A.N.Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, and I.L.Zhuravleva1　著尹　晗迪4　譯

(1　俄羅斯科學(xué)院伊曼紐爾生化物理研究院 莫斯科　俄羅斯　119991　2　奧廖爾州農(nóng)業(yè)大學(xué)　奧廖爾　俄羅斯　302019　3　奧廖爾州立大學(xué)藥檢所　奧廖爾　俄羅斯　302028　4　蘭州大學(xué)化學(xué)系　蘭州　730000)

摘　要：用反相柱色譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的動(dòng)物擾動(dòng)堆肥堆制所獲得的腐植酸是由親水組分和疏水組分組成的，其中疏水組分大體上含有較低的帶電基團(tuán)，這些帶電基團(tuán)很可能是羧酸。在差示掃描量熱法測(cè)定腐植酸的稀溶液做出的熱容-溫度圖中發(fā)現(xiàn)了在約58 ℃時(shí)有一個(gè)轉(zhuǎn)折，這表明疏水基團(tuán)水合作用的增加。我們還發(fā)現(xiàn)了在86-90 ℃的溫度區(qū)間內(nèi)有一個(gè)熱容的突增，這可能是由于“膠束”內(nèi)部的疏水基團(tuán)的水合作用，因?yàn)轭愃颇z束結(jié)構(gòu)的疏水核有“脫玻作用”。這表明了隨著堆肥時(shí)間的增加，腐植酸疏水組分的相對(duì)含量和熱轉(zhuǎn)變的協(xié)同性也增加，它以熱容突增的形式表現(xiàn)出來(lái)，這很可能是因?yàn)椤澳z束”大小的增加。

關(guān)鍵詞：腐植酸　疏水性　高效液相色譜　掃描微量熱法　熱容

A Study of Dilute Aqueous Solutions of Humic Acids by Scanning Microcalorimetry

A.N.Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, and I.L.Zhuravleva1 write Handi Yin4 translate

(1 Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, 119991 2 Orel State Agricultural University, Orel, Russia, 302019 3 Medical Institute, Orel State University, Orel, Russia, 302028 4 Department of Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou, 730000)

Abstract: It has been found by reversed_phase chromatography that humic acids obtained from vermicomposts of different duration of vermicomposting consist of a hydrophilic and a hydrophobic fractions, the hydrophobic fraction having a substantially lower content of charged, probably carboxylic, groups.A change in the sign of the temperature dependence of the heat capacity of dilute aqueous solutions of humic acids at ～58°C has been found by differential scanning microcalorimetry, which indicates an increase in the hydration of hydrophobic groups.A jump_wise increase in heat capacity in the temperature range from 86 to 90 °C was also found, which is perhaps due to hydration of hydrophobic groups in the interior of “micelles”, because of “devitrification” of the hydrophobic nucleus of micelle_like structures.It was shown that increasing the duration of vermicomposting leads to an increase in the relative content of the hydrophobic fraction of humic acids and in the cooperativity of the thermodynamic transition, which manifests itself as the jump of heat capacity, which probably results from the increase in the “micelle” size.

Key words: humic acids; hydrophobicity; high_performance liquid chromatography; scanning microcalorimetry; heat capacity

腐殖質(zhì)是在有機(jī)碳死亡的轉(zhuǎn)化過(guò)程中形成的，存在于土壤、泥炭、煤、水庫(kù)等地。它可以區(qū)分為以下幾組：(1) 腐植酸(HuA)，只能溶于堿性溶劑中；(2) 吉馬多美朗酸，從用乙醇萃取腐植酸之后的潮濕殘余物(膠狀)中提取出來(lái)的；(3) 葉酸，可溶于水、堿或酸性溶液。有機(jī)殘余物轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)的過(guò)程被稱為腐殖化過(guò)程。這個(gè)過(guò)程是憑借生物體的參與和純粹的氧化、還原、水解、縮合等化學(xué)反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。腐殖質(zhì)是在生物體外具有最穩(wěn)定形態(tài)的碳有機(jī)化合物，它們的分子量組成從30 kDa到50 kDa，而葉酸則小于6 kDa。這兩種物質(zhì)在化學(xué)組成和分子質(zhì)量上是不均勻的。腐殖質(zhì)的主體是由酚類殘基構(gòu)成的，而外圍部分則由糖類和氨基酸殘基構(gòu)成。

