百里香離體多倍化誘導(dǎo)技術(shù)研究_中國(guó)百里香屬植物

一、研究方法

（一）試驗(yàn)材料及離體培養(yǎng)

試驗(yàn)材料采用田間百里香當(dāng)年新發(fā)的半木質(zhì)化莖段為外植體，經(jīng)外植體誘導(dǎo)并繼代獲得整齊一致的組培苗。組培苗培養(yǎng)條件如下：將百里香新梢莖段接種在MS+6-BA（1mg/L）+ IBA（0.05mg/L）的基本培養(yǎng)基上進(jìn)行初代培養(yǎng)，再采用如下配方：1/2MS+6-BA（2mg/L）+ IBA（0.2mg/L），附加6%的瓊脂和25%的蔗糖，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)，進(jìn)行3次增殖繼代培養(yǎng)獲得。pH在滅菌前調(diào)整到5.8，培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照時(shí)間為12～14 h·d-1，光照強(qiáng)度為1400 lx。

（二）離體誘導(dǎo)方法

1.浸泡法

將配制的1.00%的秋水仙素溶液于超凈工作臺(tái)上過(guò)濾滅菌，然后用無(wú)菌水稀釋成0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.20%的秋水仙素溶液各100mL備用。

（1）在無(wú)菌條件下，將生長(zhǎng)一致性較好的百里香叢生芽切割成含3～5個(gè)芽的叢芽（芽高1～1.5 cm），分別浸泡于濃度為0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.20%的秋水仙素溶液中，每一濃度再分為浸泡6 h、12 h、24 h；之后用無(wú)菌水沖洗4～6次，用濾紙（滅菌）吸干接種于1/2MS+6-BA（0.5mg/L）+ IBA（0.2mg/L）+ASA（1mg/L）培養(yǎng)基上，附加6%的瓊脂和25%的蔗糖，每個(gè)處理3瓶，每瓶7個(gè)叢芽，處理完畢后，接入不含秋水仙素的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

（2）將生長(zhǎng)一致性較好的百里香單苗剪成單個(gè)莖段，分別浸泡于濃度為0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.20%的秋水仙素溶液中，每一濃度再分別浸泡3 h、6 h、12 h、24 h；之后無(wú)菌水沖洗4～6次，用濾紙（滅菌）吸干接種于1/2MS+6-BA（0.1mg/L）+ IBA（0.2mg/L）+ASA（1mg/L）培養(yǎng)基上，附加6%的瓊脂和25%的蔗糖，每個(gè)處理3瓶，每瓶7個(gè)莖段，處理完畢后，接入不含秋水仙素的相同培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

對(duì)以上浸泡法處理的外植體培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)死亡率［死亡率=（死亡苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］、變異率［變異率=（變異苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］以及生長(zhǎng)狀況。

2.培養(yǎng)基添加法

（1）選擇含3～5個(gè)高為1～1.5 cm、生長(zhǎng)一致性較好的叢芽接種到秋水仙素濃度分別為0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.20%的固體培養(yǎng)基1/2MS+6-BA（0.5mg/L）+ IBA（0.2mg/L）+ASA（1mg/L）中，附加6%的瓊脂和25%的蔗糖，分別處理7 d和14 d，每個(gè)處理3瓶，每瓶7個(gè)叢芽，處理完畢后，轉(zhuǎn)接到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)死亡率［死亡率=（死亡苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］，變異率［變異率=（變異苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］、增殖率［增殖率=（增殖芽數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］以及生長(zhǎng)狀況。

（2）將生長(zhǎng)一致性較好的百里香單苗剪成單個(gè)莖段，接種到秋水仙素濃度分別為0.00%、0.01%、0.02%、0.05%、0.10%和0.20%的固體培養(yǎng)基1/2MS+6-BA（0.1mg/L）+ IBA（0.2mg/L）+ASA（1mg/L）中，附加6%的瓊脂和25%的蔗糖，分別處理7 d和14 d，每個(gè)處理3瓶，每瓶7個(gè)莖段，處理完畢后轉(zhuǎn)接到不含秋水仙素的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)死亡率［死亡率=（死亡苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］，變異率［變異率=（變異苗數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］、增殖率［增殖率=（增殖芽數(shù)/接種苗數(shù)）×100%］以及生長(zhǎng)狀況。

