（一）NO/cGMP通路活化過程

前面已對NO/cGMP通路分別對血管紋、支持細(xì)胞以及傳入、傳出神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)進(jìn)行了描寫，本節(jié)總結(jié)歸納NO/cGMP通路的關(guān)鍵酶在耳蝸內(nèi)表達(dá)及活化過程。此通路的關(guān)鍵酶均定位于耳蝸。分布于耳蝸的一氧化氮合酶（NO synthases，NOS）的亞型是神經(jīng)元性一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）和血管內(nèi)皮性一氧化氮合酶（eNOS）。其中nNOS定位于內(nèi)外毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及支配內(nèi)外毛細(xì)胞的神經(jīng)纖維；eNOS則主要定位于螺旋韌帶血管的內(nèi)皮細(xì)胞、血管紋血管的內(nèi)皮細(xì)胞上。sGC和cGK－1在螺旋韌帶血管和血管紋血管的外皮細(xì)胞、Corti器的支持細(xì)胞（Hensen細(xì)胞、Deiters細(xì)胞）螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及傳出傳入神經(jīng)纖維上表達(dá)。

在NO/cGMP系統(tǒng)中有3個關(guān)鍵酶：一氧化氮合酶（NOS）、可溶性環(huán)磷酸鳥苷合酶（sGC）和環(huán)磷酸鳥苷依賴性蛋白激酶－1 （cGK－1）。NO/cGMP通路的活化過程是：當(dāng)外界信息分子與其特異受體結(jié)合，引起Ca2＋內(nèi)流時，由Ca2＋/CaM激活NOS，NOS在黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD），黃素腺嘌呤單核苷酸（FMN）四氫生物蝶呤（BH4）及還原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸（NADPH）等轉(zhuǎn)氫、轉(zhuǎn)電子體的協(xié)同作用下，以L－精氨酸為底物合成NO，NO作為一種氣體分子可自由通過細(xì)胞膜，其作用范圍只與其衰變時間有關(guān)。NO通過自由擴(kuò)散方式透過細(xì)胞膜后，與周圍細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的sGC結(jié)合并激活之，活化后的sGC以三磷酸鳥苷（GTP）為底物合成cGMP，后者與cGK－1結(jié)合。被激活的cGK－1通過磷酸化過程調(diào)節(jié)細(xì)胞功能（圖13－1）。

圖13－1　NO/cGMP通路作用過程

NOS有3個亞型，即神經(jīng)元性一氧化氮合酶（nNOS）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和血管內(nèi)皮性一氧化氮合酶（eNOS）。此3個亞型的NOS由于分布的不同，而對機(jī)體功能產(chǎn)生不同的調(diào)節(jié)作用。其中，nNOS主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，由其產(chǎn)生的NO參與神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和神經(jīng)信號的傳遞；iNOS則主要分布于肥大細(xì)胞等免疫細(xì)胞中，所產(chǎn)生的NO是作為強(qiáng)氧化劑來殺滅微生物；而eNOS主要在循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮作用，它與擴(kuò)張血管的激素受體共同表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞。當(dāng)擴(kuò)張血管的激素與其受體結(jié)合時，引起的Ca2＋內(nèi)流可激活eNOS，由此產(chǎn)生的NO可以擴(kuò)張血管，增加血流量，當(dāng)由sGC合成的cGMP發(fā)揮生理功能后，可被cGMP特異的磷酸二酯酶催化水解，此磷酸二酯酶是Ca2＋/CaM依賴性的。當(dāng)Ca2＋濃度增加時，既可促進(jìn)sGC合成cGMP，又可加強(qiáng)磷酸二酯酶降解cGMP。由此可見，Ca2＋在NO/cGMP通路的信息傳遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它一方面激活NOS產(chǎn)生NO，進(jìn)而增加cGMP的含量；另一方面又同時激活Ca2＋/CaM依賴性的磷酸二酯酶，而下調(diào)NO引發(fā)的胞內(nèi)cGMP增高。