直到現(xiàn)在，腐殖質(zhì)的準(zhǔn)確化學(xué)結(jié)構(gòu)還未確定，僅僅有一些假設(shè)模型和結(jié)構(gòu)片段。然而，眾所周知，腐植酸在溶液中有著線圈構(gòu)象，被看成是有著不含水的疏水核和相對(duì)親水的外圍的“膠束”(類膠束結(jié)構(gòu))。但還缺少了稀溶液中“膠束”的部分熱力學(xué)函數(shù)的數(shù)據(jù)，特別要關(guān)注于與腐植酸的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)有關(guān)的熱力學(xué)參數(shù)的研究。在這個(gè)工作中，我們研究了腐植酸的熱力學(xué)參數(shù)的改變和動(dòng)物擾動(dòng)堆肥的過(guò)程對(duì)“膠束”組成的改變。

1　試驗(yàn)部分

動(dòng)物堆肥的樣品是使用Staratel 種蠕蟲(chóng)的馬堆肥，動(dòng)物堆肥時(shí)間分為1.5、3、和6個(gè)月(分別為樣品2、3、4)，用原始的馬堆肥作為對(duì)照(樣品1)。樣品需要在瓷研缽中徹底地研磨，并用3 mm孔徑的濾網(wǎng)過(guò)濾。在濾過(guò)的樣品中，取出5 g干燥至恒重(一式三份)用以測(cè)定其濕度。為了分離腐植酸，三份樣品都要稱重來(lái)收集5 g干物質(zhì)。腐植酸的分離和純化是按照相關(guān)文獻(xiàn)中描述的方法進(jìn)行的。最后一步要將腐植酸小球放入可濾過(guò)小于2 kDa的分子的透析袋，在蒸餾水中透析24 h。在裝有P2O5的真空干燥器中干燥腐植酸，將備好的樣品裝入燒杯，放入充滿氮?dú)獾母稍锲鳎瑑?chǔ)存在4℃的冰箱中。

色譜法和量熱法研究所需的腐植酸溶液配制如下：稱取用上述方法制得的干燥腐植酸樣品各50 mg，在磁力攪拌下溶于5 mL 0.1 N的NaOH溶液。將此溶液置入可濾過(guò)小于2 kDa的分子的透析袋，在含有0.4 M NaCl，pH 7.6的0.1 M磷酸鹽緩沖液中透析過(guò)夜。

色譜法研究所需的溶液可用和量熱法相同的方法制備，但需要用50 mM的pH 7.6的磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行透析。所得的腐植酸溶液的濃度是由干燥至恒重時(shí)鹽的余量來(lái)決定的。

腐植酸的色譜研究使用的是配備了可獲取和處理色譜數(shù)據(jù)的電腦的Gilson色譜儀,使用了Macrosphere C8,300A,250×4.6 mm色譜柱。分離腐植酸使用的流動(dòng)相是：洗脫液A，10 mM，pH 7.6，含有6 mM四丁基溴化銨(TBAB)以及沒(méi)有TBAB的磷酸鹽緩沖液；洗脫液B，100%的含有6 mM四丁基溴化銨(TBAB)以及沒(méi)有TBAB的乙腈。色譜分析法用以下的方法進(jìn)行：0～10 min用洗脫液A進(jìn)行等度洗脫，10～30 min從100%的A到90%的B進(jìn)行梯度洗脫，30～40 min用洗脫液B進(jìn)行等度洗脫。洗脫液流速是1 mL/min，樣品體積是100 μL(c=1.0 mg/mL)。色譜峰的檢測(cè)使用了220 nm的紫外檢測(cè)器。

高靈敏度熱量測(cè)定使用了DASM_4A絕熱掃描微量熱計(jì)(莫斯科普希諾RAS生物儀器研究所)，工作單元體積為0.4672 cm3。每次實(shí)驗(yàn)的熱容比都用焦耳倫茨效應(yīng)進(jìn)行校正，溫度掃描范圍從20 ℃到120 ℃，加熱速率為2 ℃/min，腐植酸溶液濃度為6 mg/mL。

