由于百里香屬植物具有豐富的生態(tài)多樣性及化學(xué)多型性的特點(diǎn)，而且很容易發(fā)生近緣種間的雜交和基因滲透，給部分種特別是近緣種的分類及系統(tǒng)地位的確定帶來(lái)了較大的困難（Thompson et al.，1998）。特別是對(duì)于地椒、地椒亞洲變種、地椒展毛變種和百里香這幾個(gè)種（變種）的植物學(xué)分類和鑒定更加復(fù)雜，這些種（變種）在屬內(nèi)的親緣關(guān)系和系統(tǒng)地位一直不夠明確。分子生物學(xué)技術(shù)為從分子水平揭示生物系統(tǒng)進(jìn)化的本質(zhì)提供了可能，在系統(tǒng)重建和探討用經(jīng)典分類學(xué)難以確定的一些分類問(wèn)題方面發(fā)揮了重要的作用，已被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)學(xué)的研究中（阮成江等，2005）。轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）是核糖體基因中位于核糖體大小亞基之間，核糖體小亞基與5S rRNA之間的區(qū)域，由于不加入成熟核糖體，受到的選擇壓力較小，進(jìn)化速度較快，常用于種和亞種的系統(tǒng)分析，這一領(lǐng)域的研究在國(guó)內(nèi)外均取得了重要進(jìn)展（王林玲等，2006；薛華杰等，2007；喻達(dá)輝等，2006；張利等，2007；Ainouche et al.，1997；Baldwin et al.，1995；Shi et al.，2002）。ISSR （Inter Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增）分子標(biāo)記技術(shù)因其具有快速、簡(jiǎn)便、可靠以及可以揭示出比RAPD、RFLP、SSR等標(biāo)記更高的多態(tài)性等特點(diǎn)，也已被廣泛用于多種植物的種間及種下居群間的系統(tǒng)進(jìn)化和親緣關(guān)系研究之中（李萍等，2007；楊小艷等，2007；朱云華等，2007）。本研究擬采用以上兩種分子系統(tǒng)學(xué)的研究方法，將核糖體ITS轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列測(cè)定與ISSR分子多態(tài)性分析技術(shù)相結(jié)合，其結(jié)果可為中國(guó)野生百里香屬植物資源的分類和系統(tǒng)進(jìn)化學(xué)研究及屬下近緣種和變種的分子鑒定提供一定的理論依據(jù)。

將ITS序列分析和SRAP分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，對(duì)20份分布于中國(guó)的野生百里香屬資源（5個(gè)種2個(gè)變種）及2份國(guó)外百里香屬資源（2個(gè)種）進(jìn)行了屬內(nèi)種間及種下水平的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系研究。得到如下結(jié)果：以牛至（Origanum vulgare）為外類群的ITS區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)能較好地說(shuō)明百里香屬種間的親緣關(guān)系，可將9個(gè)種（包括2個(gè)變種）中的5個(gè)明顯分開(kāi)并單獨(dú)聚為一組；地椒、地椒亞洲變種、百里香和鋪地百里香聚為一組，得到94%的自展支持率，表現(xiàn)為較近的親緣關(guān)系。同時(shí)地椒懷遠(yuǎn)居群和地椒展毛變種興凱湖居群各聚為單獨(dú)的一組，位于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的底部，自展支持率達(dá)到100%，與其他材料間遺傳距離有顯著的遺傳差異。進(jìn)一步對(duì)地椒、地椒亞洲變種、百里香以及地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群進(jìn)行ISSR遺傳多態(tài)性及聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群仍各自單獨(dú)聚為一組，與地椒、地椒亞洲變種、百里香三者之間的遺傳相似度較低；地椒與地椒變種各自聚在一起后共同聚為一組，百里香單獨(dú)聚為一組。將本試驗(yàn)結(jié)果結(jié)合野外考查及形態(tài)學(xué)觀測(cè)比較，我們認(rèn)為，地椒、地椒亞洲變種和百里香三者屬于近緣種，并與國(guó)外的鋪地百里香有很近的親緣關(guān)系，故有些文獻(xiàn)將以上三種均列為鋪地百里香的變種是有一定理由的；其次地椒展毛變種興凱湖居群無(wú)論從形態(tài)學(xué)比較、地理分布，還是從ITS序列及ISSR多態(tài)性分析看均與其他種及變種間有很大的形態(tài)及遺傳差異，支持《東北植物志》將其從地椒展毛變種中分出，列為單獨(dú)的一個(gè)種；另外地椒懷遠(yuǎn)居群雖然從形態(tài)上與地椒和百里香很相似，但野外調(diào)查結(jié)合本研究結(jié)果均表明，地椒懷遠(yuǎn)居群在遺傳背景及分布生境上有很大的特殊性，屬于中國(guó)百里香屬中較為進(jìn)化的類群，其在百里香屬植物中的系統(tǒng)地位還需進(jìn)一步研究。

