生物化學(xué)歷史上的一個關(guān)鍵性事件是首個神經(jīng)遞質(zhì)受體的鑒定，即煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的鑒定。為了鑒定它，多個學(xué)科的手段被廣泛地運(yùn)用，如電生理學(xué)、藥理學(xué)和生物化學(xué)。多學(xué)科集合在一起，以一個統(tǒng)一而合理的方法、共同的目標(biāo)，成功地鑒定了一個分子。神經(jīng)系統(tǒng)中的這個nAChR分子可以把化學(xué)信號轉(zhuǎn)變成電信號。此受體是更廣泛的五聚體膜受體大家族的一員，也是最重要的一員。鑒定nAChR為鑒定GABAA受體等其他的受體鋪平了道路［8］。

nAChR的首次分離是1970年的事情，當(dāng)時它的來源是電鰻電器官。這是第一個配基門控離子通道，也是被鑒定的第一個離子通道。其后25年，許多其他的受體——GABAA受體、甘氨酸受體以及它們的亞單位，都得到了克隆而且被測定了順序，同時它們與nAChR的同源性被認(rèn)識。nAChR發(fā)現(xiàn)之后5年，與它非常接近的、存在于原核細(xì)胞的同源配基門控離子通道也被闡明。本章將介紹發(fā)現(xiàn)nAChR的幾個主要步驟［8］。

1905年，在神經(jīng)-肌肉標(biāo)本上做研究的英國生理學(xué)家J. N. Langley提出，肌肉組織含有一種物質(zhì)，此物質(zhì)可與煙堿或箭毒結(jié)合，它接受刺激而且傳遞刺激。Langley稱肌肉上的這個實(shí)體為“接受物質(zhì)”。往后的50年，藥理學(xué)上的“受體”概念鼓舞了3個主要方向的研究。第一個方向是采用藥理學(xué)方法，應(yīng)用新的化學(xué)配基，特征化（characterize）受體部位的特異性，例如區(qū)分了煙堿型（n-）和毒蕈堿型（m-）的乙酰膽堿受體（AChR），像戴爾等人的工作。第二個方向是以卡茨、?？藸査沟热藶榇淼碾娚韺W(xué)研究工作，其目的在于了解內(nèi)源性神經(jīng)遞質(zhì)信號所引起的離子反應(yīng)。第三個方向是化學(xué)性研究工作，其傳統(tǒng)目的在于鑒定受體的分子構(gòu)成［8］。

20世紀(jì)60年代后期，脂質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)甚至核酸都曾被認(rèn)為是可能的受體。第一批獨(dú)立的工作是由C. Chagas、E. de Robertis、D. Nachmansohn等人做的，他們企圖鑒定電魚（Electrophorus electricus）電器官里面的乙酰膽堿受體，方法是用放射標(biāo)記配基。但是此方法以后被放棄了，因?yàn)樵诮M織提取后缺少特異性。在研究過程中Nachmansohn認(rèn)識到，電器官中有非常豐富的乙酰膽堿受體，因此這個標(biāo)本是可以利用的。他和E. Schoffeniels一起設(shè)計(jì)了方法，從電器官里面制備個別細(xì)胞、個別電板。這種方法提供了在同一生物學(xué)標(biāo)本上同時進(jìn)行電生理學(xué)、藥理學(xué)、生物化學(xué)研究的可能性。那時候有推測認(rèn)為，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）和介導(dǎo)乙酰膽堿生理反應(yīng)的受體，可能存在于同一蛋白質(zhì)復(fù)合體上［8］。

這是一種新的生物化學(xué)方法，它的引入從根本上改變了受體鑒定領(lǐng)域。親和標(biāo)記法的原理是應(yīng)用一種化合物，在結(jié)構(gòu)上它是神經(jīng)遞質(zhì)同源物，也具有同樣的高反應(yīng)性基團(tuán)。這個探針化合物可以特異地結(jié)合于受體的位點(diǎn)，而且以共價鍵方式連接到蛋白質(zhì)上。例如，有一個分子叫TDF（p-trimethylammonium benzenediazonium fluoroborate），它具有三甲銨（trimethylammonium）基團(tuán)和重氮基團(tuán)，而三甲銨是類似乙酰膽堿的。如所預(yù)期，TDF可與電板起共價鍵反應(yīng)，而箭毒以不可逆競爭性拮抗劑的方式，保護(hù)其不受共價鍵的結(jié)合。后來，這個親和標(biāo)記方法又有改進(jìn)。然而當(dāng)時的組織制備方法以及化合物特異性，均不足以達(dá)到從電器官里面分離出受體的要求［8］。