（二）精氨酸對Ca2＋－ATP酶抑制劑的拮抗作用

我們曾采用全耳蝸灌流術(shù)，灌流Ca2＋－ATP酶抑制劑，使CAP閾移26dB，然后在灌流Ca2＋－ATP酶抑制劑的同時加入L－精氨酸，發(fā)現(xiàn)CAP閾移減小了10dB，可見精氨酸通過NO/cGMP通路可部分拮抗Ca2＋－ATP酶抑制劑的作用。

Ca2＋－ATP酶是細(xì)胞排出Ca2＋的重要方式，是維持胞內(nèi)Ca2＋平衡的Ca2＋泵，且廣泛分布于血管紋血管壁的細(xì)胞上，通過抑制Ca2＋－ATP酶的功能將導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2＋快速升高，從而造成內(nèi)、外毛細(xì)胞能量供應(yīng)減少，使內(nèi)、外毛細(xì)胞因能量缺乏而不能維持正常的細(xì)胞內(nèi)外離子平衡，必將引起CM幅度下降、CAP閾值提高。另外，因EP的正常值反映內(nèi)淋巴高K＋的狀態(tài)，當(dāng)血液供應(yīng)減少時，維持正常EP值的血管紋Na＋－K＋－ATP酶由于能量供應(yīng)缺乏，使其排K＋功能下降，進(jìn)而引起EP下降。由于EP的變化引起CM、CAP內(nèi)環(huán)境的變化，故必引起CM幅度下降、CAP閾值提高。

當(dāng)加入NO的底物——L－精氨酸以激活NO/cGMP通路，由位于血管紋血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的eNOS催化合成NO，后者通過自由擴(kuò)散方式進(jìn)入外周細(xì)胞，并與其內(nèi)的sGC結(jié)合生成cGMP，后者則激活cGK－1?；罨蟮腸GK－1通過磷酸化過程抑制Ca2＋進(jìn)入細(xì)胞，并促進(jìn)Ca2＋庫吸收Ca2＋及向細(xì)胞外排出Ca2＋，使胞內(nèi)升高的Ca2＋濃度降低。Watanabe等發(fā)現(xiàn)血管紋血管外周細(xì)胞內(nèi)有粗細(xì)不同的平滑肌肌纖維樣纖維。當(dāng)血管外周細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度增加時，足夠數(shù)量的Ca2＋與細(xì)肌絲上的肌鈣蛋白結(jié)合，在ATP的參與下，粗、細(xì)肌絲間發(fā)生相對位移，引起收縮反應(yīng)，造成血管管徑縮小。此收縮反應(yīng)的前提是Ca2＋濃度高于10－5　mol/L。因cGMP激活的蛋白激酶cGK－1通過磷酸化過程抑制細(xì)胞內(nèi)磷脂酶C，降低磷酸肌醇IP3的含量。這一變化可使細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度下降，肌凝蛋白輕鏈激酶的活性使降低抑制了肌凝蛋白輕鏈磷酸化，故改善了由于Ca2＋超載造成的血管痙攣。

結(jié)果提示，L－精氨酸（NO的底物）通過激活NO/cGMP通路改善病理條件下（胞內(nèi)Ca2＋升高）的耳蝸血液循環(huán)，為臨床治療相關(guān)的耳蝸疾病提供一個新途徑。

總之，第二信使廣泛存在于機(jī)體，在耳蝸中的第二信使對耳蝸功能的調(diào)節(jié)起到重要作用，在研究IHC與OHC之間，毛細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，探討第二信使的變化更為有意義。關(guān)鍵是要做一個包括IHC、OHC和支持細(xì)胞在內(nèi)的活體標(biāo)本，通過共聚焦激光顯微鏡可觀察第二信使的運行傳遞規(guī)律，其次，對于NO/cGMP通路中的NO其雙重性必須充分認(rèn)識，小量的NO起到第二信使的作用，而過量的NO則是氧自由基并產(chǎn)生毒性，在細(xì)胞間NO如何平衡調(diào)節(jié)，是需進(jìn)一步深入探討的問題。

（李興啟　賈學(xué)斌　侯志強(qiáng)）

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