血清總膽汁酸(total bile acid,TBA)的測定方法有高效液相色譜法、放射免疫分析法和酶法。酶法又可分酶熒光法、酶比色法和酶循環(huán)法。近年發(fā)展的酶循環(huán)法靈敏度高、特異性好、應用前景好。

酶循環(huán)法原理為

在一定的反應時間內(nèi),酶循環(huán)產(chǎn)生的硫代NADH與樣品中膽汁酸濃度成正比,與標準液比較計算樣品中膽汁酸的含量。酶循環(huán)法測定TBA是一種通過脫氫酶-輔酶體系循環(huán)底物的方法。要求這種酶對硫代NAD+和NADH都有高度親和力,反應體系的p H和緩沖液應允許正反應和逆反應都能進行,硫代NAD+和NADH濃度比例合適。這樣使循環(huán)速率快(約100/ min),干擾因素較少。

酶比色法既可用于手工操作,亦可用于自動分析。下面介紹酶比色法測定總膽汁酸。

【原理】 血清中的總膽汁酸是一類具有3α-羥基的類固醇衍生物,在3α-羥類固醇脫氫酶(3α-HSD)作用下,脫氫生成相應的3-酮類固醇,此過程中將輔酶NAD+還原為NADH+H+,在黃遞酶作用下,使NADH脫氫,同時使碘化硝基四氮唑(INT)還原為紅色的甲臜。近年來開發(fā)出另一種工具酶3α-氧-5βΔ4類固醇脫氫酶(Δ4DH),作為3α-HSD的偶聯(lián)酶,進一步催化3-酮類固醇脫氫,也可使INT還原為甲臜,從兩條途徑提高顯色產(chǎn)物甲臜的濃度。甲臜的產(chǎn)量與總膽汁酸成正比。

【器材與試劑】

1.器材 試管、試管架、加樣器、恒溫水浴箱、分光光度計。

2.試劑

(1)試劑Ⅰ:黃遞酶1000U,NAD+1mmol,碘化硝基四氮唑0.5mmol,丙酮酸50mmol溶于0.1mol/L磷酸緩沖液(p H7.5)1L中,加適量表面活性劑。

(2)空白試劑Ⅱ:3α-羥類固醇脫氫酶2000U溶于0.1mol/L磷酸緩沖液(p H7.5)1L。

(3)終止液:1mol/L HCl。

(4)膽汁酸標準液(50μmol/L甘氨膽酸鈉):稱取甘氨膽酸鈉24.38mg,溶于1L經(jīng)透析的混合血清中。

【操作】

1.手工法 按表9-10進行操作。

表9-10　酶法測定總膽汁酸操作步驟

搖勻,以蒸餾水調零,用500nm波長比色,讀取各管吸光度值。

2.自動分析法 一般無法做對照管,通過設置兩點終點法,分別讀取前后兩個吸光度A 1和A 2。具體按說明書要求。

【計算】

【參考區(qū)間】 空腹TBA為(4.9±2.38)μmol/L,濃度范圍在0.14~9.66μmol/L;餐后2h為(8.22±2.91)μmol/L,濃度范圍在2.4~14.0μmol/L。

【質量保證】

1.由于血清中TBA含量低,乳酸脫氫酶(LDH)是主要的干擾物質,對實驗結果影響較大。LDH在其底物存在下(血清中含有一定量的乳酸),也可還原NAD+為NADH,產(chǎn)生高空白值,本法中加入丙酮酸鈉,抑制LDH催化乳酸為丙酮酸的反應。血清中還存在其他脫氫酶和還原性物質,如不除去,結果也會偏高。

2.試劑中加適量表面活性劑可以防止甲臜沉淀。

3.反應混合物的吸光度受蛋白質影響,故甘氨膽酸鈉標準液配制于混合血清中。

4.3α-HSD制品中含有二硫蘇糖醇,酶制劑用量過多可影響INT的還原。

【應用評價】 與其他測定微量膽汁酸方法相比,酶比色法具有快速、簡便、準確、可靠和適用等優(yōu)點。它既可手工操作,也可在自動化分析儀上進行。但試劑價格貴、不易保持。對酶量的要求嚴格,以保證酶促反應在零級反應下進行,酶量不足易產(chǎn)生誤差。此外,標準品的制備非常重要,常采用甘氨膽酸溶入小牛血清中制成凍干品。

【臨床意義】 血清膽汁酸水平是反映肝實質損傷的一個重要指標,現(xiàn)已作為常規(guī)肝功能檢測項目,對肝病診斷有重要價值。

1.急、慢性肝炎 急性肝炎血清TBA顯著增高,可達正常水平的10~100倍。急性肝炎初愈者血清TBA由最初的高值幾乎與GPT、GOT在同一時間降至正常水平,若持續(xù)不降或反而上升則有發(fā)展為慢性的可能。空腹總膽汁酸(F-TBA)和餐后2h總膽汁酸(P-TBA)測定對慢性肝炎的分型、監(jiān)測、預后和療效判定有重要意義。

2.肝硬化 肝硬化時膽汁酸的代謝能力減低,血清TBA在肝硬化的不同階段均升高,其幅度一般高于慢性活動性肝炎,即使肝硬化晚期亦如此。當肝病活動降至最低時,膽紅素、轉氨酶及堿性磷酸酶等轉為正常,血清TBA仍維持較高水平。某些肝硬化GPT等一般肝功能指標無明顯異常,而TBA升高或明顯升高,提示TBA測定對肝硬化的診斷和病情觀察是一項有價值的指標。

3.酒精性肝病 酒精性肝病(包括肝硬化)嚴重肝損傷時,血清TBA明顯增高,而輕、中度損傷增高不明顯。血清TBA測定對酒精性肝細胞損傷診斷的可信度和靈敏度優(yōu)于各種酶學檢查和半乳糖耐量試驗等指標,血清TBA和β-氨基己糖苷酶可作為酒精性肝病的診斷指標。餐后60min TBA測定對酒精性肝病的診斷更有意義,其他中毒性肝病血清TBA水平也異常。

4.膽汁淤積 血清TBA測定對膽汁淤積的診斷有較高的靈敏度和特異性,對肝外膽管阻塞和肝內(nèi)膽汁淤積的鑒別有一定價值。肝外膽管阻塞及肝內(nèi)膽汁淤積包括急性肝炎、初期膽管性肝硬化、新生兒膽汁淤積、妊娠性膽汁淤積等均可引起TBA增高。在膽管阻塞的初期,膽汁分泌減少,使血清中TBA顯著增高,且在阻塞的不同階段幾乎保持不變,而血清膽紅素水平則隨不同階段而變化。膽汁淤積肝組織中的膽汁酸含量明顯高于正常人。肝外阻塞經(jīng)引流緩解后,血清TBA水平迅速下降,而其他指標則緩慢恢復。