一、試驗(yàn)方法

（一）供試材料

本試驗(yàn)包括7個(gè)種2個(gè)變種及部分種下居群共計(jì)20份材料（表1）。其中1～17號(hào)材料均為野外實(shí)地采集獲得，18號(hào)材料來(lái)自新疆中藥民族藥研究所標(biāo)本室，19號(hào)、20號(hào)材料來(lái)自新疆石河子大學(xué)種苗快繁基地。以上憑證標(biāo)本均保存于江蘇省中國(guó)科學(xué)院植物研究所標(biāo)本館中。每份材料選取2個(gè)單株用于ISSR標(biāo)記分析，ITS測(cè)序?yàn)闊o(wú)性系單株的混合樣。野外采摘的幼嫩莖端葉片部分以及標(biāo)本上取得的干燥葉片，均放入變色硅膠后密封帶回，充分干燥后存放于－80℃冰箱中待用。

表1　試驗(yàn)材料基本情況

（續(xù)表）

（二）DNA提取與質(zhì)量測(cè)定

野外采集的葉片采用改進(jìn)后的周延清（2005）的CTAB快速提取法提取DNA，在2%的CTAB提取液中加入等體積3%的β-巰基乙醇，并用等體積的氯仿—異戊醇混合液（V氯仿∶V異戊醇=24∶1）抽提兩次；標(biāo)本上采集的葉片均使用南京天威公司的DNA提取試劑盒提取。以上方法獲得的DNA進(jìn)行以λDNA濃度為參照的1.0%的瓊脂糖電泳，檢測(cè)DNA的純度及含量，將供試的DNA用TE稀釋至20～30 ng·μL-1后存放于-20℃環(huán)境下備用。

（三）ITS的PCR擴(kuò)增測(cè)序及分析

ITS區(qū)引物序列為ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'），直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)在PE-9700上進(jìn)行，20μL反應(yīng)體系如下：60 ng DNA模板，2.5mmol·L-1mgC12，0.15mmol·L-1dNTP，0.3mmol·L-1引物，Taq酶1.25 U，10×Buffer。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃3min；94 ℃45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃1min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃5min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠系統(tǒng)觀測(cè)，Gel Doc圖像分析儀觀察。PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒回收純化后直接測(cè)序，測(cè)序引物為PCR引物。引物合成及ITS序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

各材料測(cè)定的ITS序列結(jié)果與GenBank中的百里香屬植物的ITS序列進(jìn)行Sequencer軟件比對(duì)，確定序列范圍及間隔區(qū)的位置，將序列對(duì)位排列并輔以人工校對(duì)，采用MEGA 3.1軟件中的最大簡(jiǎn)約法（Maximum Parsimonymethod）與鄰接法（Neighbor-joiningmethod）構(gòu)建ITS樹(shù)，進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。在最大簡(jiǎn)約法分析中，采用樹(shù)二組重新連接（TBR）、啟發(fā)式搜索（Heuristic search）、隨機(jī)添加100次重復(fù)、自展（Bootstrap）重復(fù)1000次等選項(xiàng)完成。在鄰接法分析中，計(jì)算各序列間的分化距離，并用自展法進(jìn)行檢測(cè)，自展數(shù)據(jù)集為1000次。以上分析中空位（gap）均作缺失（missing）處理。在構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)時(shí)，以GeneBank上公布的近緣屬牛至屬（Origanum）的牛至作為外類群。

