培養(yǎng)海洋微生物的方法有許多，可采用不同的培養(yǎng)基，但尚未有一種方法能夠適用于所有海洋微生物的培養(yǎng)。海洋異養(yǎng)微生物分離常用培養(yǎng)基為2216E海洋瓊脂培養(yǎng)基。在實(shí)際培養(yǎng)中，往往要根據(jù)所需微生物的生理生化特性，給予合適的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、培養(yǎng)溫度和通氣條件。對(duì)于海洋微生物培養(yǎng)所需的特殊條件，如NaCl含量、壓力條件等必須予以考慮。

2216E 海洋瓊脂（ZoBell 2216Emarine agar）

蛋白胨　　　　　　　5.0g；

酵母膏　　　　　　　1.0g；

FePO4　　　　　　　0.01g；

瓊脂　　　　　　　15.0～20.0g；

陳海水　　　　　　　1000cm3；

pH　　　　　　　7.4～7.8。

需要注意的是，由于天然海水中存在多種殺菌因素，在配制培養(yǎng)基之前，應(yīng)將采集的天然海水在室內(nèi)靜置存放2周以上，使海水中的殺菌因素逐漸消除，固體顆粒性物質(zhì)沉降后，再取上層海水使用。

選擇合適的培養(yǎng)基接種后，針對(duì)不同微生物種類的培養(yǎng)條件也有差異。生長(zhǎng)在深?；蚝涞貐^(qū)的嗜冷菌，培養(yǎng)時(shí)需要低溫，而分布在溫?zé)釒Ш^(qū)的嗜溫菌，培養(yǎng)的適宜溫度一般在25℃～30℃。不同菌種所需的培養(yǎng)時(shí)間也有較大的差別，常見(jiàn)的弧菌及大腸桿菌等在適宜溫度下培養(yǎng)1～2d即可長(zhǎng)出明顯的菌落，而有些嗜冷菌則往往需要培養(yǎng)幾周才能出現(xiàn)肉眼可辨的菌落。

關(guān)于一個(gè)微生物物種的生理學(xué)和生物地球化學(xué)活性機(jī)理方面的數(shù)據(jù)不容易直接從自然界中獲得，只有嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室條件，才能仔細(xì)、系統(tǒng)地檢測(cè)出環(huán)境變化對(duì)微生物生長(zhǎng)和行為的影響，因此將微生物從自然環(huán)境中分離出來(lái)并建立純培養(yǎng)，是研究其形態(tài)特征、生理特性、生態(tài)特性及基因測(cè)序基礎(chǔ)。自從Zobell（1941，1946）開(kāi)拓性地開(kāi)展了海洋細(xì)菌的培養(yǎng)工作以來(lái)，隨著對(duì)海洋微生物的生理特性和生態(tài)要求認(rèn)識(shí)的不斷深入，海洋微生物的培養(yǎng)技術(shù)有了很大的改進(jìn)，越來(lái)越多的微生物被分離出來(lái)，獲得了純培養(yǎng)。雖然有許多方法可用來(lái)培養(yǎng)海洋環(huán)境中的微生物，但沒(méi)有任何一種單獨(dú)的方法能夠適用于所有的微生物種類。一種方法只能培養(yǎng)全部海洋微生物群落中的一小部分，應(yīng)用多種培養(yǎng)技術(shù)才能得出有意義的數(shù)據(jù)。

針對(duì)海洋中難培養(yǎng)的微生物，近年來(lái)，研究者發(fā)明了許多新型培養(yǎng)方法，能分離到許多新菌種的方法大都是通過(guò)模擬自然條件的生存環(huán)境，對(duì)環(huán)境中的微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，再轉(zhuǎn)移至普通平板進(jìn)行分離純化。雖然這種方法能提高分離得到難培養(yǎng)細(xì)菌的概率，但是還有許多難培養(yǎng)的細(xì)菌可能要依靠同一環(huán)境中其他菌株的存在才能生長(zhǎng)，這些因?yàn)橐休o助菌株的存在才能形成菌落的細(xì)菌大多未能單獨(dú)分離純化得到。目前，即使在國(guó)外，許多研究似乎只是停留在對(duì)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行鑒定和分類的層面上，并未對(duì)難培養(yǎng)、未培養(yǎng)細(xì)菌的可培養(yǎng)機(jī)理進(jìn)行深入研究。因此，對(duì)于分離得到的難培養(yǎng)、未培養(yǎng)細(xì)菌，深入關(guān)注其培養(yǎng)成活的原因是一個(gè)有困難但卻極具意義的課題。是培養(yǎng)基的成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、氧氣要求、pH要求等常見(jiàn)問(wèn)題，還是受環(huán)境中其他細(xì)菌分泌的某種糖類、肽類等影響因子的控制等細(xì)節(jié)問(wèn)題，這些都需要進(jìn)行深入研究。

1.極限稀釋培養(yǎng)

