對上述作為藥源的腐植酸，除了在純度、分子/準分子級別上滿足藥用原料的質(zhì)量外，還應(yīng)加強藥理-藥效的研究工作。

生物酶屬于蛋白質(zhì)(HOOC-R-CH2NH2)，它是構(gòu)成植物細胞原生質(zhì)的基本組分。蛋白質(zhì)的單體主要是脂族氨基酸，也有少量芳香族氨基酸，如色氨酸、組氨酸等。氨基酸通過肽鍵(-NHCO-)、硫醚鍵(-S-S-)、脒鍵 (-N=C-)，酯鍵、氫鍵連接起來。蛋白質(zhì)有堿性基團(-NH2)和酸性基團(COOH)，是親水性很強的膠體物質(zhì)。在需氧條件下，蛋白質(zhì)可水解成氨基酸、卟啉等氮化物。在厭氧條件下不完全分解，生成不同的多肽，其結(jié)構(gòu)中含有NH、COOH、OH、SH等基團，也是參與HA形成過程的組成部分[1]。HA中的氮、硫及其酶-聯(lián)反應(yīng)與蛋白質(zhì)的含量有關(guān)。

MTT是化學(xué)名為3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide, 商品名為噻唑藍的一種能接受氫原子的染料?；罴毎€粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉淀在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜(DMSO)能溶解細胞中的藍紫色結(jié)晶物，用492 nm波長處測定其吸收值(OD)，可間接反映活細胞數(shù)量，從而反映受試藥物對淋巴細胞的增值的影響。

樊興明等利用MTT實驗測定腐植酸對HELA細胞(癌細胞)的抑制作用(圖1)。即：將對數(shù)生長期HELA細胞稀釋到2×105個/毫升接種于96孔培養(yǎng)板，每孔接0.1　mL。分別加入不同濃度的腐植酸藥物，每濃度平行5孔，空白對照組加等量體積的培養(yǎng)液。置溫度35 ℃，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。實驗終止前4h取出細胞培養(yǎng)板，先在倒置顯微鏡下觀察，然后在每孔中補充MTT工作液20 μL，終濃度0.5　g/L。培養(yǎng)結(jié)束后，采用離心2000 rpm×10 min，用微量加樣器小心地吸棄上清，再加入100 μlDMSO，振蕩10 min。待MTT還原產(chǎn)物完全溶解，在酶標儀上以492 nm為檢測波長，630 nm為參考波長測定光密度值(OD值)。計算細胞的存活率，并以藥物的不同濃度和細胞的存活率作圖。

細胞存活率＝[試驗組OD平均值]/[空白對照組OD平均值]×100%

半數(shù)抑制濃度(IC50)：引起半數(shù)細胞死亡的藥物濃度。

圖1中腐植酸MTT實驗結(jié)果顯示，其對HELA細胞的存活率為72.35%時，濃度為500 μg/mL，其抑制活性明顯優(yōu)于文獻。而從圖2Wei-Jiunn Lee等[18]的結(jié)果可以看出，加長腐植酸藥物的作用時間，從24 h延長到48 h，也會大大提高腐植酸對癌細胞的抑制活性。

圖1　不同腐植酸活性組分對HELA細胞的抑制效果
Fig.1　Inhibition effect of different active components by humic acid on HELA cells

圖2　腐植酸對細胞存活率的影響
Fig.2　Effect of humic acid on cells viability

上圖2的實驗方法是：將細胞置于不同濃度的腐植酸中48h，并利用MTT法測定細胞的存活率。相對于未經(jīng)處理的控制細胞，可以得出細胞存活率的值。在顯著性檢驗因子p<0.05條件下對比添加腐植酸的控制細胞存活率；同時，在顯著性檢驗因子p<0.05的條件下，對比不加腐植酸與加腐植酸的細胞存活情況進行比較[19～20], 得出的規(guī)律如圖2所示.可以看出,在同樣的500μg/mL濃度下, 對HELA細胞的存活率高于圖1。

腐植酸及活性組分的藥理作用情況如下。

(1)腐植酸類有機酸殺菌作用取決于未電離的分子，它透過細菌的細胞膜對細菌起殺滅作用。

(2)腐植酸有花生四烯酸(C20四烯酸)的抗菌、消炎等作用。

(3)腐植酸中的萜類，通過微生物細胞膜，干擾了能量代謝的酶促反應(yīng)，影響其能量代謝途徑來達到抗菌效果。

(4)腐植酸中脂溶性的甾類，容易穿透細胞膜進入細胞體內(nèi)，干擾細胞膜的通透性，引起細胞凋亡或死亡,影響免疫系統(tǒng)。

(5)生化腐植酸的醇、酚羥基數(shù)目較多，在清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生自由基的同時，抑菌作用有所增強，半衰期約1小時,＜0.1　g,符合一級動力學(xué)。

(6)腐植酸中的酚羥基可與蛋白質(zhì)分子中的氨基或羧基結(jié)合，其疏水的苯環(huán)結(jié)構(gòu)也可與蛋白質(zhì)發(fā)生疏水結(jié)合，腐植酸與蛋白質(zhì)之間的多點結(jié)合作用，阻止了細菌的侵染，使其具有抑菌性。