顯著推動此領(lǐng)域的另一個方法學(xué)是改變操作流程，成功地實(shí)現(xiàn)富含AChE的電器官膜片段的分餾與純化（fractionation and purification），而在電子顯微鏡下又發(fā)現(xiàn)了這些膜片段上有密集的小泡。在細(xì)菌透酶（permease）技術(shù)的鼓舞下，一個簡單的過濾技術(shù)使人們有可能測定通過小微囊的放射性鈉和放射性鉀的流動，而此微囊可以對激動劑乙酰膽堿起反應(yīng)，并具有特異性。這非常類似于從完整電板記錄下來的電生理反應(yīng)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程是由神經(jīng)遞質(zhì)發(fā)動的，而且可以在完全無細(xì)胞系統(tǒng)、在化學(xué)界定的環(huán)境中重現(xiàn)，不需要能量供給。有了這些條件以后，已經(jīng)有可能研究離體條件下由乙酰膽堿所引起的生理反應(yīng)，以及所引起的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。受體分子顯然存在于純化質(zhì)膜上，而且處于有功能的狀態(tài)。于是，有可能應(yīng)用放射配基來追蹤這種純化的膜與煙堿型激動劑十烴季銨（decamethonium）的可逆性結(jié)合（圖3-6）。去垢劑脫氧膽酸鹽可以溫和地提取結(jié)合蛋白而不引起它變性，結(jié)合十烴季銨可以被不同的煙堿拮抗劑所取代，根據(jù)拮抗劑的生理效應(yīng)強(qiáng)弱，有箭毒、三乙碘化三（β-二乙氨乙氧基）苯（flaxedil）等。從此以后，類似的受體結(jié)合檢測方法被廣泛地用來特征化GABAA受體和甘氨酸受體等［8］。

圖3-6　鑒定煙堿型乙酰膽堿受體

（a）運(yùn)用鑒定煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的平衡透析法做結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法；（b）蛇毒毒素α-BGT對煙堿型激動劑的十烴季銨進(jìn)行氚標(biāo)記之影響。（圖引自［8］）

來說說蛇毒毒素的應(yīng)用。中國臺灣藥理學(xué)家李鎮(zhèn)源（Chen-Yuan Lee）發(fā)現(xiàn)，有一種蛇毒毒素——α-環(huán)蛇毒素（α-bungarotoxin，α-BGT）可以特異地阻斷高等脊椎動物的神經(jīng)-肌肉傳遞，其作用是在突觸后水平，不與AChE相互作用。當(dāng)李鎮(zhèn)源偶然來到巴斯德研究所訪問時，J. P. Changeux想起了貝爾納（C. Bernard，1813—1878）的一個看法。貝爾納認(rèn)為，毒性物質(zhì)可用作為化學(xué)解剖刀。Changeux向李鎮(zhèn)源提出：能否給他一個包裝的毒素？幾天后他得到了這個毒素，并立即在前面講過的那3個系統(tǒng)中進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果非常明顯：①α-BGT阻斷在體電反應(yīng)；②α-BGT阻斷離體微囊對煙堿型激動劑的離子流動反應(yīng)；③α-BGT也阻斷放射標(biāo)記十烴季銨與去垢劑提取物的結(jié)合。這個提取物中實(shí)際上含有一種蛋白質(zhì)，它對蛋白酶消化敏感，可與煙堿型激動劑及蛇毒毒素結(jié)合，結(jié)合是通過相互排斥的方式。這個nAChR分子被發(fā)現(xiàn)是高分子量的疏水性蛋白質(zhì)，可與AChE從物理上區(qū)分開來［8］。

