腐植酸選擇性降解及分子量測定研究_2011年論文集

腐植酸選擇性降解及分子量測定研究

樊興明 張義超 張  釗 周霞萍

（華東理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院 上海 200237）

摘  要：天然腐植酸資源豐富，腐植酸的選擇性氧化降解及合成研究涉及的機理復(fù)雜、應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?。腐植酸用于醫(yī)藥，具有消炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用，同時對提高免疫能力、解毒及對內(nèi)分泌都產(chǎn)生影響。通過超聲活化、生物降解等方法對原料煤進(jìn)行預(yù)處理，有效的提高了原料煤中腐植酸和黃腐酸的含量，其中生物降解褐煤、風(fēng)化煤9～30 d，棕腐酸、黑腐酸含量增加302.56%，黃腐酸含量增加393.99%；并通過對冰點下降常數(shù)的修正，建立了適合黃腐酸的分子量測定方法，修正后的冰點下降常數(shù)K=3.94 kg·K·mol-1，結(jié)合毛細(xì)管電泳、液-質(zhì)色譜聯(lián)用證明了方法的可靠性。

關(guān)鍵詞：腐植酸 黃腐酸 選擇性降解 冰點下降法 分子量測定

Research on the Selective Degradation and Molecular Weight of Humic Acid

Fan Xingming, Zhang Shiwan, Zhan Zao, Zhou Huazhong

(College of Resource and Environmental Engineering, East China University of Science and

Technology, Shanghai, 200237)

Abstract: Humic acid is rich in natural resources. It is complex in mechanism and wide in application to do research on selectively oxidation and synthesis of humic acid. For application in the field of medicine, humic acid has effects on anti-inflammatory, antibacterial, anti-virus, anti-tumor as well as immunity, detoxification and endocrine. Content of humic acid and fulvic acid in raw coal was effectively raised by such pre-processing as ultrasonic activation, chemical oxidation activation and biological degradation activation in my study. Content of lignite fulvic acid was increased by 393.% after treatment of bacterium for 9~30 days with degradation rate of ulmic acid and humic acid up to 302%.,and a new way of molecular weight determination for fulvic acid was established by modification of cryoscopic constant which was proved by the detection of capillary electrophoresis and LC-MS. The modified cryoscopic constant turned out to be 3.94 kg?K?mol-1.

Key words: humic acid; fulvic acid; selective degradation; modification of cryoscopic constant; molecular weight determination

腐植酸廣泛存在于低階煤如風(fēng)化煤、褐煤和泥炭中[1～3]。大量研究表明[4，5]，腐植酸具有消炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤作用，同時對提高免疫能力、解毒及對內(nèi)分泌都產(chǎn)生影響，但腐植酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜，作用機理闡述困難，大大限制了它的應(yīng)用。

關(guān)于分子量測定，GPC是一種常用方法。但GPC測定的生物質(zhì)，分子量都較大，不適于測定低分子量物質(zhì)[6～8]。對于分子量低于1000的腐植酸測定，目前只有張德和[9，10]等采用沸點升高法和蒸汽滲透壓法，測定了鞏縣風(fēng)化煤黃腐酸和湛江泥炭分級后的黃腐酸分子量，其他文獻(xiàn)報道則很少。

本研究采用超聲波活化、微生物菌(生物酶)選擇性降解的方法，得到結(jié)構(gòu)相對單一的黃腐酸降解物，采用改進(jìn)的冰點下降法測定腐植酸(和黃腐酸)分子量，并結(jié)合毛細(xì)管電泳、液-質(zhì)色譜聯(lián)用分析證明方法的可靠性，尚未見有文獻(xiàn)記載。

1  實驗部分

1.1 原料及試劑

風(fēng)化煤腐植酸，新疆哈密腐植酸有限公司提供；泥炭腐植酸、褐煤腐植酸，云南石屏縣科技局提供。

1.2 實驗儀器與分析

1.2.1 實驗儀器

HWS26型電熱恒溫水浴鍋，RT-02A型粉碎機，77-9型貝克曼溫度計，Bechman COULTER MDQ毛細(xì)管電泳儀，傅立葉變換紅外光譜儀，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，質(zhì)譜檢測器，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Cw2000超聲微波萃取儀，黃腐酸分子量測定裝置見圖1。

圖1 冰點下降法測定黃腐酸分子量的裝置示意圖
Fig.1 Skech map of equipment for molecular of fulvic acid by cryoscopic method