表1　腐植酸的高效液相色譜分析結(jié)果
Tab.1 Results of analysis of humic acids by high performance liquid chromatography

圖1　腐植酸色譜圖(動(dòng)物擾動(dòng)堆肥0月)

Fig.1 Chromatogram of humic acids (0 mo of vermicomposting)

注：(1) (a) 不含四丁基溴化銨的洗脫液；(2) (b) 含6 mM四丁基溴化銨的洗脫液。(3) 條件：Macrosphere C8(300A)(250×4.6)色譜柱；洗脫液流速：1 mL/min；取樣容積100 μL(c=1.0 mg/mL)；在220 nm處檢測(cè)。0-10 min用洗脫液A等度洗脫；10-30 min從100%的洗脫液A到90%的洗脫液B進(jìn)行梯度洗脫；30-40 min用洗脫液B進(jìn)行等度洗脫。洗脫液A為10 mM，pH 7.6的磷酸鹽緩沖液；洗脫液B，100%的乙腈。

2　結(jié)果與討論

在圖1中，我們展示了樣品4的色譜圖(其他樣品的色譜圖類似)，分別用含離子對(duì)試劑四丁基溴化銨和不含它的洗脫液洗脫出來(lái)(分別為圖1b和1a)。不含四丁基溴化銨的色譜圖有兩個(gè)峰：峰1對(duì)應(yīng)的是部分疏水腐植酸，因?yàn)樗鼈儽凰畯纳V柱中洗脫出來(lái)，保留時(shí)間較低；峰2對(duì)應(yīng)的是用70%的乙腈洗脫出來(lái)的疏水腐植酸。在洗脫液中加入了四丁基溴化銨后，峰1消失了，同時(shí)，峰2的面積相應(yīng)的增加了。這樣的現(xiàn)象為所有腐植酸樣品的共性。得到的結(jié)果有理由認(rèn)為圖1a中峰1和2之間的差異主要是由腐植酸的離子化基團(tuán)的含量決定的。考慮到實(shí)驗(yàn)是在pH 7.6的條件下進(jìn)行的，這個(gè)基團(tuán)最有可能是羧基。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，大量的腐植酸中包含的這些基團(tuán)的量為3～7 mM/ g。應(yīng)該被注意到，帶電基團(tuán)同樣出現(xiàn)在疏水部分的腐植酸中(圖1a，峰2)，當(dāng)在洗脫液中加入四丁基溴化銨后，疏水部分的洗脫時(shí)間從28 min增加到了31 min，峰也變得對(duì)稱了(圖1b)。

表1中我們列出了使用不含四丁基溴化銨的洗脫液洗脫時(shí)獲得的所有腐植酸樣品的色譜數(shù)據(jù)?？梢钥闯觯诙糠指菜岬南鄬?duì)含量隨著動(dòng)物擾動(dòng)堆肥的時(shí)間增長(zhǎng)而增加。這個(gè)事實(shí)連同在洗脫液中加入四丁基溴化銨時(shí)獲得的色譜數(shù)據(jù)證明了在動(dòng)物擾動(dòng)堆肥的過(guò)程中帶電基團(tuán)的含量有下降的趨勢(shì)。

在C-D段，腐植酸的熱容在很窄的區(qū)間內(nèi)發(fā)生了猛增，表示這個(gè)轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)參數(shù)(中轉(zhuǎn)變溫度，轉(zhuǎn)變區(qū)間，熱容突增量)不依賴于此區(qū)間的掃描速度0.5～4 ℃/min。在此基礎(chǔ)上，我們可以認(rèn)為這個(gè)轉(zhuǎn)變過(guò)程程現(xiàn)平衡態(tài)。我們認(rèn)為這個(gè)轉(zhuǎn)變反映了疏水基團(tuán)形成“膠束”核的水合作用是由于微胞內(nèi)流動(dòng)性的突增，也就是膠束的疏水核的脫玻作用。