眼鏡蛇的α-蛇毒密切地同源于α-BGT，把眼鏡蛇毒以共價鍵方式耦合到瓊脂糖珠（bead）上，并不喪失其結(jié)合活性。把含有毒性的珠和膜制備混合后，發(fā)現(xiàn)75%～100%的乙酰膽堿受體蛋白結(jié)合到了毒素珠上，而85%～100%的AChE仍保留在上清液里。此結(jié)果證實(shí)，AChE和乙酰膽堿受體分子是兩個不同的蛋白質(zhì)實(shí)體。該研究也把親和層析技術(shù)引入nAChR研究領(lǐng)域，Changeux等許多研究組知道了這樣一種明確的方法學(xué)。多個研究組應(yīng)用了不同的親和柱，應(yīng)用了固定的季銨激動劑或拮抗劑，這樣就擴(kuò)展了應(yīng)用范圍（圖3-7）。R. Miledi等應(yīng)用了放射性131I標(biāo)記的α-BGT。他們認(rèn)為，碘標(biāo)記的α BGT選擇性地結(jié)合于靜息狀態(tài)的受體［8］。

圖3-7　通過親和層析法純化煙堿型乙酰膽堿受體（圖引自［8］）

回過頭來看，另一項(xiàng)技術(shù)發(fā)展雖然比較簡單，但對煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）研究有著重要的影響，那就是從電鰩（Torpedo）電器官勻漿中分離出了新一代具有興奮性的微囊，它含有非常高濃度的nAChR，可高達(dá)總蛋白質(zhì)的20%～40%。這個發(fā)現(xiàn)很快得到其他研究組的證實(shí)，這種含豐富乙酰膽堿受體的膜制備完成以后，就能對膜上乙酰膽堿受體的結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)開展一系列生物物理學(xué)研究。例如在大量純化以后，可應(yīng)用熒光光譜學(xué)、電子旋轉(zhuǎn)共振方法、X射線衍射方法等進(jìn)行研究［8］。

最后，從電鰻也從純化的含豐富nAChR的電鰩膜上，得到了純化的nAChR蛋白質(zhì)。在電子顯微鏡下考察這兩種膜制備時發(fā)現(xiàn)，里面有像環(huán)一樣的顆粒，顆粒直徑約8～9 nm，它有一個親水性軸心，周邊圍繞著由5～6個亞單位組成的致密束，形成一種緊密包裝的二維結(jié)合物。在電鰩突觸后膜上，約有8000～12000 μm2的面積（圖3-8）。這些nAChR圖像是有關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)受體的第一個圖像，以后被更詳細(xì)地描述。此后也獲得了其他受體的圖像，如GABAA受體、甘氨酸受體等［8］。

圖3-8　首個用電鏡觀察到的純化電鰻乙酰膽堿受體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和來自電鰩的純化突觸下膜片段

（a）純化電鰻乙酰膽堿受體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)；（b）來自電鰩的純化突觸下膜片段。200 ?＝20 nm。（圖引自［8］）

純化煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的含量，已經(jīng)足夠用于鑒定受體的亞單位組構(gòu)。第一個研究是用純化的電鰻nAChR進(jìn)行部分交互鏈接。研究發(fā)現(xiàn)，有5個明確界定的條帶提示了五聚體的組構(gòu)。此結(jié)果很快被其他實(shí)驗(yàn)室所證實(shí)。A. Karlin實(shí)驗(yàn)室額外地發(fā)現(xiàn)，nAChR分子由4個不同類型的亞單位組成，而分子質(zhì)量稍微有些差別，即2個α、1個β、1個γ、一個δ，即所謂的異五聚體［8］。

關(guān)于亞單位的化學(xué)如何，當(dāng)時一點(diǎn)也不知道。運(yùn)用近來發(fā)展起來的高分辨微量測序技術(shù)（microsequencing），僅需少量的蛋白質(zhì)即可測定氨基酸順序。于是Changeux實(shí)驗(yàn)室鑒定了電鰩的nAChR，發(fā)現(xiàn)它以20個氨基酸的序列組成α亞單位的N末端域。然后，成功地得到了受體的化學(xué)名片。這是第一個建立起來的神經(jīng)遞質(zhì)受體名片，以后被其他實(shí)驗(yàn)室所證實(shí)。他們用的是電鰩受體的α亞單位，并且擴(kuò)展到4個亞單位的N末端順序，發(fā)現(xiàn)了各個亞單位上氨基酸順序的一系列特征。與Monod-Wyman-Changeux 1965年的模型相一致，nAChR蛋白是一個真正的寡聚體，它的對稱性是假的，擁有垂直于突觸后膜平面的5個旋轉(zhuǎn)軸［8］。

