腐植酸生物農(nóng)藥的研制途徑及應(yīng)用進(jìn)展

周霞萍

（華東理工大學(xué)　上?！?00237）

摘　要：腐植酸主要是植物殘?bào)w在微生物作用下分解和合成的一類天然有機(jī)大分子，具有一定的抗菌、抗病、殺蟲作用，在腐植酸葉面肥、沖施肥、基肥使用中有“藥肥”的美稱。但是因?yàn)椤八幏省鄙胁环仙镛r(nóng)藥的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，腐植酸還不能定為生物農(nóng)藥。本文探討介紹了腐植酸可以制成某些標(biāo)準(zhǔn)化生物農(nóng)藥的途徑及應(yīng)用新進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：腐植酸　生物農(nóng)藥　研制途徑　應(yīng)用進(jìn)展

Development Approach and Application Progress of Humic Acid Biological Pesticide

Zhou Xiaping

(East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

Abstract: Humic acid is a class of natural organic macromolecules obtained from the decomposition and synthesis of plant residues by microorganisms.Due to its antibacterial, antiviral and insecticidal effectivenss, the humic acid is given the name of “medicine fertilizer” for its use in humic acid foliar fertilizer, fertilizer, fertilizer.However humic acid can not be classified as biological pesticide because it has not yet met the national standard of biological pesticide.This article discussed the development approaches and application progress of making humic acid as a standardized biological pesticide.

Key words: humic acid; biological pesticides; development approach; application development

腐植酸是動(dòng)植物(主要是植物)殘?bào)w在微生物作用下分解和合成的一類天然有機(jī)大分子，其復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)組合、官能團(tuán)，使它具有一定的抗菌、抗病、殺蟲作用和某些生物活性。腐植酸在葉面肥、沖施肥、基肥使用中有“藥肥”的美稱，但是尚不能定為生物農(nóng)藥。因?yàn)閲?guó)家農(nóng)藥局傳統(tǒng)的農(nóng)藥、肥料冠名中，沒有“藥肥”的系列標(biāo)準(zhǔn)?！八幏省币采胁环仙镛r(nóng)藥的相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

通?！吧镛r(nóng)藥”是指利用生物活體(真菌、細(xì)菌、昆蟲病毒等)或其代謝產(chǎn)物(信息素、生長(zhǎng)素、萘乙酸、2，4-D等)針對(duì)農(nóng)業(yè)有害生物進(jìn)行殺滅或抑制的制劑。生物農(nóng)藥包括真菌農(nóng)藥、植物農(nóng)藥、病毒農(nóng)藥、細(xì)菌農(nóng)藥、抗生素農(nóng)藥、動(dòng)物農(nóng)藥等類別。

本文根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研、國(guó)內(nèi)外同行及作者的研究成果，探討介紹了腐植酸可以制成某些標(biāo)準(zhǔn)化生物農(nóng)藥的途徑及應(yīng)用新進(jìn)展。

1　腐植酸研制抗菌抗病殺蟲的微生物農(nóng)藥途徑及應(yīng)用進(jìn)展

腐植酸微生物農(nóng)藥以微生物菌肥的形式，在行業(yè)內(nèi)已試行多年。微生物是雜食性的，一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；一般生物有害的，微生物還能利用。因此，無論在其發(fā)酵過程(可理解為微生物的自身繁殖過程)，還是在土壤內(nèi)的生命活動(dòng)過程中，腐植酸微生物農(nóng)藥(微生物菌肥)若在植物根系生長(zhǎng)、繁殖，形成優(yōu)勢(shì)菌群，可抑制和減少病原的入侵和繁殖機(jī)會(huì)，起到減輕作物病害的功效；還可以不斷釋放出植物生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)元素，包括赤霉素和細(xì)胞激素類作物生長(zhǎng)素，達(dá)到保肥、減少鹽脅迫對(duì)植物危害，改善土壤環(huán)境，使作物增產(chǎn)等作用。