1.2.2 實驗分析

水分，灰分，總腐植酸含量，黃腐酸含量分析均采用國標(biāo)方法測定，黃腐酸分子量測定采用改進(jìn)的冰點下降法測定。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲波活化選擇性降解腐植酸和黃腐酸

取一定量的腐植酸，分別加入一定量的水溶液，保證液固比為值2～5，將pH值為1～13的溶液分置于容器中，在不同的功率下超聲活化10～30 min，然后測定煤中腐植酸和黃腐酸的含量。

1.3.2 生物法選擇性降解腐植酸

取一定量的腐植酸，按腐植酸∶微生物菌∶水為20∶0.2∶100的質(zhì)量比例混合，生物發(fā)酵，定時取樣，研究腐植酸和黃腐酸含量與選擇性降解的關(guān)系。

1.3.4 腐植酸和黃腐酸分子量測定與選擇性降解的關(guān)系

調(diào)節(jié)貝克曼溫度計測量范圍到0℃左右，調(diào)節(jié)冰浴溫度-5～-4℃，在測量管內(nèi)移入一定量的去離子水，插入貝克曼溫度計，不斷緩慢的攪拌試液，測定其凝固點Tf*，用同樣的方法測定待測黃腐酸溶液的凝固點Tf，平行實驗組相差應(yīng)小于0.004 ℃。

分子量的計算公式如下：

式中，MB為溶質(zhì)B的分子量(kg/mol)；C為稀溶液的濃度(g/L)；ρ為純?nèi)軇┰谀厅c時的密度(kg/L)；Kf為所測定的修正的冰點下降常數(shù)，用于黃腐酸具有類似性質(zhì)的結(jié)構(gòu)類似物水楊酸、草酸和鄰苯二甲酸氫鉀溶液測定，并用黃腐酸分子結(jié)構(gòu)類似物作模型化合物。

2  結(jié)果與討論

2.1.1 原料腐植酸的基本性質(zhì)

實驗采用國標(biāo)方法對原料腐植酸的水分、灰分、腐植酸、黃腐酸含量做了基本的測定，結(jié)果見表1。

表1 原料腐植酸基礎(chǔ)數(shù)據(jù)一覽表
Tab.1 Basic data for humic acid

注：括號里的數(shù)值為干基數(shù)據(jù)。

2.1.2 超聲活化法與黃腐酸含量的影響

圖2是不同功率條件下，超聲波活化降解泥炭腐植酸后黃腐酸含量對比圖?？梢钥闯?，泥炭中黃腐酸的含量得到了很大的提升，而且功率越大，提升的含量越明顯，在100%全功率下黃腐酸的含量增加了144%。這是由于超聲波使水溶液產(chǎn)生空化效應(yīng)，空化效應(yīng)可產(chǎn)生局部高溫、高壓，促使水分子形成自由基OH·和H·。這些含有未配位電子的自由基，直接氧化水溶液中的腐植酸，使腐植酸的O/C和H/C提高，酚羥基和醌基增加，縮合芳香結(jié)構(gòu)變小，生成黃腐酸。通常來說，超聲波的頻率和功率越高，所產(chǎn)生的空化效應(yīng)越強，腐植酸降解率越大，降解產(chǎn)物黃腐酸越多。但超聲波頻率也不能太高，否則自由基的氧化能力過強，直接把腐植酸和黃腐酸氧化成二氧化碳，反而導(dǎo)致黃腐酸含量降低。

圖2 超聲波功率和泥炭黃腐酸含量變化曲線
Fig.2 Ultrosonic power effects on fulvic acid content of peat

2.1.3 選擇性生物降解與黃腐酸含量的變化規(guī)律

實驗采用2種菌(白顏色的稱之為白菌，黃顏色的稱之為黃菌)，按風(fēng)化煤腐植酸∶微生物菌∶水為20∶0.2∶100的質(zhì)量比例投樣，并加入一定量的培養(yǎng)基進(jìn)行生物發(fā)酵，每隔4天取樣，測定腐植酸和黃腐酸含量。

選擇性生物降解與腐植酸和黃腐酸變化規(guī)律如圖3、圖4所示。

圖3 不同菌種對風(fēng)化煤腐植酸含量的影響
Fig.3 Effects on HA content of weathering coal by different bacteriums

圖4 不同菌種對風(fēng)化煤黃腐酸含量的影響
Fig.4 Effects on HA content of weathering coal by different bacteriums