有了氨基酸順序的材料，就開啟了對nAChR領(lǐng)域的新認(rèn)識?，F(xiàn)在就可以應(yīng)用重組DNA的技術(shù)了。日本的S. Numa研究組、美國的S. Heinemann及E. A. Barnard，還有許多其他實(shí)驗(yàn)室的工作者，他們努力克隆來自電器官及肌肉nAChR不同亞單位的cDNA，并確定其全部順序。Barnard、Miledi等的實(shí)驗(yàn)證明，如果把從電鰩電器官中提純的信使分子注射到非洲爪蟾卵細(xì)胞，可導(dǎo)致卵細(xì)胞膜上出現(xiàn)功能性的乙酰膽堿受體，這樣就可以用卵細(xì)胞做電生理實(shí)驗(yàn)；注射克隆的4種mRNA的轉(zhuǎn)錄分子，可以產(chǎn)生具有功能性的nAChR。這證實(shí)了早期生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)所演示的：4個類型的亞單位就足可以組裝成為具有工作能力的完整nAChR［8］。

考察nAChR的完整cDNA順序時發(fā)現(xiàn)，沿著亞單位順序有幾個共同的結(jié)構(gòu)域，這樣就導(dǎo)致了nAChR亞單位的第一個跨膜組構(gòu)模型。人們建議，nAChR有1個長親水性N末端，有4個疏水性段，還有1個短的親水性片段。它們分別組織成細(xì)胞外（突觸）域、4個跨膜α螺旋、1個細(xì)胞內(nèi)（也就是胞液的）域。1986年及以后，知道了神經(jīng)元的nAChR（包括α7 nAChR、α4β2nAChR），還有GABAA受體、甘氨酸受體、3型5-羥色胺受體（5-HT3受體）、谷氨酸門控氯通道（glutamate-gated chloride channel，GluCl）等分子。它們有很接近的同源性順序及亞單位組構(gòu)，都含有一個CYS環(huán)。這些受體加在一起，就組成一個五聚體受體超家族，而這是Changeux經(jīng)典研究的對象。近來在原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了直系同源基因的陽離子通道，使超家族擴(kuò)大了。它的進(jìn)化起源提早了300萬年［8］。

乙酰膽堿受體蛋白及其不同位點(diǎn)的真正三維結(jié)構(gòu)拓?fù)鋵W(xué)，仍不能運(yùn)用重組DNA的技術(shù)直接加以推定。對組成乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸，以及對離子通道進(jìn)行鑒定需要依賴不同的技術(shù)。例如，以前曾經(jīng)提到過的親和標(biāo)記法在這個階段也可以是有用的。首個結(jié)果來自A. Karlin，他們用4-N-馬來酰亞胺苯基三甲胺碘鹽（N-maleimido phenyltrimethylammonium iodide），后者可以標(biāo)記乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)的巰基。這個親和結(jié)合方法導(dǎo)致了對于一對靠近的半胱氨酸之鑒定，其位置在氨基酸192、193，位于α亞單位的N末端域。然而，有關(guān)乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)的藥理學(xué)特異性仍然不清楚［8］。

Changeux研究組證明，蛇毒的氚標(biāo)記α-蛇毒本身，不需要增加修飾就可用作光標(biāo)記，用紫外光照射氚標(biāo)記的毒素-受體復(fù)合體并予以光照后，可導(dǎo)致合并的共價鍵結(jié)合放射活性不僅進(jìn)入α亞單位也進(jìn)入γ和δ亞單位。他們根據(jù)此觀察得出結(jié)論，乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)是在亞單位界面上，因此是非相等的（non-equivalent）。這個結(jié)果在以后的功能研究上也得到了證明［8］。

p-N，N-二甲銨重氮苯正離子硼酸鹽（p-N，N-dimethylammonium benzenediazonium difluoroborate，DDF）是類似TDF的一個親和探針，應(yīng)用它得到了重要的信息。DDF的二甲銨基造成共振分子，從蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移過來的能量可以激活它。的確，發(fā)現(xiàn)了有8個氨基酸可被DDF標(biāo)記，其中6個具有芳香族側(cè)鏈，所有8個都位于α亞單位N末端的長疏水性域。這些氨基酸分布為3個環(huán)，它們形成帶負(fù)電的芳香族基團(tuán)口袋，位于單個主要環(huán)上，而乙酰膽堿季銨就待在這個口袋里面。這樣，它類似于AChE的結(jié)合位點(diǎn)。AChE的結(jié)合是π鍵結(jié)合。這3個環(huán)位于α亞單位的側(cè)面，以后被稱為“主成分”，并分別稱為A、B和C。這3個名字的命名是得到受體研究界公認(rèn)的。與氚標(biāo)記α-蛇毒的光親和標(biāo)記資料相一致，除α亞單位以外，親和探針DDF也可以標(biāo)記γ、δ亞單位。Karlin、J. B. Cohen還有Changeux研究組的研究證明了這個看法，又額外鑒定了D、E和F環(huán)，它們位于界面的非α亞單位側(cè)面，被稱為“補(bǔ)充”成分。這些生物化學(xué)資料還受到標(biāo)記氨基酸的位點(diǎn)突變研究的支持［8］。