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)袁紅莉推薦的防治土媒病原菌和防治葉面病害的有枯草桿菌(Bacillus subtilis)，放線農(nóng)桿菌(Agrobacterium rubiobacter)，熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)，產(chǎn)氣腸桿菌(Burkhoderia cepacia)，淺灰綠鏈霉菌(Streptomyces griscoviridis)，綠色木莓、叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)。推薦的防治蔬果收獲后被病害的微生物殺菌劑為：丁香假單孢菌(Pseudomonoas syringae)，親油假絲酵母菌(Canadidaoleophila)。推薦的微生物殺蟲劑以兩類真菌為主，第一類為線蟲捕捉真菌的Arthrobotrys、Dactylella、Monacrosporium及Nematoctonus等屬，通過設(shè)構(gòu)造殺蟲害；第二類為線蟲體內(nèi)寄生真菌(Harposporium及Drechmeria conispora)。當(dāng)真菌孢子被線蟲取食后，在線蟲體內(nèi)腸道發(fā)芽繁殖，使線蟲致死。同時(shí)推薦的解磷菌——霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、鐮刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)、AM菌根菌；解鉀菌——膠凍樣芽孢桿菌、硅酸鹽細(xì)菌、浸麻芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌，以及EM菌劑等[1]，與腐植酸、土壤腐殖質(zhì)一起發(fā)揮著多種功能，但也可能因?yàn)楦骶N作用機(jī)理不同、不恰當(dāng)選擇等，出現(xiàn)相互抵消、效果不顯著等現(xiàn)象。

培育單一菌種(圖1)將腐植酸作為固定化酶載體，構(gòu)成有靶向性的微生物農(nóng)藥是一種趨勢(shì)。因依據(jù)主力菌效應(yīng)(密集效應(yīng))，微生物競(jìng)爭(zhēng)生存效應(yīng)，可針對(duì)性地拮抗土傳病菌，減少重茬微生物的負(fù)面影響[2，3]。

圖1　華東理工大學(xué)培育的單種菌圖示

Fig.1 Single species bacteria bred by ECUST

木霉菌生物農(nóng)藥系新型生物殺菌劑。它通過產(chǎn)生抗生素、營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、微寄生、細(xì)胞壁分解酵素、以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等機(jī)制，對(duì)多種植物病原菌都具有拮抗作用，具有保護(hù)和治療雙重功效，可有效防治土傳性真菌病害，在苗床使用木霉菌劑，可提高育苗與移植的成活率，保持秧苗健壯生長(zhǎng)。也可用于防治灰霉病。

上海通微生物有限公司在上海交通大學(xué)的木霉菌殺菌劑研制的基礎(chǔ)上，制成了木霉腐植酸(簡(jiǎn)稱TBHA)產(chǎn)品，它通過試驗(yàn)篩選木霉菌(Trichoderma)或螢光假單孢菌復(fù)合劑，由專門配制的木霉腐植酸培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)生木霉菌體和分生孢子等加工制成產(chǎn)品。

據(jù)檢測(cè)該“木霉腐植酸”產(chǎn)品，含大量酶、激素、生物酸、活性分子和抗生素等；其中的激素類物質(zhì)對(duì)作物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，一般可?產(chǎn)10%～15%；生物酸具有解磷、解鉀作用，可提高化肥利用率30%以上；其他活性物質(zhì)可降解敵敵畏90%，降解辛硫磷30%～50%，降解氰化物80%，吸附重金屬Cd、Cu 40%～60%；若繼而采用“功能基因轉(zhuǎn)化”“生物礦化”“生物吸附”等系統(tǒng)生防工程，對(duì)土?污染修復(fù)，將有明顯作用和效果[4，5]。這是一個(gè)典型的腐植酸新產(chǎn)品示例，在尚沒有“藥肥”標(biāo)準(zhǔn)的前提下，其產(chǎn)品是申請(qǐng)微生物肥料還是申請(qǐng)微生物農(nóng)藥？倘若要申請(qǐng)木霉腐植酸生物殺菌劑，應(yīng)該首先說明木霉腐植酸的抗菌(殺菌)效果比較原木霉菌的情況，其次才解釋其附加的作用。

西葫蘆是一種世界范圍的常食用蔬菜，鐮刀菌會(huì)引起西葫蘆的枯萎病，而叢枝菌根真菌是最普遍的根部共生真菌，土耳其的S.Sensoy等[6]分別進(jìn)行了叢枝菌根真菌、尖孢鐮刀菌與腐植酸、乳清的單一試驗(yàn)和不同的組合試驗(yàn)，得出腐植酸可以促進(jìn)植物養(yǎng)分的吸收、植物生長(zhǎng)和抵抗非生物逆境。腐植酸在含鹽條件下會(huì)增加叢枝菌根真菌(AMF)的作用，與乳清等促進(jìn)西葫蘆幼苗增長(zhǎng)并抑制枯萎病，得到了顯著性P<0.05的結(jié)果。該示例顯現(xiàn)，腐植酸與叢枝菌根真菌(AMF)組合，可以抗菌(鐮刀菌)、抗病(枯萎病)。按此例拓展，可以研發(fā)成抗菌類腐植酸-微生物農(nóng)藥，也可以研發(fā)成抗病類-腐植酸植物農(nóng)藥。