（四）ISSR引物的篩選、PCR擴(kuò)增及數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)所用的90個(gè)ISSR引物參考美國(guó)哥倫比亞大學(xué)UBC公司公布的ISSR引物序列合成。

ISSR-PCR反應(yīng)體系為：在20 μL的基礎(chǔ)擴(kuò)增反應(yīng)體系中，DNA為30 ng，Mg2+為2.5mmol·L-1，dNTPs為0.15mmol·L-1，引物為0.4mmol·L-1，Taq DNA聚合酶為1 U，10×Buffer 2 μL。然后加入1滴石蠟油離心后放入基因擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性3min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1min 30 s，38個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸5min，4 ℃保存。對(duì)ISSR-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.3%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照，Gel Doc圖像分析儀觀察。

對(duì)ISSR-PCR擴(kuò)增條帶進(jìn)行人工統(tǒng)計(jì)，在某一位點(diǎn)上依據(jù)條帶的有或無(wú)分別記為1或0，輸入Excel表中形成二元數(shù)據(jù)矩陣，在此數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上采用POPGENE Version 1.31軟件計(jì)算出供試材料的多態(tài)位點(diǎn)百分率（Percentage of Polymorphic Bands）及Nei's 遺傳距離（Genetic Distance）和遺傳一致度（Genetic Identity），采用MEGA 3.1軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析。

二、結(jié)果與分析

（一）百里香屬植物種間的ITS序列分析

1.百里香屬植物的ITS序列特征

對(duì)20份不同來(lái)源的百里香屬材料（包括7個(gè)種2個(gè)變種）進(jìn)行ITS序列的統(tǒng)計(jì)分析表明，供試百里香屬材料的ITS序列長(zhǎng)度（包括ITSl，5.8S及 ITS2的全長(zhǎng)序列以及18S、26S的部分序列）變化范圍為653～701 bp，經(jīng)Sequencer軟件對(duì)位排列并輔以人工矯正后，得到601 bp的ITS全長(zhǎng)用于分析比較，其中ITS1、5.8S和ITS2的序列長(zhǎng)度分別為192 bp、164 bp和241 bp（表2）。在不引進(jìn)外類群時(shí)，變異位點(diǎn)數(shù)為75個(gè)，其中信息位點(diǎn)數(shù)為26個(gè)，占全序列的4.3%，單核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)為49個(gè)，占全序列的8.2%。所有信息位點(diǎn)的96%都分布在ITS2間隔區(qū)內(nèi)，且無(wú)論有無(wú)外類群存在，在5.8S范圍均無(wú)信息位點(diǎn)，只有部分單核苷酸變異位點(diǎn)存在，說(shuō)明5.8S具有很好的保守性，百里香屬種間ITS序列變異主要存在于ITS2間隔區(qū)內(nèi)。

表2　試驗(yàn)材料ITS序列特征分析

注：VN表示變異位點(diǎn)數(shù)；PiN表示信息位點(diǎn)數(shù)；SN表示單核苷酸變異位點(diǎn)數(shù)

2.基于ITS序列的百里香屬種間遺傳距離分析及分子系統(tǒng)樹(shù)的構(gòu)建

對(duì)供試百里香屬植物的ITS序列統(tǒng)計(jì)表明，百里香屬內(nèi)種間堿基差異百分率為2.6%，其中轉(zhuǎn)換率為1.9%，顛換率為0.7%；屬內(nèi)各物種間遺傳分化距離的變異范圍為0.000～0.169，平均值為0.026。地椒、地椒亞洲變種和百里香之間的遺傳分化距離均為0.000，另外這3個(gè)種與國(guó)外的鋪地百里香之間雖然有遺傳分化存在，但遺傳分化距離值僅為0.002，根據(jù)屈良鵠（1999）等發(fā)表的被子植物大多數(shù)科屬的ITS序列的屬內(nèi)種間差異值為0.012～0.102，說(shuō)明地椒、地椒亞洲變種、百里香和鋪地百里香之間親緣關(guān)系很近。屬內(nèi)其他種間遺傳分化距離均大于0.016，值得注意的是，地椒懷遠(yuǎn)居群和地椒展毛變種的興凱湖居群與其他種及變種間的遺傳分化距離均達(dá)到0.055以上，最高達(dá)到0.145。