從圖3可以看出，在實驗前12 d，風(fēng)化煤腐植酸的含量持續(xù)上升，在12 d左右達(dá)到最大，這是因為微生物在以芳香性的腐殖化物質(zhì)(HS)作為碳源的同時，將其氧化降解成腐植酸，形成羧基、酚羥基等，增加了表觀腐植酸的含量。而之后又開始下降，使圖3曲線近似呈拋物線狀態(tài)。這是因為原有的腐植酸分子也開始繼續(xù)降解，形成非腐植酸的醋酸等，甚至最終氧化降解為CO2、H2O。由圖3可知，在這個時間段，白菌選擇性降解效果比黃菌好。

由圖4可見，采用白菌和黃菌選擇性生物降解使風(fēng)化煤中黃腐酸含量分別提高了90.84%和81.09%，其降解規(guī)律如圖3。在氧化降解形成羧基等官能團的同時，過度氧化也可以使芳烴開環(huán)，使脂肪烴氧化，最終降解為CO2、H2O。

采用上述方法分別對風(fēng)化煤泥炭腐植酸和褐煤腐植酸進(jìn)行相關(guān)實驗，降解3～30 d后測定黃腐酸的含量，實驗結(jié)果見表2。

表2 生物降解泥炭腐植酸及褐煤腐植酸后黃腐酸含量變化
Tab.2 Fulvic acid content of peat HA and lignite HA after treatment of microbiology

從表2可知，在3 d的短期降解過程中，黃腐酸含量都增加了一倍左右，這證明泥炭腐植酸和褐煤腐植酸具有良好的生物活性，生物降解效果優(yōu)于風(fēng)化煤腐植酸；從表中還可看出，白菌的生物降解性能優(yōu)于黃菌，褐煤腐植酸相對于泥炭腐植酸而言，是更適合生物降解的煤炭腐植酸。所以實驗繼續(xù)延長白菌對褐煤腐植酸的降解時間，定時取樣，測定其黃腐酸含量的變化，結(jié)果見圖5。

圖5中，白菌選擇性降解褐煤腐植酸后黃腐酸的含量持續(xù)升高，基本呈線性增加，到第9天后黃腐酸含量增加到36.93%，實驗測得第9天褐煤腐植酸中棕、黑腐酸降解率達(dá)到48.99%。

2.1.4 腐植酸降解物(黃腐酸)分子量測定研究

(1) 采用冰點下降法測定黃腐酸分子量的建模研究。

(A) 冰點下降常數(shù)K值的測定。

冰點下降法選用水做溶劑，溶于水的大部分溶質(zhì)會在水中電離，部分溶質(zhì)也會在水中通過氫鍵締合，使分子量的測定偏離正確的數(shù)值，黃腐酸是一種含有羥基羧基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，容易與水通過氫鍵締合，直接采用冰點下降法測定黃腐酸的分子量會導(dǎo)致較大的誤差。因此，應(yīng)用冰點下降法測定黃腐酸分子量必須對水溶液中溶質(zhì)的部分電離和締合進(jìn)行修正，確定冰點下降常數(shù)K。

根據(jù)張德和等測定黃腐酸分子結(jié)構(gòu)的結(jié)果，選用與黃腐酸有同樣官能團的水楊酸、草酸和鄰苯二甲酸氫鉀為標(biāo)準(zhǔn)模型物，配成一定濃度的水溶液，用已知分子量反推K值，得到結(jié)果見表3。

圖5 白菌活化褐煤黃腐酸含量隨時間變化曲線
Fig.5 Effects on FA content of lignite by treatment of white
bacterium for different long time

表3 冰點下降常數(shù)K值測定
Tab.3 Determination of cryoscopic constant

從表3可以看出，一定濃度下標(biāo)定的模型物冰點下降常數(shù)K值很接近，可以認(rèn)為是一個常數(shù)。經(jīng)過關(guān)聯(lián)K值與溶質(zhì)濃度的關(guān)系，使一定濃度范圍內(nèi)的K值保持恒定，從而測定出黃腐酸的分子量。通過關(guān)聯(lián)出的表3數(shù)據(jù)可以推論，氫鍵締合在測定體系中起主導(dǎo)作用，溶質(zhì)在水中解離后使水中的質(zhì)子數(shù)增加，K值減小，但電離作用對K值的影響很小，因此，電離能力最強的鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定出來的K值最低，只比電離能力最差的水楊酸低了2.01%。