2　腐植酸研制抗病類動(dòng)植物農(nóng)藥的途徑及應(yīng)用進(jìn)展

研制腐植酸抗病類動(dòng)植物農(nóng)藥有多種途徑，除了上述的與微生物菌種發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)以外，利用黃腐酸、腐植酸的膠體性質(zhì)，增加農(nóng)藥溶解性、提高藥效、減少用量和次數(shù)是業(yè)內(nèi)展開較好的。以專家推薦的代森錳鋅為例，它是一種廣譜的保護(hù)性殺菌劑，屬于低毒農(nóng)藥，其劑型為可濕性粉劑，有效含量≥80%，可防治梨黑星病、蘋果斑點(diǎn)落葉病、瓜菜類疫病、霜霉病、大田作物銹病等各類真菌性病害。

腐植酸與“代森錳鋅”要形成可溶性的生物農(nóng)藥，應(yīng)依據(jù) ?COOH、-OH的數(shù)量才能配位，才能提高農(nóng)藥的穩(wěn)定性，如構(gòu)成下圖(圖2)的腐植酸(氧化態(tài)的木質(zhì)素或磺化態(tài)木質(zhì)素)生物農(nóng)藥結(jié)構(gòu)[7]，為缺鋅癥狀的植物增強(qiáng)抵抗病害的能力，發(fā)揮殺菌作用。

圖2　代森錳鋅與腐植酸(氧化態(tài)的木質(zhì)素或磺化態(tài)木質(zhì)素)的組合結(jié)構(gòu)

Fig.2 Composite structure of mancozeb and humic acid (lignin under oxidation or sulfonated state)

此外，研制腐植酸抗病類動(dòng)植物農(nóng)藥還有不同的途徑。

(1)腐植酸鹽類抗病害。它依據(jù)結(jié)構(gòu)官能團(tuán)特點(diǎn)，通過微量元素與羧基、酚羥基的置換、螯合(絡(luò)合)制成。如，在遼寧蘋果樹發(fā)生缺鐵性黃化病時(shí)，王寶申等[8]用腐植酸鐵在葉面噴施病樹，改變了果樹失綠、色淡、紅色素不能生長(zhǎng)病灶，提高了蘋果Vc含量、糖分含量及產(chǎn)量。日本Jun Y.Kima等[9]在研究納米銀對(duì)日本青鳉胚胎的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，腐植酸與銀離子的絡(luò)合(形成腐植酸銀鹽)作用、凝聚效應(yīng)可減少“納米銀”對(duì)青鳉胚胎的生物利用度，降低“納米銀”對(duì)青鳉胚胎的毒性。土耳其Gonca Alak[10]研究腐植酸對(duì)褐鱒魚鰓和肌肉中鎘毒性的組織病理和生化指標(biāo)影響時(shí)，將褐鱒暴露于2 ppm鎘和5 ppm腐植酸中，發(fā)現(xiàn)褐鱒魚鰓和肌肉組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的濃度明顯低于對(duì)照組(P＜0.05)，減少了鎘引起鱒魚肌肉和鰓組織的毒性。

(2)腐植酸抗病害。利用泥炭、年青褐煤、生化腐植酸原料中含有的植物內(nèi)源激素，如甾醇、萜類、維生素(如VB2、VB6、VB12 V8)、葉酸、肉桂酸、香豆酸、苯氨基酸、氨基嘌呤等，可研發(fā)出腐植酸-維生素復(fù)合型抗病類植物農(nóng)藥，腐植酸-氨基酸復(fù)合型抗病類植物農(nóng)藥，以及腐植酸-核苷酸復(fù)合型抗病類植物農(nóng)藥。

由于維生素、氨基酸的功能是已知的，選擇性地與腐植酸復(fù)合可增加抗病害生物農(nóng)藥的靶向性。如腐植酸中的酚羥基可與氨基酸的氨基、羧基結(jié)合，腐植酸中芳烴的疏水結(jié)構(gòu)可阻止細(xì)菌的侵染，使其具有抑菌性。