結(jié)合位點(diǎn)組構(gòu)的證明，也來自對蝸?？扇苄缘鞍踪|(zhì)的三維結(jié)構(gòu)研究。該蛋白質(zhì)可以結(jié)合乙酰膽堿，它是乙酰膽堿結(jié)合蛋白，但不是乙酰膽堿受體。不過，它具有想象的、同源的膽堿受體的細(xì)胞外域，相當(dāng)于真核細(xì)胞GluCl受體，以及原核生物歐文氏菌（Erwinia chrysanthemi）的與GABA結(jié)合的受體，乙酰膽堿是它的拮抗劑［8］。

20世紀(jì)80年代早期還沒有任何關(guān)于離子通道方面的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)資料。當(dāng)時的問題是，如何從化學(xué)上鑒定襯貼在離子賴以流動的離子孔上面的氨基酸順序。1974—1999年間的種種探索表明，這條路是漫長而艱難的。幾十年來已經(jīng)知道，藥理學(xué)物質(zhì)如局部麻醉劑，能以間接、非競爭性方式阻斷由煙堿型激動劑所引起的離子電流。局部麻醉劑可以成為一個有用的工具，用來對離子通道做化學(xué)標(biāo)記。第一個實(shí)驗(yàn)用的是富含電鰻電板的受體膜。實(shí)驗(yàn)演示，在離體條件下，藥理學(xué)活性濃度的局部麻醉劑并不從乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)直接取代煙堿的配基，而是可逆地結(jié)合于另一個變構(gòu)位點(diǎn)。局部麻醉劑之一的氯丙嗪還有額外的特征，它具有以共價鍵方式結(jié)合受體蛋白質(zhì)的顯著能力，通過簡單的紫外線照射就可以顯示。在富含受體的石紋電鰩（T. marmorata）膜制備上，氯丙嗪可以標(biāo)記煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR）的4種α亞單位。而且精確定量測定的結(jié)果表明，它結(jié)合于每個單聚體2 α1β1γ1δ的高親和力位點(diǎn)。在預(yù)期可以產(chǎn)生有功能性離子通道的條件下，如果氯丙嗪快速地與乙酰膽堿混勻，則它與此位點(diǎn)的動力學(xué)可以增加100倍。這意味著，氯丙嗪與功能性乙酰膽堿受體更容易結(jié)合。Changeux建議，氯丙嗪結(jié)合于離子通道的一個位點(diǎn)，此位點(diǎn)就在受體的假對稱軸邊上。當(dāng)離子通道受激活而開放的時候，它就變得可以接受氯丙嗪的進(jìn)入。就這樣，通道可以在特異標(biāo)記的條件下確定下來［8］。

再經(jīng)過一年多的努力，才證明了氯丙嗪可以標(biāo)記δ亞單位第二跨膜段（transmembrane segment 2，TM2）的絲氨酸。這個發(fā)現(xiàn)很快被其他研究組用同樣的研究方法但不同的探針?biāo)C實(shí)。還有進(jìn)一步的鑒定，在其他亞單位標(biāo)記氯丙嗪的氨基酸位置，不僅顯示有幾個絲氨酸形成的環(huán)，還發(fā)現(xiàn)其他氨基酸是靠攏的，如亮氨酸和絲氨酸，這兩個氨基酸位于離開絲氨酸環(huán)位置3～4個氨基酸處。由此得出結(jié)論：①TM2片段組成通道壁；②這些片段折疊成α螺旋；③氯丙嗪結(jié)合位點(diǎn)位于靠近赤道的位置，在通道的假對稱軸上；④在乙酰膽堿和氯丙嗪結(jié)合位點(diǎn)之間，存在著正相互變構(gòu)作用［8］。

