一、環(huán)境樣品采集和處理

環(huán)境樣品的采集和處理是研究環(huán)境微生物的開始。要從研究目的、環(huán)境條件、采樣條件的實(shí)際出發(fā)，制定可行科學(xué)的采樣方法，其中最基本的原則是使樣品具有代表性，通過對樣品的分析能說明所研究生境(或環(huán)境)的環(huán)境微生物數(shù)量、結(jié)構(gòu)、活性等參數(shù)，為環(huán)境微生物的研究提供科學(xué)、可靠的資料和數(shù)據(jù)。

1.土壤和沉積物

土壤是一種不連續(xù)、異質(zhì)的環(huán)境，含有大量不同的生物體。微生物的數(shù)量及活性因土壤的深度和類型而發(fā)生很大的變化，甚至在同一地點(diǎn)因?yàn)樘烊晃h(huán)境的不同而存在完全不同的微生物。由于群體間巨大的差異，為得到某地有代表性的微生物分析，多點(diǎn)采樣往往是非常必要的。因此，總體采樣方案將取決于許多因素，包括分析目的、可用資源以及采樣地點(diǎn)狀態(tài)。最精確的方法是在一個指定地點(diǎn)內(nèi)采取多個樣品，然后對每個樣品進(jìn)行單獨(dú)分析。然而，在許多情況下，將采集的不同樣品混合成一個復(fù)合樣品，以減少分析工作量。另一種方法是在同一地點(diǎn)的一段時間內(nèi)連續(xù)采樣而后進(jìn)行分析。為了保證采樣的質(zhì)量，采樣策略、采樣方法和樣品保藏最為重要。采樣策略包括:樣品的數(shù)量和類型、位置、深度、時間、間隔;采樣方法:采用專一的技術(shù)和設(shè)備;樣品保藏包括:容量的類型、保存方法、最長保存時間。

(1)表土采樣技術(shù)及方法

采集表土樣品可用鏟子，但使用土樣掘鑿鉆可能更好，因?yàn)槭褂煤笳吒_，能保證采樣的深度相同，深度在土壤樣中特別重要，氧氣、濕度、有機(jī)碳含量和土溫受到深度的強(qiáng)烈影響。采樣過程中還要防止污染(為分析微生物的采樣)，盡可能保持采樣器清潔，或用無菌刀將土樣芯的外層刮掉，而只用內(nèi)芯進(jìn)行分析。

土壤的異質(zhì)性以及采樣鉆的有限直徑，所以采得的樣品并不一定真正代表該采樣點(diǎn)。因此可以采集幾個樣品并混合一個復(fù)合樣品，以便減少樣品總量及相關(guān)的分析費(fèi)用。要獲得復(fù)合樣品，一般先是大面積采樣，隨后從每個樣品中稱取等量土樣，并將它們放進(jìn)桶或塑料包里。然后進(jìn)行混合，這樣就得到了復(fù)合樣品。為了減小樣品的體積以便于儲藏，可以去掉一部分復(fù)合樣品，從而得到可供分析的樣品。在所有情況下，在處理和分析前，樣品都應(yīng)該冷凍保存。

在采樣點(diǎn)的設(shè)置上有時設(shè)定一系列實(shí)驗(yàn)樣方，例如測試土壤改良(如肥料、殺蟲劑或污泥)對微生物群體的影響。在這種情況下，土樣必須從每個不同的樣方中采集，以便將未處理的樣方同已改良的樣品進(jìn)行對比。

采樣點(diǎn)設(shè)置方案有二維采樣模型，這種模型包括隨機(jī)采樣、橫切采樣、兩級采樣及方格采樣。在考慮采樣深度時，需采用三維采樣。

(2)地下采樣技術(shù)與方法

地下采樣一般需要特殊的裝置和技術(shù)，并有一系列嚴(yán)密的操作過程，保證所取樣品具有代表性。

對于未飽和系統(tǒng)，可用空氣旋轉(zhuǎn)鉆取樣，取樣深度可達(dá)幾百米。在該裝置中，用一個大的壓縮機(jī)將空氣向下壓入一根鉆管，推動鉆管下鉆，空氣從鉆頭逸出，將鉆渣吹出洞口，同時也冷卻芯筒。冷卻非常重要，如果鉆探管過熱，樣品中的微生物就會因過熱死亡，給后續(xù)的微生物分析帶來困難。