核酸屬于生物大分子，核苷酸通常認(rèn)為是小于50 bp的核酸片段，包括反義寡核苷酸、CpC寡核苷酸、Aptamer、Decoy、核酶、siRNA、microRNA等。它具有抑制某些病害基因的功能，有些內(nèi)源性寡核苷酸(如microRNA)還具有疾病診斷和預(yù)后評(píng)估的價(jià)值。除醫(yī)藥應(yīng)用外，核苷酸也是組成腐植酸-生物農(nóng)藥的重要單元。

(3)腐植酸-多糖結(jié)構(gòu)抗病害。業(yè)內(nèi)皆知，植物秸稈生物質(zhì)主要由纖維素(~葡聚糖)、半纖維(~木聚糖)、木質(zhì)素(~腐植酸)組成，通過生物發(fā)酵降解等技術(shù)可以制成葡聚糖、木聚糖、腐植酸等，由于它們?cè)从谕粋€(gè)生命體組織，常常難解難分。而多糖(聚糖)也是國(guó)內(nèi)腐植酸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中要求分離剔除的。近年，美國(guó)、西班牙、法國(guó)的Vaclav Vetvicka等[11]選擇作為免疫調(diào)節(jié)劑已超過50年的β1,3-葡聚糖，利用它的成熟性，研究葡聚糖與腐植酸提高免疫力的協(xié)同作用。該實(shí)驗(yàn)購自的葡聚糖有可溶性葡聚糖和不溶性葡聚糖兩種，其中可溶性葡聚糖源自海帶多糖，不溶性葡聚糖源自酵母。試驗(yàn)所用的腐植酸，一個(gè)提取自捷克共和國(guó)(HZ)的風(fēng)化褐煤，另一個(gè)提取自中國(guó)(HC)的褐煤。Vaclav Vetvicka等[12]對(duì)不同的腐植酸進(jìn)行分離，并根據(jù)國(guó)際腐殖質(zhì)協(xié)會(huì)的程序進(jìn)行純化，并冷凍干燥。同時(shí)用固態(tài)13C-核磁共振(NMR)光譜，元素分析比較HZ與HC結(jié)構(gòu)官能團(tuán)等。雖然，捷克風(fēng)化煤(HZ)與中國(guó)褐煤(HC)的元素及NMR分析結(jié)果有區(qū)別(表1、表2)。

研究結(jié)果顯示，這兩種腐植酸都具有生物免疫調(diào)節(jié)活性，可影響體液和細(xì)胞的免疫反應(yīng)。且HZ和HC在免疫反應(yīng)中都有協(xié)同作用。不過，類似的抗體應(yīng)答發(fā)現(xiàn)HZ在9∶1時(shí)表現(xiàn)出最高的數(shù)值，而HC，在1∶1和1∶9時(shí)均表現(xiàn)出最高的數(shù)值。Vaclav Vetvicka等[13]指出，在他們之前DitteovaG等[14]研究過Vc與β1,3-葡聚糖的作用。該例從某種意義上說，支持了本文中“腐植酸抗病害”介紹的研制生物農(nóng)藥的途徑。從該例等衍生的免疫食品用生物農(nóng)藥品種正在華東理工大學(xué)、上海臻衍生物科技公司試產(chǎn)。

表1　腐植酸樣品的元素分析

注：a采用差減法測(cè)定。

表2　HA樣品的13C-核磁共振(NMR)光譜分析

(4)腐植酸次生代謝物抗病害。赤霉素、吲哚乙酸和丁酸、α-萘乙酸、脫落酸、細(xì)胞分裂素、乙烯利是業(yè)內(nèi)熟悉的生長(zhǎng)素或激素，它可能通過人為施入土壤的農(nóng)藥的分解轉(zhuǎn)化殘留構(gòu)成，也包括腐植酸在微生物菌的作用下，產(chǎn)生次生代謝物。腐植酸類生長(zhǎng)素根據(jù)土壤環(huán)境特征，調(diào)控著不同生長(zhǎng)期作物的生物活性，可形成良性循環(huán)的生物農(nóng)藥抗病效果。

研制生產(chǎn)腐植酸生長(zhǎng)素類農(nóng)藥，可以從風(fēng)化煤、褐煤、泥炭等天然腐植酸原料提取、組合，也可以選擇秸稈類生物質(zhì)原料，采用生物發(fā)酵方式制取。

腐植酸原料中含有的水溶性倍半萜、雙萜、三萜類，通過微生物細(xì)胞膜，干擾了能量代謝的酶促反應(yīng)，影響其能量代謝途徑來達(dá)到抗菌抗病害效果。

腐植酸次生代謝物在抗病蟲害的前提下，對(duì)蔬果品質(zhì)的提高是否有影響？能否等同或優(yōu)于有機(jī)果品？這是腐植酸生物素農(nóng)藥是否擁有市場(chǎng)前景的關(guān)鍵。