1993年Button 等首先利用稀釋培養(yǎng)法（dilution culture）從海洋環(huán)境中分離得到兩種新的寡營(yíng)養(yǎng)異氧菌Sphingomonas alaskensis 和Cycloclasticus oligotrophus。稀釋培養(yǎng)法是從概率論的角度出發(fā)而提出的一個(gè)新方法，即利用環(huán)境樣品不斷稀釋濃度，當(dāng)把樣品中微生物群體總數(shù)稀釋至一定濃度時(shí)，主要存在的寡營(yíng)養(yǎng)微生物可以不受少數(shù)優(yōu)勢(shì)微生物的抑制、競(jìng)爭(zhēng)作用等的干擾，因而大大提高主體寡營(yíng)養(yǎng)微生物被培養(yǎng)的可能性。利用這種方法，舒特等也從海洋水體中分離得到典型的海洋細(xì)菌Sphingomonas alaskensis（菌株RB2256）。

2.高通量篩選技術(shù)

應(yīng)用高通量分離培養(yǎng)技術(shù)有望培養(yǎng)出許多以前未被培養(yǎng)出來(lái)的微生物種類，事實(shí)證明海水樣品中多達(dá)14%的微生物細(xì)胞可用高通量分離培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)出來(lái)。高通量分離培養(yǎng)技術(shù)一般采用微孔板結(jié)合以流式細(xì)胞儀檢測(cè)，這樣可增加細(xì)胞檢測(cè)的靈敏度，縮短低生長(zhǎng)率細(xì)胞的培養(yǎng)時(shí)間。其中，美國(guó)Diversa公司建立的高通量分離培養(yǎng)技術(shù)是先制備包埋單個(gè)微生物細(xì)胞的瓊脂糖微囊，然后將包埋在微囊中的微生物在緩慢流動(dòng)的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)含有微菌落的微囊。在以上方法中，以美國(guó)Diversa公司建立的高通量分離培養(yǎng)技術(shù)最有發(fā)展前景。

3.微孔濾膜貼膜法

過(guò)濾的方法常常用于大量水樣中含有較少細(xì)菌的樣品的計(jì)數(shù)。過(guò)濾的機(jī)械作用會(huì)損傷或殺死一些細(xì)菌，不同品牌質(zhì)量的濾膜也可能影響計(jì)數(shù)結(jié)果。此外，細(xì)菌個(gè)體小于濾孔的直徑時(shí)，這部分細(xì)菌就不能留在濾膜上，造成計(jì)數(shù)結(jié)果偏低。目前計(jì)數(shù)海洋細(xì)菌時(shí)通常選用孔徑為0.22μm的微孔濾膜。計(jì)數(shù)結(jié)果也受培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的影響。這種方法特別適合于計(jì)數(shù)含菌量極少的大洋水樣。如果使用特殊的選擇性培養(yǎng)基，還可以用來(lái)分離含量極少的特殊細(xì)菌，如分離海洋與河口樣品中的霍亂弧菌、副溶血弧菌等。

4.凝膠微滴培養(yǎng)法

凝膠微滴培養(yǎng)法也叫作單細(xì)胞封裝培養(yǎng)法。最初是應(yīng)用于海洋微生物的分離研究。該方法主要是利用凝膠微滴技術(shù)對(duì)環(huán)境中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行包埋，并結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行篩選分離的高通量培養(yǎng)方法。Zengler 等利用該方法，將稀釋到一定濃度的菌液與融化的瓊脂糖混合，制成包埋單個(gè)微生物細(xì)胞的瓊脂糖微囊，然后將微囊裝入凝膠柱內(nèi)，用自然培養(yǎng)液進(jìn)行流動(dòng)培養(yǎng)。最后對(duì)所有培養(yǎng)分離得到的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA序列分析，結(jié)果表明該方法能分離得到種類廣泛的海洋細(xì)菌，如SAR11分支、Cytophaga分支、SAR116分支等，并且在分離得到的150株細(xì)菌中，只有71株細(xì)菌是分類于常見(jiàn)的細(xì)菌分支中，另外許多細(xì)菌則是之前未被培養(yǎng)出來(lái)的，也不存在于環(huán)境基因組庫(kù)中。該方法允許被分離的細(xì)胞處于環(huán)境營(yíng)養(yǎng)條件下進(jìn)行生長(zhǎng)，因此能分離得到許多有生存能力但不可培養(yǎng)的微生物。

5.模擬自然環(huán)境的擴(kuò)散盒培養(yǎng)法

2002年，Kaeberlein 等通過(guò)模擬海洋微生物自然生長(zhǎng)的環(huán)境，設(shè)計(jì)了一種名為擴(kuò)散生長(zhǎng)盒（diffusion growth chamber）的培養(yǎng)裝置。該擴(kuò)散盒由一個(gè)環(huán)狀的不銹鋼墊圈和兩側(cè)膠連的孔徑為0.03μm 的濾膜組成。具體操作是將被分離的環(huán)境樣品放置于封閉的擴(kuò)散盒中，并在模擬采樣點(diǎn)環(huán)境條件的玻璃缸中進(jìn)行培養(yǎng)。擴(kuò)散盒濾膜的孔徑大小可使盒內(nèi)與盒外互相有益的小分子代謝物自由出入，但是細(xì)胞不能自由移動(dòng)。Kaeberlein 等通過(guò)這種方法，分離到一株新的菌株，16S rDNA 序列比對(duì)親緣關(guān)系最近的是Lewinella persica，序列相似性只有93%。該菌株不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而要在有其他菌株存在下即共培養(yǎng)的條件下才能形成菌落。