3.統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)以上數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 17.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

二、結(jié)果與分析

（一）秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)離體百里香多倍化誘導(dǎo)效果的比較

1.秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)離體百里香叢芽生長(zhǎng)效果的影響

各處理的百里香叢芽在正常分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后與對(duì)照相比發(fā)現(xiàn)，處理過(guò)的大部分叢芽變粗、葉片變寬、畸形（圖1）。隨著處理濃度的增加，叢芽受秋水仙素毒害的程度越來(lái)越嚴(yán)重，死亡率呈上升趨勢(shì)。秋水仙素處理7 d的各濃度中，在濃度為0.10%和0.20%的處理中出現(xiàn)叢芽死亡現(xiàn)象。而在處理14 d的各濃度中，濃度在0.01%～0.20%的處理中均有叢芽不同程度的死亡。在附加0.20%的秋水仙素處理14 d的培養(yǎng)基中出現(xiàn)叢芽全部死亡的現(xiàn)象。在試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，秋水仙素對(duì)百里香叢芽的生長(zhǎng)均產(chǎn)生不同程度的抑制，主要表現(xiàn)為叢芽增殖率降低、生長(zhǎng)緩慢，相同時(shí)間內(nèi)對(duì)照的叢芽增殖明顯，最高為88.57%。處理過(guò)的叢芽分化較少，而且隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間的增加，分化的芽最終趨于褐化死亡。由方差分析可知，與對(duì)照相比，各處理的增殖率和死亡率均存在顯著差異（表1、表2）。

圖1　秋水仙素處理后叢芽轉(zhuǎn)入正常分化培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況

注：CK1、1～5、CK3、a～e為秋水仙素處理后接入正常分化培養(yǎng)基0 d的情況；CK2、6～10、CK4、A～E為秋水仙素處理后接入正常分化培養(yǎng)基15 d的生長(zhǎng)的情況

表1　秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)離體百里香叢芽生長(zhǎng)效果的影響

（續(xù)表）

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

表2　秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)百里香叢芽的誘導(dǎo)效果

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

2.秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)離體百里香莖段生長(zhǎng)及誘導(dǎo)效果的影響

試驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)秋水仙素分別處理1周的莖段轉(zhuǎn)入正常分化培養(yǎng)基培養(yǎng)15 d后，對(duì)照生長(zhǎng)較快。在秋水仙素濃度為0.01%時(shí)，莖段生長(zhǎng)較慢，無(wú)明顯變化；在濃度為0.02%時(shí)，有8個(gè)莖段出現(xiàn)多倍化現(xiàn)象，葉色變深，2個(gè)莖段褐化；在濃度為0.05%和0.10%時(shí)，有15個(gè)莖段出現(xiàn)多倍化現(xiàn)象，葉色變深，分別有8個(gè)和18個(gè)不同程度的褐化現(xiàn)象；而在濃度為0.20%時(shí)，幾乎全部褐化。同時(shí)處理2周的莖段轉(zhuǎn)入正常分化培養(yǎng)基后，在秋水仙素濃度為0.01%時(shí)，有10個(gè)莖段產(chǎn)生多倍化現(xiàn)象；在濃度為0.02%和0.05%時(shí)，分別有16個(gè)和6個(gè)莖段出現(xiàn)多倍化現(xiàn)象，6個(gè)和13個(gè)褐化現(xiàn)象；在濃度為0.10%和0.20%時(shí)，莖段出現(xiàn)大量褐化死亡的現(xiàn)象（圖2），說(shuō)明莖段受到了嚴(yán)重的毒害。由表3可知，隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間的不斷增加，增殖率逐漸降低，最低為0.00%，死亡率逐漸升高，最高為100.00%，且不同處理的增殖率和死亡率與對(duì)照均存在顯著差異。