3　腐植酸研制殺蟲類生物農(nóng)藥的途徑及應(yīng)用進(jìn)展

殺蟲類生物農(nóng)藥有按病毒分類的，有按昆蟲的病原病毒分類的，也有系列DNA病毒殺蟲劑(NPV、GV、EPV、DNA)、RNA病毒殺蟲劑(CPA、其他RNA)等；而植物類殺蟲劑則按功能分類，如毒素類植物殺蟲劑、拒食類植物殺蟲劑、絕育類植物殺蟲劑等；菌類殺蟲劑中應(yīng)用廣泛的有“蘇云金芽孢桿菌殺蟲劑”等。

腐植酸類生物農(nóng)藥殺蟲劑，不僅可利用腐植酸的吸附性能，毒化、菌絲特化所產(chǎn)生的粘著網(wǎng)、粘著球、收縮環(huán)或非收縮環(huán)等主要捕捉線蟲的機(jī)理，以及真菌寄生于線蟲體內(nèi)，被線蟲食后，在線蟲體內(nèi)腸道發(fā)芽繁殖，使線蟲致死的途徑；還可以利用腐植酸中脂溶性甾類，容易穿透病蟲細(xì)胞膜進(jìn)入病蟲細(xì)胞體內(nèi)，干擾細(xì)胞膜的通透性，引起病蟲細(xì)胞凋亡(apoptosis)。

腐植酸植物類殺蟲劑，可富選番茄堿、胡椒籽、大蒜素、煙堿、除蟲菊素等構(gòu)成生化腐植酸原料，通過生物技術(shù)研發(fā)蟲害毒素類殺蟲劑，拒食類植物殺蟲劑等。

結(jié)合中草藥應(yīng)用的悠久歷史和穩(wěn)定性能，在腐植酸結(jié)構(gòu)組成與作用機(jī)理的支撐下，建立成熟的中草藥-腐植酸生物殺蟲劑生產(chǎn)線，是有遠(yuǎn)景效益的。這方面，國(guó)家863項(xiàng)目“生物源農(nóng)藥創(chuàng)制與技術(shù)集成及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)”，已經(jīng)選澤雷公藤等中草藥在進(jìn)行試驗(yàn)。為首的單位有中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、上海交通大學(xué)農(nóng)學(xué)院、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)、華東理工大學(xué)藥學(xué)院農(nóng)藥室等。

4　展望

以上探討了研制開發(fā)腐植酸生物農(nóng)藥可能的途徑。作為腐植酸系列生物農(nóng)藥，在成為商品藥前，要確定原料藥生產(chǎn)工藝[14，15]、原料藥結(jié)構(gòu)與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、輔料來源與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，包裝材料及容器、穩(wěn)定性試驗(yàn)，并需要有生測(cè)實(shí)驗(yàn)報(bào)告，要有生物農(nóng)藥的殘毒、殘留及安全性的數(shù)據(jù)。包括急性毒性試驗(yàn)，LD50、致敏性、30天致病性試驗(yàn)(常規(guī)項(xiàng)目)，以及農(nóng)藥安全性評(píng)價(jià)、環(huán)境安全(水、土、大氣)評(píng)價(jià)等試驗(yàn)以后，才能進(jìn)行腐植酸-生物農(nóng)藥登記注冊(cè)。

腐植酸在化學(xué)農(nóng)藥中應(yīng)用，在行業(yè)內(nèi)開展已久，從理論到實(shí)踐有不少成果；腐植酸在生物農(nóng)藥中的應(yīng)用，以葉面肥、噴施肥、植物生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)液(生長(zhǎng)素)等形式也悄然開展；腐植酸與生物農(nóng)藥結(jié)合，既有藥效且有肥效的性質(zhì)，但是在國(guó)家尚沒有建立“藥肥”標(biāo)準(zhǔn)的情況下，研制開發(fā)系列腐植酸-生物農(nóng)藥，有恰當(dāng)?shù)姆绞皆u(píng)價(jià)腐植酸生物農(nóng)藥質(zhì)量，推廣應(yīng)用腐植酸環(huán)保型生物農(nóng)藥，對(duì)提升我國(guó)生物農(nóng)藥國(guó)際國(guó)內(nèi)的競(jìng)爭(zhēng)力十分必要。

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