根據(jù)ITS序列以近緣牛至屬植物牛至作為外類群通過(guò)鄰接法和最大簡(jiǎn)約法分別構(gòu)建N-J鄰接（Neighbor Joining）樹(shù)和MP（Maximum Parsimony）樹(shù)，所構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)有著相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，本研究選擇N-J鄰接樹(shù)（圖1）進(jìn)行供試百里香屬的分子系統(tǒng)親緣關(guān)系分析。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，地椒（除懷遠(yuǎn)居群）、地椒亞洲變種、百里香和鋪地百里香聚為相同的一組無(wú)法再分，自展值達(dá)96%，說(shuō)明它們之間確實(shí)具有很高的遺傳相似度，親緣關(guān)系很近，ITS序列分析也無(wú)法將其區(qū)分開(kāi)；短節(jié)百里香、黑龍江百里香、異株百里香和法國(guó)百里香各單獨(dú)聚為一組，自展支持率分別為97%、75%、67%和99%；地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群聚為一組，處于系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的底部，自展支持率達(dá)100%，與其他材料之間遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖1　基于核糖體ITS序列的百里香屬系統(tǒng)樹(shù)

注：**表示外類群；分支上的數(shù)值代表自展支持率；材料編號(hào)同表1

（二）基于ISSR多態(tài)性標(biāo)記的百里香屬近緣種種間及居群間的親緣關(guān)系分析

由于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)無(wú)法將中國(guó)百里香屬內(nèi)地椒、地椒亞洲變種及百里香三者之間很好地區(qū)分。為更好地了解地椒、地椒亞洲變種及百里香系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系，進(jìn)一步探明地椒懷遠(yuǎn)居群和地椒展毛變種（興凱湖居群）在中國(guó)百里香屬植物中的系統(tǒng)地位，對(duì)以上百里香屬近緣種種間及種下居群間進(jìn)行了如下ISSR多態(tài)性比較與聚類分析。

1.ISSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

從90條ISSR引物中選出擴(kuò)增片段清晰、多態(tài)性和重復(fù)性較好的10條ISSR引物對(duì)百里香屬地椒、地椒亞洲變種、地椒展毛變種及百里香進(jìn)行種間及種內(nèi)居群間的擴(kuò)增比較及數(shù)據(jù)分析，引物序列及檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)見(jiàn)表3。10條ISSR引物共擴(kuò)增96個(gè)條帶，其中多態(tài)性條帶為84個(gè)，多態(tài)性條帶百分比為87.5%，不同引物擴(kuò)增的DNA大小在200～1500 bp之間。引物ISSR-56的ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2。

表3　ISSR引物序列及條帶統(tǒng)計(jì)

圖2　引物ISSR-56對(duì)百里香屬近緣種及居群的ISSR擴(kuò)增圖譜

注：M為2000 bp DNA Ladder；1～15為百里香屬不同材料，每份材料2個(gè)單株

2.基于ISSR標(biāo)記的遺傳距離及聚類分析

對(duì)百里香屬地椒、地椒亞洲變種、地椒展毛變種及百里香的ISSR標(biāo)記的遺傳距離分析表明，地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群與其他材料間的遺傳距離顯著高出種內(nèi)其他材料間的遺傳距離，其變化范圍分別為0.4654～0.6869和0.3355～0.5588；地椒、地椒亞洲變種和百里香間的遺傳距離相對(duì)較近，其中地椒和地椒亞洲變種間的遺傳距離變化范圍為0.1371～0.3537，百里香與地椒間的遺傳距離變化范圍為0.1418～0.3514，百里香與地椒亞洲變種間的遺傳距離變化范圍為0.1418～0.3514；地椒、地椒亞洲變種及百里香的種（變種）下不同居群的遺傳距離也較近，變化范圍分別為0.1070～0.3103、0.1342～0.1878和0.1568～0.3170，且種群間聚類與地理分布距離表現(xiàn)出一定相關(guān)性。