轉(zhuǎn)入正常分化培養(yǎng)基30 d后統(tǒng)計(jì)莖段外植體的誘導(dǎo)效果，結(jié)果見(jiàn)表4。相同處理時(shí)間時(shí)，隨著秋水仙素濃度的增加，外植體變異率先增加后降低；相同處理濃度時(shí)，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，外植體死亡率也逐漸增加。在濃度為0.01%和0.02%的處理中，均得到了較高的形態(tài)變異率。經(jīng)方差分析可知，在秋水仙素處理濃度為0.01%和0.10%，處理時(shí)間為7 d時(shí)，增殖率和死亡率與對(duì)照均具有顯著差異，其中濃度為0.01%、處理時(shí)間為7 d時(shí)，死亡率較低（23.81%），形態(tài)變異率為38.09%；濃度為0.01%、處理時(shí)間為14 d時(shí)，死亡率略高于處理時(shí)間為7 d的28.57%，但形態(tài)變異率較高（47.62%），綜合考慮，秋水仙素濃度0.01%，處理時(shí)間14 d為莖段最佳誘導(dǎo)組合。

圖2　處理后莖段轉(zhuǎn)入正常分化培養(yǎng)基2周的生長(zhǎng)情況

注：a～e處理時(shí)間為7 d；A～E處理時(shí)間為14 d

表3　秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)離體百里香莖段生長(zhǎng)效果的影響

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

表4　秋水仙素培養(yǎng)基加入法對(duì)百里香莖段的誘導(dǎo)效果

（續(xù)表）

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

（二）秋水仙素浸泡法對(duì)百里香組培苗的誘導(dǎo)

1.浸泡法不同處理對(duì)百里香叢芽生長(zhǎng)及誘導(dǎo)的影響

將秋水仙素浸泡處理的叢芽轉(zhuǎn)接入正常分化培養(yǎng)基上10 d和20 d后，叢芽出現(xiàn)不同程度的玻璃化現(xiàn)象，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，玻璃化程度增強(qiáng)，叢芽受毒害程度也越嚴(yán)重。在秋水仙素浸泡處理6 h，處理濃度為0.10%和0.20%時(shí)，出現(xiàn)了叢芽褐化死亡的現(xiàn)象。在秋水仙素浸泡處理時(shí)間為12 h和24 h時(shí)，各濃度處理下均出現(xiàn)外植體死亡現(xiàn)象，且玻璃化苗數(shù)量明顯增加。（圖3、圖4）。

轉(zhuǎn)接后30 d，秋水仙素不同濃度、不同浸泡時(shí)間對(duì)百里香叢芽的誘導(dǎo)情況見(jiàn)表5。百里香叢芽的死亡率在相同濃度的秋水仙素處理下，隨處理時(shí)間的增長(zhǎng)呈升高趨勢(shì)，在相同處理時(shí)間下，隨處理濃度的升高，其死亡率也呈升高的趨勢(shì)，表明秋水仙素濃度越高、處理時(shí)間越長(zhǎng)對(duì)百里香叢芽毒害越大，在濃度為0.20%的秋水仙素處理24 h時(shí)，死亡率達(dá)到最高，為57.10%。

從形態(tài)變異率可知，隨著秋水仙素處理濃度和時(shí)間的延長(zhǎng)，百里香叢芽的變異率均先升高后降低，即隨著秋水仙素濃度和時(shí)間的不斷增加，其誘變效果不一定提高。0.05%的秋水仙素溶液對(duì)百里香不定芽塊浸泡處理12 h的變異率最高（38.10%），為最佳處理。外植體死亡率方差分析結(jié)果表明，24 h的對(duì)照與6 h、12 h存在顯著差異，說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的浸泡對(duì)于材料死亡率的影響也具有顯著性。

