菌種保存可以保持菌種的長期存活、特性穩(wěn)定以及不受污染，對于微生物資源的保護(hù)、利用和研究開發(fā)，意義都非常巨大。菌種保存開始于19世紀(jì)末，最早開始菌種保存的是捷克斯洛伐克的微生物學(xué)家Frantisek Karl。他們利用玻璃管封閉的瓊脂斜面、明膠或土豆的薄切片來保存菌種，并建立了世界上第一個菌種保存室。到目前為止，已建立發(fā)展了許多長期保存菌種的方法，其基本原則都是使細(xì)菌的新陳代謝處于最低或幾乎停止的狀態(tài)，但又具有復(fù)蘇的能力。一般是使細(xì)菌處于低溫、干燥、缺氧和營養(yǎng)成分極度貧乏的環(huán)境條件下，將其新陳代謝限制在最低范圍內(nèi)，使其生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)，使菌種能夠存活、不污染雜菌、不發(fā)生或較少發(fā)生變異，保存菌種原有的生物學(xué)性狀。

現(xiàn)有保存菌種的方法大體分為傳代法、懸液法、普通干燥法、冷凍法、真空干燥法等。各種方法所應(yīng)用的種類和效果各有差異，下面介紹保存海洋細(xì)菌的幾種常用方法。

1.斜面或半固體傳代保藏法

斜面?zhèn)鞔ㄊ亲畛Ｓ玫臅簳r保存方法。把菌種接種到2216E斜面培養(yǎng)基上，在28℃條件下培養(yǎng)過夜，使之長成健壯的菌體。然后用封口膜封口后保存于15℃的環(huán)境中，以后每隔一定時間重新接種傳代一次，就這樣可以保持幾周甚至數(shù)月。有些海洋細(xì)菌尤其是弧菌，在低于10℃、滲透壓變化、寡營養(yǎng)（oligotrophic）（含碳源1～1.5mg/mL）等環(huán)境中，容易形成活的非可培養(yǎng)（viable but nonculturable，VBNC）狀態(tài)，難以用常規(guī)培養(yǎng)法使其恢復(fù)生長。已證實(shí)常見的約20種弧菌均出現(xiàn)了VBNC狀態(tài)，因此不宜將弧菌置于4℃的普通冰箱保存，以免出現(xiàn)“假死”現(xiàn)象。

在斜面或半固體穿刺培養(yǎng)基上，加封一層（2～3cm）無菌液體石蠟，防止培養(yǎng)基干燥并隔絕氧氣，使菌種代謝降低。然后置于15℃培養(yǎng)箱中保存。這樣一般每隔半年需移種傳代一次。接種傳代時，可直接用無菌接種環(huán)挑取斜面上的菌苔，然后在2216E平板上劃線純化，挑取典型單菌落接種斜面即可。

2.冷凍保存法

將培養(yǎng)好的接種斜面，用0.1%的蛋白胨水洗一下菌苔，制成菌懸液（菌濃度達(dá)109 CFU/mL），或直接用液體培養(yǎng)物，加冷凍保護(hù)劑如甘油、二甲亞砜、蔗糖和吐溫-80等，至終濃度為15%（V/V），轉(zhuǎn)移至2mL的塑料菌種保存管中。每個菌種一般保存3～5管，于冷凍后置于－80℃的超低溫冷凍箱，可保存10年以上。也可將加有甘油或二甲基亞砜（DMSO）等保護(hù)劑的菌種管，經(jīng)預(yù)冷凍（低于－60℃）后保存于液氮中（－186℃）。這樣菌種可以保存30年以上，保存期間菌種不易變異，效果很好。該方法已經(jīng)被世界上許多菌種保存機(jī)構(gòu)如美國的ATCC等作為常規(guī)的菌種保存方法應(yīng)用。在沒用超低溫條件的單位，也可以將菌種管保存于－20℃冷凍箱中，這樣也可以保存一年以上。

注意在超低溫保存過程中，一定要經(jīng)過幾級預(yù)冷凍（－20℃，20min；－40℃，20～30min；－60℃，20～30min）處理，最后再長期保存于超低溫（－80℃）的條件下。在置于液氮保存時，最好預(yù)先置于－80℃冷凍箱一段時間，然后置于液氮罐液面以上氣態(tài)部分進(jìn)一步預(yù)冷卻幾分鐘，再置于液氮中長期保存，這樣可以避免細(xì)胞凍傷。菌種復(fù)蘇時，可直接從超低溫條件下取出菌種管，置于室溫條件下解凍，然后取菌懸液涂布平板或平板劃線，培養(yǎng)至長成單菌落。

3.真空冷凍干燥法

將培養(yǎng)好的菌種斜面，加入保護(hù)劑（如脫脂牛奶），制成菌懸液，裝入特制的菌種凍干管中，迅速預(yù)冷凍至低于－70℃。然后置于真空干燥裝置中冷凍干燥，至水分含量在1%～2%?；鹧嫒鄯夤芸冢?℃避光保存。該方法對陸生菌種保存效果較好，一般為數(shù)年至30年，但對海洋細(xì)菌的保存效果稍差。