POPGENE聚類分析也很好地體現(xiàn)出以上材料間的遺傳關(guān)系（圖3），地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群各單獨(dú)聚為A、B兩支，百里香、地椒和地椒亞洲變種共同聚為C組，在C組之下百里香不同居群聚為一組C1，地椒與地椒亞洲變種聚為一組C2，在C2組內(nèi)地椒與地椒亞洲變種又各自聚在一起。以上結(jié)果再次表明地椒展毛變種興凱湖居群和地椒懷遠(yuǎn)居群與其他材料間確實(shí)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，而地椒、地椒亞洲變種和百里香三者之間遺傳關(guān)系較近，屬于近緣種。

圖3　百里香屬近緣種種間及居群間ISSR標(biāo)記聚類圖

注：圖中材料編號(hào)同表1

三、討論

（一）各試驗(yàn)材料的系統(tǒng)地位及親緣關(guān)系

百里香屬植物在中國(guó)長(zhǎng)江以北的各省均記載有分布，但在《中國(guó)植物志》記載的12個(gè)種中，有3個(gè)種僅在新疆有分布，有6個(gè)種僅在黑龍江、內(nèi)蒙古東北部有分布，其他地區(qū)分布的百里香屬植物均為地椒、地椒變種或百里香，且這幾個(gè)種（變種）往往有著共同的地理分布區(qū)域。通過(guò)前期對(duì)大量百里香屬植物的標(biāo)本查閱和野外調(diào)查工作發(fā)現(xiàn)，中國(guó)百里香屬的地椒、地椒亞洲變種和百里香這3個(gè)種（變種）有著廣泛的生態(tài)適應(yīng)性，且生態(tài)多型性較為明顯。本研究結(jié)果也表明，雖然通過(guò)ITS序列分析能較好地說(shuō)明供試百里香屬種間親緣關(guān)系，卻無(wú)法將地椒、地椒亞洲變種和百里香種分開(kāi)。結(jié)合進(jìn)一步ISSR標(biāo)記多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)，中國(guó)百里香屬地椒、地椒亞洲變種和百里香之間確實(shí)有著很近的親緣關(guān)系，這可能是長(zhǎng)期天然雜交和基因交流造成的結(jié)果?；贗ST序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析還表明，這3個(gè)種（變種）與國(guó)外的鋪地百里香有著很近的親緣關(guān)系。Bean（1980）認(rèn)為鋪地百里香是一個(gè)非常復(fù)雜的類群，可以把分布于歐洲大陸到東亞的許多百里香屬植物均看作屬于這一類群。因此從以上分析看，國(guó)內(nèi)有些文獻(xiàn)將地椒、地椒亞洲變種和百里香均列為鋪地百里香的變種是有一定理由的，但以上解釋仍不夠充分，要真正明確它們?cè)诎倮锵銓賰?nèi)的系統(tǒng)地位還需要更多證據(jù)。

（二）地椒展毛變種興凱湖居群的系統(tǒng)學(xué)地位

關(guān)于地椒展毛變種興凱湖居群的系統(tǒng)學(xué)地位應(yīng)給予重新考慮。《中國(guó)植物志》中將興凱湖百里香作為地椒展毛變種加以對(duì)待，而《東北植物志》則支持興凱湖百里香作為一個(gè)獨(dú)立的種。野外調(diào)查及觀測(cè)表明，興凱湖百里香生長(zhǎng)于黑龍江興凱湖岸邊的沙堤之上，具有獨(dú)特的生境分布，而且在葉色、葉形、揮發(fā)性氣味及植株形態(tài)等方面均與地椒有很大差異。從本試驗(yàn)分析也可以看出，興凱湖百里香居群不僅與地椒和地椒亞洲變種之間有較大的遺傳差異，而且與百里香屬內(nèi)其他種間也存在較大的遺傳分化，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)和聚類分析均將其明確列為單獨(dú)一支。綜合以上分析，我們認(rèn)為應(yīng)重新明確地椒展毛變種興凱湖居群在百里香屬內(nèi)的系統(tǒng)學(xué)地位，不應(yīng)將其看為地椒種的變種——地椒展毛變種，而支持《東北植物志》中將其當(dāng)作獨(dú)立的種——興凱湖百里香（T.przewalskii）予以對(duì)待。由于地椒展毛變種的其他種群材料未能收集到，故地椒展毛變種與百里香屬其他種及變種間的親緣關(guān)系及系統(tǒng)地位的確定仍需進(jìn)一步研究。