與上述進(jìn)展相平行，定向突變后的單通道實(shí)驗(yàn)記錄也出來了。在爪蟾卵細(xì)胞重組受體分子γ亞單位的一個區(qū)域，此區(qū)域的位置在擬定的TM2片段及其附近TM2和TM3之間的彎曲部分。這一段被認(rèn)為負(fù)責(zé)兩種受體之間的差別，即電鰩的和牛的乙酰膽堿受體的電導(dǎo)差別。往后的分析鑒定了帶負(fù)電的谷氨酰胺殘基環(huán)。環(huán)被分成外環(huán)、中環(huán)和胞質(zhì)環(huán)，這些環(huán)又漂亮地把氯丙嗪標(biāo)記的氨基酸簇組成為框架，這樣也就證實(shí)了它們在離子路徑上的位置。其他研究組得到了類似的結(jié)論［8］。

進(jìn)一步的研究鑒定了貢獻(xiàn)給通道離子選擇性的一些氨基酸。發(fā)現(xiàn)了3個殘基，它們可以把通道的陽離子選擇性轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子選擇性。這樣，一個興奮性受體首次可以轉(zhuǎn)變?yōu)橐粋€抑制性受體。在其他受體如GABAA受體、甘氨酸受體、GluCl還有5-HT3受體中，相反方向的發(fā)現(xiàn)（即由陰離子通道轉(zhuǎn)變?yōu)殛栯x子通道）也做出來了。然后又做出了功能性嵌合體，把α7乙酰膽堿受體的突觸域與5-HT3受體的跨膜域嵌合起來。甚至原核細(xì)胞和真核細(xì)胞受體的域也可以結(jié)合起來并具有功能。這樣就不容置疑地證明了受體超家族里面存在著保守的四級結(jié)構(gòu)。最后，來自原核細(xì)胞的歐文氏菌屬以及Gloebacter屬配基門控離子通道（Erwinia ligand-gated ion channel，ELIC和Gloebacter ligand-gated ion channel，GLIC）的高分辨X射線衍射數(shù)據(jù)與nAChR離子通道的生物化學(xué)電子顯微鏡資料是相一致的。X射線衍射資料進(jìn)一步證明，通道域在地域上不同于神經(jīng)遞質(zhì)結(jié)合域，而神經(jīng)遞質(zhì)與離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的相互作用是一種變構(gòu)相互作用［8］。

圖3-9　煙堿型乙酰膽堿受體最少4個狀態(tài)的變構(gòu)轉(zhuǎn)變模型

CB：競爭性（正立體）阻斷；ACh：乙酰膽堿；NCB：非競爭性（通道）阻斷；AM：變構(gòu)性調(diào)制；P：磷酸化位點(diǎn)。（圖引自［8］）

此外在靜息狀態(tài)時，約有20%的受體存在于高親和力脫敏狀態(tài)中。在沒有乙酰膽堿的條件下，肌細(xì)胞nAChR的自發(fā)通道開放也可以被記錄下來。此現(xiàn)象排除了受體理論中所謂“誘導(dǎo)契合”（induced fit）的假設(shè)，而有利于構(gòu)象選擇模式。再有，情況似乎比調(diào)節(jié)性酶還要復(fù)雜些，存在著不止一個而是一系列開放和關(guān)閉構(gòu)象之間的不同轉(zhuǎn)變狀態(tài)（圖3-9）［8］。

直到近來還很少有信息可以幫助人們解釋nAChR的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，除了對電鰩受體的在體電子顯微鏡研究。在計(jì)算機(jī)模擬模型中，根據(jù)有關(guān)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)提供了關(guān)于受體蛋白質(zhì)構(gòu)象轉(zhuǎn)變的新看法。正常的模式分析是用α7 nAChR的三維模型做的，通過這個模型的分析，把蛋白質(zhì)運(yùn)動分解為不同的模式。在第一批10個最低頻率的模式中，第一個模式產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)重組，引起了孔的廣泛開放，這是由于蛋白質(zhì)四級扭轉(zhuǎn)的對稱的轉(zhuǎn)變；同時伴有細(xì)胞外（上）及跨膜域（下）的相對方向扭轉(zhuǎn)，以及每個亞單位相當(dāng)程度的三級重新組構(gòu)，特別是在蛋白質(zhì)域的界面。四級扭轉(zhuǎn)運(yùn)動的金標(biāo)準(zhǔn)，可以合理解釋已有的通道門控實(shí)驗(yàn)資料。原核細(xì)胞GLIC的X射線衍射結(jié)構(gòu)研究，顯示開放的通道構(gòu)型；而ELIC的研究卻顯示關(guān)閉的通道構(gòu)型。兩者相比較，強(qiáng)有力的證據(jù)就出來了，發(fā)現(xiàn)至少有29%的四級扭轉(zhuǎn)-轉(zhuǎn)動模型可以解釋通道的開放。研究的進(jìn)一步發(fā)展，包括微秒水平的分子動力學(xué)研究［8］。