K值取上述3種物質(zhì)標(biāo)定出來的平均值，K=3.94 kg·K·mol-1。

(B) 修正后K值的驗證。

為了檢驗修正后的K值是否可以用于黃腐酸分子量的測定，繼續(xù)選用黃腐酸分子結(jié)構(gòu)類似物及其混合組分作模型物，配成一定濃度的水溶液，測定其分子量，并與理論值做比較，結(jié)果見表4。

表4 用冰點下降法測定模型化合物的分子量
Tab.4 Molecular weight results of structural analogues by cryoscopic method

從表4可以看出，含有芳香環(huán)及羧酸和羥基的化合物，運用修正的水冰點下降常數(shù)，可以較準(zhǔn)確的測定出其分子量。而當(dāng)水溶液中有鹽組分時，應(yīng)按鹽全部電離的狀態(tài)，進(jìn)行分子量的修正，否則數(shù)據(jù)會偏低。

(2) 冰點下降法測定黃腐酸分子量的研究。

實驗采用白菌，按照上述 2.1.2、2.1.3的實驗條件，根據(jù)2.1.4冰點下降法的數(shù)學(xué)模型，測定降解后黃腐酸分子量，結(jié)果見圖6。

圖6 選擇性超聲降解/生物降解對黃腐植酸分子量的影響
Fig.6 Molecular weight comparation of fulvic acid with or without ultrasonic

從圖6可以看出，與降解前的原料相比，超聲波、微生物降解以及超聲+生物降解法后，分子量都有一定程度的降低，單純生物降解腐植酸后測定黃腐酸分子量為578.26，而采用采用超聲波+微生物降解氧化腐植酸后黃腐酸分子量為512.99。這是由于低功率的超聲波，產(chǎn)生的空化作用較小，對細(xì)胞產(chǎn)生的破壞很小，并能有效促進(jìn)可逆滲透，從而加強細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)運輸，加快腐植酸降解速率，促進(jìn)黃腐酸的生成。

(3) 冰點下降法測定黃腐酸分子量與其他儀器分析法的比較研究。

實驗對單純生物氧化降解腐植酸后黃腐酸采用改進(jìn)冰點下降法測定其分子量，同時對黃腐酸進(jìn)行毛細(xì)管電泳，條件如下：紫外檢測波長：200 nm；緩沖液：50 mmol/L硼酸鹽pH值為9.51；進(jìn)樣方式：自動進(jìn)樣30 kv；進(jìn)樣時間：0.5 s。計算黃腐酸分子量，結(jié)果見表5。

表5 黃腐酸分子量測定一覽表
Tab.5 The table of molecular weight of fulvic acid

由表5可知，采用冰點下降法與毛細(xì)管電泳對比，誤差僅為1.92%，互證顯示：冰點下降法測定黃腐酸分子量可以滿足測定需求。

實驗采用由超聲波+生物降解法氧化降解腐植酸后的黃腐酸試樣，通過改進(jìn)的冰點下降法測定其分子量為512.99；同時以上述試樣，采用液-質(zhì)色譜聯(lián)用測定分子量，以檢驗冰點下降法測定黃腐酸分子量的可靠性，結(jié)果見圖7。

圖7 褐煤腐植酸生化降解后黃腐酸的LC-MS分析圖譜
Fig.7 LC-MS results for lignite fulvic acid by treatment of bacterium humic acid

由圖7可以看出，生化法降解褐煤所得黃腐酸分子量主要在500左右，用冰點下降法測得該黃腐酸的分子量與LC-MS結(jié)果很接近，誤差為2.60%，證明了冰點下降法測定黃腐酸分子量的準(zhǔn)確性；另外，LC-MS的結(jié)果也證明確實得到了分子量在500左右的物質(zhì)。

3  結(jié)論

(1) 對原料腐植酸選擇性氧化降解，可以有效提高腐植酸和黃腐酸的含量，其中生物降解褐煤腐植酸9～30 d棕、黑腐酸含量增加302%，黃腐酸含量增加393%；超聲協(xié)同生物氧化可以更有效的降解FA，分子量為512.99。

(2) 在水溶液中，采用冰點下降法測定黃腐酸分子量時，必須對黃腐酸水溶液的解離常數(shù)和氫鍵締合力進(jìn)行修正。一定濃度范圍內(nèi)的黃腐酸解離和締合能力相近，本研究測得冰點下降常數(shù)K=3.94 kg·K·mol-1。

(3) 采用自行搭建的冰點下降測定儀，可以快速準(zhǔn)確地測定黃腐酸的分子量，與毛細(xì)管電泳對比誤差為1.92%，與液-質(zhì)色譜對比誤差為2.6%。

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