飽和地下環(huán)境采樣的情況稍有不同，這是因?yàn)槌练e物的黏著性比未飽和土樣小得多。因此，鉆孔口必須保持開啟以便在每個想要的深度都能取到完整的土樣。在這種采樣中，廣泛使用的是一種帶采樣推管的中空采掘鉆。

(3)樣品的處理與保存

樣品一旦離開原來的位置就會發(fā)生變化，因此對樣品的微生物及其他方面的分析要盡快進(jìn)行，以盡可能降低離體分析所帶來的影響。

表層土樣進(jìn)行微生物分析的第一步通常是用一個2mm規(guī)格的篩子除掉石子和碎片，此前通常樣品要被風(fēng)干，以利于篩分，但需保證土壤水分含量不要太低，以防微生物群體的減少。過篩之后，應(yīng)該將樣品在4℃下短期保存以待分析。

地下樣品處理必須十分小心，其原因有3個:①它們只有較少的數(shù)量，這樣外界的微生物污染就會顯著影響其計數(shù);②地下沉積物通常不與大氣接觸，大氣中的微生物污染可能會從本質(zhì)上影響樣品中檢出微生物的類型;③地下土樣的采集耗費(fèi)比地表高得多，而且一般不會有第二次采集的機(jī)會。一般地下樣品應(yīng)盡量立即整體冰凍并送實(shí)驗(yàn)室，也可就地處理。

2.水樣

(1)采集水樣的技術(shù)及方法

環(huán)境水樣的采集和后續(xù)的分析都較土壤樣品容易一些。主要原因在于水樣比土樣均一，減少了兩個相鄰樣品的差異;從不同地點(diǎn)采集不同體積(1～1000ml或更多)較易;易于采得一系列大量的水樣。水樣采集一般用采樣器采集。

(2)病毒分析水樣的采集與處理

由于病毒數(shù)量少，存在的種類多，水樣中病毒的檢測和分析通常很困難。病毒分析包括四個基本步驟:樣品采集、洗脫、重新濃縮和病毒檢測。

①樣品采集:包括飲用水、地下水、地表淡水、海水和污水等多樣水體都涉及病毒分析，水體中病毒數(shù)量少，因此都要經(jīng)濃縮，而水在物理-化學(xué)組成上差異極大，并會有溶解或懸浮于溶液中的多種物質(zhì)，這些物質(zhì)可能干擾濃縮。具體濃縮方法依賴于水樣可能的病毒密度、水樣濃縮方法的體積限制以及干擾物質(zhì)的存在。從水中濃縮病毒所采用的不同方法如表15-1。

表15-1　　濃縮水中病毒的方法

②樣品洗脫與再濃縮:一般采用加壓使小體積的洗脫液(1～2L)通過濾器從濾器表面洗脫被吸附的病毒。洗脫液一般是偏堿性的蛋白質(zhì)溶液，如pH值為9.5的1.5%牛肉提取液。pH值的增加提高了病毒和濾器表面的電負(fù)性，使病毒從濾器上解吸下來。洗脫液體積一般過大(1～2L)，不適于進(jìn)行分析，因此一般要再濃縮(第二次濃縮)，使體積減少到20～30ml。再濃縮的方法一般采用絮凝再離心的方法。

③病毒檢測:不同樣品按不同的目的，不同方法檢測(見后面)。

(3)檢測細(xì)菌水樣的采集與處理

檢測細(xì)菌水樣的采集與處理比較簡單，按一般取水樣的方法和處理即可。一般情況下，細(xì)菌可通過兩種不同處理過程中的一種來收集:膜過濾和最大概率數(shù)(MPN)法。膜過濾通過過濾收集和濃縮細(xì)菌。在MPN法中，分析前一般不處理樣品，在兩種方法中，都是通過培養(yǎng)來檢測細(xì)菌。