圖3　不同濃度、不同浸泡時(shí)間處理后外植體培養(yǎng)10 d的生長(zhǎng)情況

注：CK1，1～5為不同濃度秋水仙素浸泡處理6 h；CK2，6～10為不同濃度秋水仙素浸泡處理12 h；CK3，11～15為不同濃度秋水仙素浸泡處理24 h

圖4　不同濃度、不同浸泡時(shí)間處理后外植體培養(yǎng)20 d的生長(zhǎng)情況

注：CK1，1～5為不同濃度秋水仙素浸泡處理6 h；CK2，6～10為不同濃度秋水仙素浸泡處理12 h；CK3，11～15為不同濃度秋水仙素浸泡處理24 h

表5　秋水仙素溶液浸泡法對(duì)百里香叢芽的誘導(dǎo)效果

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

2.浸泡法不同處理對(duì)百里香莖段生長(zhǎng)及誘導(dǎo)的影響

由表6、圖5可知，各對(duì)照生長(zhǎng)速度較快、生長(zhǎng)狀態(tài)良好、平均株高較高。但隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照生長(zhǎng)也會(huì)受到一定的影響，長(zhǎng)時(shí)間的浸泡會(huì)導(dǎo)致植物代謝失調(diào)，容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。隨著秋水仙素濃度和處理時(shí)間的增加，莖段生長(zhǎng)受到的抑制作用越來(lái)越嚴(yán)重，高濃度、長(zhǎng)時(shí)間處理后的莖段幾乎沒(méi)有生長(zhǎng)；外植體經(jīng)過(guò)較高濃度、較長(zhǎng)時(shí)間秋水仙素浸泡處理后，出現(xiàn)大量的玻璃化及褐化現(xiàn)象，且死亡率最高達(dá)71.00%。在研究中還發(fā)現(xiàn)，把處理過(guò)的材料轉(zhuǎn)接入正常分化培養(yǎng)基中7 d后，隨著秋水仙素處理濃度和時(shí)間的增加，莖段產(chǎn)生的小苗葉片出現(xiàn)變大、變寬、增厚的現(xiàn)象，同時(shí)莖變粗，且濃度越大、處理時(shí)間越長(zhǎng)，變異越明顯。

由表7可以看出，隨著秋水仙素濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，處理材料的死亡率越來(lái)越高，在濃度為0.20%、處理時(shí)間為24 h時(shí)，達(dá)到了最大值71.00%。在處理濃度為0.01%和0.02%時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)，變異率逐漸升高；在濃度為0.05%和0.10%時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，變異率先升高后降低；在處理濃度為0.20%時(shí)，隨著處理時(shí)間的增加，變異率呈現(xiàn)降低趨勢(shì)。說(shuō)明秋水仙素對(duì)于莖段的毒害作用較大，當(dāng)濃度達(dá)到0.20%時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致材料大量死亡，從而降低了材料的變異率。從形態(tài)變異率方差分析中可知，處理濃度為0.01%，處理時(shí)間為3 h、6 h、12 h時(shí)與對(duì)照無(wú)顯著差異，其他各處理均存在顯著差異。莖段的最佳處理為：秋水仙素濃度為0.10%，處理時(shí)間為6 h，該條件下可得到最高形態(tài)變異率（52.38%）。

圖5　不同濃度、不同浸泡時(shí)間處理對(duì)百里香莖段生長(zhǎng)的影響

注：CK1，1～5為不同濃度秋水仙素浸泡處理3 h；CK2，6～10為不同濃度秋水仙素浸泡處理6 h；CK3，11～15為不同濃度秋水仙素浸泡處理12 h；CK4，16～20為不同濃度秋水仙素浸泡處理24 h

表6　浸泡法不同處理對(duì)百里香莖段生長(zhǎng)的影響

表7　秋水仙素溶液浸泡法對(duì)百里香莖段的誘導(dǎo)效果

注：同列后不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平存在差異

三、結(jié)果與討論

（一）秋水仙素誘導(dǎo)百里香多倍體方法的探討

秋水仙素是目前多倍體育種中應(yīng)用最廣泛的化學(xué)試劑之一，其之所以能夠誘導(dǎo)植物多倍體產(chǎn)生，是因?yàn)樵谟薪z分裂過(guò)程中，它可以與微管蛋白二聚體結(jié)合，從而阻止微管和紡錘絲的形成。秋水仙素誘導(dǎo)多倍體常用的方法有浸泡法、滴液法、脫脂棉法、注射法、噴霧法和組織培養(yǎng)基誘導(dǎo)法等。不同植物材料及同種植物不同部位對(duì)其敏感度均不同，故秋水仙素濃度及處理時(shí)間成為誘導(dǎo)多倍體成敗的關(guān)鍵因素之一。