（三）地椒懷遠(yuǎn)居群在百里香屬中的分類地位

地椒懷遠(yuǎn)居群在百里香屬中的分類地位急需進(jìn)一步明確。田自強(qiáng)等于1996年在安徽懷遠(yuǎn)縣首次發(fā)現(xiàn)有百里香的分布并將其歸入地椒種中（田自強(qiáng)等，2001）。本試驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)該種的分類地位卻提出很大的疑問(wèn)。首先，通過(guò)ITS序列分析及構(gòu)建的系統(tǒng)樹(shù)表明，地椒懷遠(yuǎn)居群與百里香屬其他種間遺傳距離較遠(yuǎn)，而與地椒展毛變種興凱湖居群聚為一組，有著較近的親緣關(guān)系，均屬于較為進(jìn)化的類型。ISSR標(biāo)記的聚類結(jié)果也表明，地椒懷遠(yuǎn)居群與地椒、地椒變種和百里香三者之間表現(xiàn)為種一級(jí)的聚類，地椒懷遠(yuǎn)居群被單獨(dú)聚為一組，而另外3個(gè)種（變種）被聚為一組；其次野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)，安徽懷遠(yuǎn)是中國(guó)百里香屬植物的最南端分布地區(qū)，位于淮河南岸的涂山上，這里屬于溫帶半濕潤(rùn)氣候類型，在整體的生境方面與其他任何分布區(qū)均有很大差異。基于以上研究結(jié)果我們推測(cè)，雖然從植物形態(tài)學(xué)分類上很難將地椒懷遠(yuǎn)居群與地椒、地椒亞洲變種和百里香區(qū)分開(kāi)來(lái)，但由于在外部生境與內(nèi)部DNA水平變異的綜合作用下，地椒懷遠(yuǎn)居群在群體水平上發(fā)生了很大的遺傳分化，極有可能已經(jīng)進(jìn)化為一個(gè)新的種或變種。相反地椒懷遠(yuǎn)居群雖然與興凱湖百里香在形態(tài)上差別很大，但I(xiàn)TS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)卻將兩者聚為一組（自展支持率達(dá)100%），且兩者均為百里香屬中較為進(jìn)化的類群，兩者有著較近的親緣關(guān)系。因此對(duì)懷遠(yuǎn)居群在中國(guó)百里香屬內(nèi)的分類地位的確定以及與興凱湖百里香之間的親緣關(guān)系問(wèn)題，還需結(jié)合孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)、植物化學(xué)等多方面的證據(jù)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

（四）分子系統(tǒng)學(xué)研究方法在植物分類中的應(yīng)用

目前分子系統(tǒng)學(xué)的研究方法在植物系統(tǒng)分類及親緣關(guān)系研究方面得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，已成為植物分類學(xué)的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。但需要注意的是，針對(duì)不同植物及不同分類地位的系統(tǒng)學(xué)研究要選擇適合的DNA序列和分子標(biāo)記方法，否則會(huì)導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果混亂甚至結(jié)果不可信。從本試驗(yàn)研究可以看出，將核糖體ITS序列分析和ISSR分子標(biāo)記的技術(shù)相結(jié)合，綜合地進(jìn)行百里香屬內(nèi)種（變種）間及種下居群間系統(tǒng)進(jìn)化及親緣關(guān)系的研究是較為完整和可行的。