由nAChR所介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，至少受3種變構(gòu)調(diào)制物的調(diào)制。它們的結(jié)合位點(diǎn)明顯不同于神經(jīng)遞質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)或者離子通道。這些調(diào)制物被認(rèn)為選擇性地改變了變構(gòu)的平衡，或者有利于主動的正性調(diào)制或負(fù)調(diào)制，后者即靜息的去敏感化調(diào)制。這種構(gòu)象的調(diào)制，并不需要競爭正空間排列的（orthosteric）受體結(jié)合位點(diǎn)［8］。

有一組調(diào)制物包括鈣離子，能夠增強(qiáng)多數(shù)神經(jīng)元的乙酰膽堿受體，并結(jié)合于乙酰膽堿結(jié)合位點(diǎn)以下的細(xì)胞外域，其殘基由兩方面的亞單位界面提供。第二個重要的調(diào)制物集團(tuán)包括加蘭他敏（galantamine），結(jié)合于“非激動劑”界面。在異五聚體nAChR上，此界面不同于受體結(jié)合位點(diǎn)，而且似乎同源于丙二氮在GABA上面的結(jié)合位點(diǎn)［8］。

另一個變構(gòu)調(diào)制位點(diǎn)相互作用于跨膜域。原來發(fā)現(xiàn)驅(qū)蟲藥伊維菌素（ivermectin）是α7 nAChR的強(qiáng)的正調(diào)制物，其作用因TM2突變而改變。全身麻醉劑不論是靜脈麻醉的還是揮發(fā)麻醉的，都可以負(fù)性調(diào)制興奮性nAChR，但正性增強(qiáng)抑制性GABA受體。用光親和標(biāo)記法研究GABAA受體，以及用X射線衍射方法研究GLIC與異丙酚（propofol）的復(fù)合體時發(fā)現(xiàn)，在每個亞單位的跨膜域上部有一個位點(diǎn)；在nAChR的這個位點(diǎn)上，煙堿型變構(gòu)調(diào)制物可能也有相互作用。

在所有真核細(xì)胞的五聚體受體連接TM3和TM4的胞質(zhì)環(huán)中，也鑒定出變構(gòu)調(diào)制位點(diǎn)的存在，但在原核細(xì)胞中沒有。nAChR有幾個磷酸化位點(diǎn)，它調(diào)節(jié)肌肉里面的以及α7 nAChR的脫敏，也貢獻(xiàn)給終板定位的、由聚集蛋白誘導(dǎo)的43K締合蛋白（rapsyn）的酪氨酸磷酸化。α4 nAChR亞單位的細(xì)胞質(zhì)域也結(jié)合于一系列腳手架蛋白，它們與腳手架蛋白及G蛋白系統(tǒng)相互作用，從而參與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［8］。

分離了nAChR，并發(fā)現(xiàn)了GABA受體和甘氨酸受體的亞單位是nAChR的親密直系同源蛋白質(zhì)，這就確立了五聚體配基門控離子通道超家族的概念。整個神經(jīng)遞質(zhì)的五聚體受體研究領(lǐng)域得到快速發(fā)展，包括在原核細(xì)胞里面發(fā)現(xiàn)了同源受體，其中有些是常用藥物的靶，如箭毒、苯二氮以及全身麻醉藥。近來對某些受體的X射線衍射研究取得了進(jìn)展，為作用于腦的藥物提供了合理的設(shè)計(jì)方案和研究途徑。nAChR研究與很豐富的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）研究是相互平行發(fā)展的，但GPCR的鑒定比乙酰膽堿受體的鑒定實(shí)際上還要晚幾年［8］。