離體條件下，在秋水仙素培養(yǎng)基加入法中，叢芽的誘導(dǎo)效果優(yōu)于莖段，相同濃度下秋水仙素對(duì)于莖段的毒害作用大于叢芽，導(dǎo)致莖段誘導(dǎo)過(guò)程中出現(xiàn)了大量的死亡。而在秋水仙素浸泡法中，莖段的誘導(dǎo)優(yōu)于叢芽。莖段的形態(tài)變異率高于叢芽，可能是由于秋水仙素對(duì)莖段傷口的直接作用所導(dǎo)致；另一方面，叢芽誘導(dǎo)出的多倍化植株與莖段相比在分化培養(yǎng)的過(guò)程中多倍化形態(tài)較不穩(wěn)定，培養(yǎng)一段時(shí)間后，還會(huì)出現(xiàn)多倍化消失的現(xiàn)象。本研究表明，離體條件下百里香多倍體的誘導(dǎo)效果較好，并且從誘導(dǎo)的變異體得到了四倍體（2n=4x=48），以及少數(shù)六倍體和非整倍體。

組織培養(yǎng)在多倍體育種中表現(xiàn)出了特殊的作用，一方面不僅可以提高多倍體的誘變率、成活率以及繁殖系數(shù)，效果穩(wěn)定、快速，且能夠從多倍體的誘導(dǎo)到變異植株的分離以及最后多倍體的鑒定過(guò)程形成一個(gè)完整的體系；另一方面，組織培養(yǎng)能夠使各類(lèi)細(xì)胞得以生存、不被淘汰，為下一步研究提供材料，而且對(duì)于嵌合體可在此基礎(chǔ)上進(jìn)行二次誘導(dǎo)加以分離，以提高多倍體的誘導(dǎo)效率等。

（二）秋水仙素不同濃度、不同處理時(shí)間對(duì)百里香多倍化誘導(dǎo)的影響

秋水仙素劇毒，對(duì)處理材料具有一定的毒害作用，不同材料以及同一材料的不同部位對(duì)于秋水仙素的毒害作用反應(yīng)不同。因此需要進(jìn)行試驗(yàn)來(lái)確認(rèn)所處理材料對(duì)于秋水仙素的敏感程度，以確定秋水仙素的有效濃度范圍。一般認(rèn)為秋水仙素的使用濃度為0.01%～0.40%，濃度高時(shí)處理時(shí)間應(yīng)短，濃度低時(shí)處理時(shí)間應(yīng)長(zhǎng)。

通過(guò)秋水仙素誘導(dǎo)結(jié)合組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)百里香叢芽及莖段進(jìn)行了不同方法的誘導(dǎo)，在秋水仙素浸泡處理叢芽的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，百里香叢芽在轉(zhuǎn)接前已出現(xiàn)了不同程度的被毒害現(xiàn)象，轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基10 d后毒害較輕的叢芽逐漸正常生長(zhǎng)，毒害較嚴(yán)重的叢芽死亡。加入培養(yǎng)基法中，百里香叢芽轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基10 d后出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)死亡率也逐漸增加，總體來(lái)說(shuō)加入培養(yǎng)基法后期對(duì)叢芽的毒害性較大?？赡苁怯捎趨惭吭诮莸倪^(guò)程中雖受到秋水仙素的直接毒害但對(duì)秋水仙素的吸收較少，故在后期培養(yǎng)中毒害較輕的叢芽可以排除毒性正常生長(zhǎng)，而叢芽在加入培養(yǎng)基法的處理過(guò)程中雖沒(méi)有出現(xiàn)毒害現(xiàn)象，但在后期培養(yǎng)的過(guò)程中隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，毒害現(xiàn)象越來(lái)越明顯。在秋水仙素相同濃度和處理時(shí)間下，莖段受到毒害的程度較叢芽嚴(yán)重，死亡率較高，即莖段對(duì)于秋水仙素的毒害作用比叢芽敏感，但低濃度下莖段的誘導(dǎo)效果比叢芽好，故用莖段進(jìn)行離體多倍體誘導(dǎo)時(shí)，秋水仙素濃度以及處理時(shí)間應(yīng)該相應(yīng)地降低。