用例證。

呼吸測(cè)定還可指示生態(tài)系統(tǒng)中不同微生境的代謝狀態(tài)。例如用微電極可以測(cè)定生物膜表面和內(nèi)部的呼吸情況。可以發(fā)現(xiàn)生物膜的較上層中的大量細(xì)菌對(duì)氧的快速利用造成了其較深層中的厭氧環(huán)境，這樣就支持了NO^－

3的厭氧呼吸。

3)厭氧呼吸指示的微生物活性。厭氧呼吸也可以指示厭氧微生物在厭氧條件下的微生物活性。厭氧呼吸包括以NO^-₃、Fe³⁺(和其他金屬)、SO^－

4和CO₂作為末端電子受體。對(duì)于這些受體中的某些物質(zhì)來(lái)說(shuō)，形成的氣態(tài)的中間或最終產(chǎn)物，可以用來(lái)測(cè)定厭氧呼吸。例如N₂O是細(xì)菌轉(zhuǎn)化NO^－

3到N₂(反硝化作用)的中間產(chǎn)物。乙炔常常用于抑制NO^－

3的完全反硝化，而導(dǎo)致N₂O積累。樣品中用乙炔處理而產(chǎn)生的N₂O與反硝化率成比例。

(2)放射性標(biāo)記示蹤物摻入細(xì)胞大分子

許多異養(yǎng)細(xì)菌可以從環(huán)境中吸收已形成的分子(如核苷酸或氨基酸)合成生物大分子。這種生物大分子的生物合成是微生物生長(zhǎng)活性的重要指示物。監(jiān)測(cè)放射性核苷酸或氨基酸摻入主要細(xì)胞大分子的速率是測(cè)定微生物活性的一種方法。被用作示蹤劑的特殊分子的例子是胸腺嘧啶核苷酸和氨基酸的亮氨酸，前者用³H標(biāo)記，被摻入到DNA中，后者用氚或¹⁴C標(biāo)記，其摻入到蛋白質(zhì)。

胸腺嘧啶摻入DNA速率的測(cè)定方法一般是將〔³H〕胸腺嘧啶加入到含有浮游細(xì)菌的水樣或者水與土壤或沉積物相混合而形成的泥漿中。培養(yǎng)時(shí)間通常限制在幾個(gè)小時(shí)，標(biāo)記胸腺嘧啶向細(xì)胞的摻入過(guò)程用加入的化學(xué)抑制劑或被置于冰浴中來(lái)中止反應(yīng)。然后，DNA從細(xì)胞中被提取出來(lái)，并經(jīng)放射活性計(jì)數(shù)來(lái)確定已經(jīng)摻入的標(biāo)記物的數(shù)量，從而可以計(jì)算出摻入率，摻入率再經(jīng)轉(zhuǎn)換成微生物活性。

亮氨酸摻入蛋白質(zhì)測(cè)定微生物活性可以應(yīng)用同樣的方法，大多數(shù)細(xì)菌從周圍環(huán)境中吸收亮氨酸且大部分同化的放射性活性標(biāo)記物將被摻入到蛋白質(zhì)中。

(3)腺苷酸能荷

ATP是細(xì)胞中能量?jī)?chǔ)存和轉(zhuǎn)化的一種方式。ATP含量變化取決于細(xì)胞的活性水平，快速生長(zhǎng)的細(xì)胞有著比受壓迫細(xì)胞更高的ATP含量。從測(cè)定微生物活性的角度，ATP相對(duì)于其前體ADP和AMP的相對(duì)豐富度可以說(shuō)明高能態(tài)(ATP)能否快速形成。ATP/ADP/AMP的比值可以提供估測(cè)微生物生物體生理狀況、營(yíng)養(yǎng)狀況的生化基礎(chǔ)。腺苷酸能荷(adenylate energy charge，AEC)比值測(cè)定的是細(xì)胞腺苷酸的重量比:

高AEC值(＞0.8)反映一個(gè)活躍群落，中間值(0.4～0.8)反映細(xì)胞的休眠狀態(tài)，低值(＜0.4)反映死亡或垂死細(xì)胞的比率大。AEC已被用于描述土壤和地下環(huán)境中微生物的活性。此外，對(duì)于特定土壤條件下的土壤樣品，ATP與細(xì)胞生物量之間存在一個(gè)恒定的關(guān)系?？傁佘账?ATP、ADP、AMP)的檢測(cè)可以提供一個(gè)更好的微生物生物量的指示物。

(4)酶分析

微生物的一切生理生化過(guò)程都離不開(kāi)酶，監(jiān)測(cè)催化反應(yīng)過(guò)程中的酶活性是監(jiān)測(cè)微生物活性的重要基礎(chǔ)。已發(fā)展出一種多酶分析方法(表15-4)，前面幾種測(cè)定的是一般的微生物活性，后面幾種用于特定的活性測(cè)定。最常用的是脫氫酶分析(dehydrogenase assay)、酯酶分析。

表15-4　　用于測(cè)定微生物活性的一般和特殊酶分析

引自微生物生態(tài)學(xué):基礎(chǔ)與應(yīng)用(第三版)。

脫氫酶是胞內(nèi)酶，能催化有機(jī)化合物呼吸作用所需要的氧化-還原反應(yīng)。因?yàn)槊摎涿柑幵诎鈺r(shí)就失去活性，所以這種分析被認(rèn)為是微生物活性的一種測(cè)定法。脫氫酶反應(yīng)可以用水溶性幾乎無(wú)色的四唑鹽來(lái)檢測(cè)。反應(yīng)體系中鹽被還原形成微紅色甲替(formazan)產(chǎn)物，這種產(chǎn)物可被萃取測(cè)定。

酯酶分析也能反映環(huán)境樣品中一般或總的微生物活性。這種分析是以熒光素乙二酸酯(FDA)的水解為基礎(chǔ)的。FDA能被多種酶水解，包括酯酶、蛋白酶和脂肪酶。水解產(chǎn)物高熒光分子熒光素可溶于水并可用熒光計(jì)或分光光度計(jì)檢測(cè)。一般在緩沖溶液中用FDA培養(yǎng)環(huán)境樣品幾分鐘到幾小時(shí)，離心收集上清液，定量測(cè)定產(chǎn)生的熒光素，從而可以評(píng)估微生物的活性。此外FDA水解產(chǎn)物與生物量測(cè)定也有很好的相關(guān)性，因而可以說(shuō)明微生物的生物量。

環(huán)境樣品微生物活性的測(cè)定是一個(gè)十分復(fù)雜的問(wèn)題，研究者要根據(jù)不同的研究目標(biāo)與目的選擇最合適的方法(表15-5)。

表15-5　　測(cè)定環(huán)境樣品微生物活性的幾種常用方法

續(xù)表

注:這個(gè)表意味著強(qiáng)調(diào)了這些技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，但是還不全面。