經(jīng)歷了不同時(shí)間的動(dòng)物擾動(dòng)堆肥隔離堆制出的腐植酸轉(zhuǎn)變的熱力學(xué)特征列于表2?？梢钥闯?動(dòng)物擾動(dòng)堆肥的過(guò)程不影響熱容突增量，然而轉(zhuǎn)變溫度隨著堆肥時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，過(guò)度帶寬則隨著堆肥時(shí)間的增長(zhǎng)而減小。后者意味著堆肥的過(guò)程中存在著過(guò)渡協(xié)同效應(yīng)程度的增長(zhǎng)，這明確地證明了“膠束”質(zhì)量的增加。

如前所述，“膠束”的熱越遷可能與“膠束”疏水核的脫玻效應(yīng)還有疏水基團(tuán)的水合作用有關(guān)。的卻，眾所周知，腐殖質(zhì)(腐植酸和葉酸)的脫玻效應(yīng)的熱容突增不超過(guò)0.03 J/(g·K)。因此，我們所觀測(cè)到的熱容突增[0.6 J/(g·K)]幾乎全部是由于脫玻的“膠束”核的疏水基團(tuán)的水和作用產(chǎn)生的。

圖2　不同動(dòng)物擾動(dòng)堆肥時(shí)間的腐植酸溶液的熱分析圖

Fig.2 Thermograms of solutions of humic acids from vermicomposts of different time of vermicomposting (1 – 0 mo; 2 – 3 mo; 3 – 6 mo)

注：腐植酸濃度為6 mg/mL，溶于pH 7.6，含0.4 M NaCl的0.1 M磷酸鹽緩沖液中；Δttr為轉(zhuǎn)變溫度，Δttr為轉(zhuǎn)變區(qū)間；ΔCp為突增熱容。區(qū)間：A-B—熱容增加，B-C—熱容下降，C-D—熱容突增。

圖3a,b為熱轉(zhuǎn)變區(qū)間的溫度和寬度對(duì)疏水組分在樣品中的含量所作的圖。可以看出熱轉(zhuǎn)變溫度大致以指數(shù)形式隨著腐植酸疏水性的增加而增加。同時(shí)，轉(zhuǎn)變溫度區(qū)間的寬度(協(xié)同性的程度)隨著樣品疏水性的增加而減小。因此，隨著堆肥時(shí)間的增加，腐植酸疏水性增加，還伴隨著熱容突增的協(xié)同性的增長(zhǎng)，這明顯是由于“膠束”質(zhì)量(更確切的說(shuō)是動(dòng)力學(xué)單元的平均數(shù))的增加。

圖3　溫度(a)溫度區(qū)間寬度(b)在不同動(dòng)物擾動(dòng)堆肥時(shí)間堆制所得的腐植酸的“膠束”熱躍遷，對(duì)疏水組分組成的相對(duì)含量(F2,%)作圖

Fig.3 Dependences of temperature (a) and width of temperature interval (b) of thermal transition in “micelles” of humic acids in vermicomposts of different time of vermicomposting on the relative content in their composition of the hydrophobic fraction (F2, %)

表2　腐植酸稀溶液的熱容突增參數(shù)
Tab.2 Parameters of the jump in heat capacity of humic acids in dilute solution

3　結(jié)論

在不同時(shí)間動(dòng)物擾動(dòng)堆肥隔離堆制的腐植酸的稀溶液中，在86～90 ℃的溫度區(qū)間，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)熱容的突增，明顯是以“膠束”核的疏水基團(tuán)的水合作用為前提條件的。

動(dòng)物擾動(dòng)堆肥時(shí)間的增加導(dǎo)致腐植酸非極性組分含量的升高，其特點(diǎn)是電荷含量相對(duì)較低。除此之外，動(dòng)物擾動(dòng)堆肥時(shí)間的增加使熱容突增的溫度升高，其協(xié)同性也增加。

參考文獻(xiàn)(略)

譯自：A.N.Danilenko, E.E.Braudo, N.E.Pavlovskaya, E.I.Yushkova, I.L.Zhuravleva, 2011, published in Biofizika, 2011, 56, (1): 57～61。