(一)突變類型

圖1-4　人類mtDNA結(jié)構(gòu)

線粒體基因突變類型包括點(diǎn)突變、缺失、插入以及拷貝數(shù)目突變，其中點(diǎn)突變包括錯(cuò)義及蛋白質(zhì)合成基因的突變。錯(cuò)義突變發(fā)生于mRNA相關(guān)的基因上，可導(dǎo)致多肽鏈合成過程中的錯(cuò)義突變，主要與腦脊髓性及神經(jīng)性疾病有關(guān)，如Leber遺傳性視神經(jīng)病和神經(jīng)肌??；蛋白質(zhì)生物合成基因突變?yōu)閠RNA基因突變，這類突變所致的疾病較錯(cuò)義突變所致疾病表現(xiàn)出更具系統(tǒng)性的臨床特征，并與線粒體肌病相關(guān)，典型疾病包括有肌陣攣性癲伴破碎紅纖維病(myoclonic epilepsy with ragged-red fibers，MERRF)、線粒體腦肌病伴乳酸中毒及卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic alidosis and serohe-lihe episodes，MELAS綜合征)、母系遺傳的肌病及心肌??；缺失突變主要引起絕大多數(shù)眼肌病，這類疾病多為散發(fā)而無家族史。mtDNA缺失發(fā)生的原因往往是由于mtDNA的異常重組或在復(fù)制過程中異常滑動(dòng)所致，常發(fā)生于神經(jīng)性疾病及一些退化性疾病中，如KSS綜合征；插入突變?cè)趍tDNA中較為少見；拷貝數(shù)目突變?yōu)閙tDNA拷貝數(shù)大大低于正常，可為常染色體顯性或隱性遺傳，提示該病由核基因缺陷所致線粒體功能障礙，這種突變較少，僅見于一些致死性嬰兒呼吸障礙、乳酸中毒或肌肉、肝、腎衰竭的病例。

(二)致病mtDNA突變特點(diǎn)

由于缺乏組蛋白保護(hù)并且沒有完整的突變修復(fù)功能，mtDNA突變率非常高。線粒體基因組的高突變率不但產(chǎn)生了大量的致病突變體，還產(chǎn)生了更多的序列多態(tài)性(如作為遺傳學(xué)標(biāo)記的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn))。致病性mtDNA突變一般具有以下特點(diǎn)：①突變位點(diǎn)在進(jìn)化上較為保守，突變導(dǎo)致核苷酸或氨基酸替換，或基因編碼產(chǎn)物的生物學(xué)功能喪失；②突變導(dǎo)致的生化損傷和疾病的臨床表型能夠分離；③當(dāng)突變是異質(zhì)性突變時(shí)，組織損傷程度與突變負(fù)荷呈一定的正相關(guān)；④同一突變可以從遺傳上相互獨(dú)立的患者中發(fā)現(xiàn)。致病性mtDNA突變通常位于編碼蛋白質(zhì)、tRNAs或rRNAs的基因上，并能夠引起廣泛的臨床癥狀。mtDNA突變與表型之間的關(guān)系復(fù)雜，同一mtDNA突變可以引發(fā)不同的疾病表型，例如，tRNA Leu(UUR)基因上的A3243G突變既能出現(xiàn)在線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS綜合征)患者中，也能出現(xiàn)在慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹(CPEO)、線粒體肌病、糖尿病伴耳聾患者中；另外，同一疾病表型也可以由不同的突變引起，例如，MELAS可以由20多個(gè)點(diǎn)突變(位于編碼tRNAs或呼吸鏈復(fù)合體蛋白亞基的線粒體基因上)引起，也可以由重組突變引起。一些彼此獨(dú)立的因素可以影響mtDNA疾病的臨床表現(xiàn)，包括突變體的異質(zhì)性水平、組織分布、器官對(duì)呼吸鏈的依賴程度、核背景和環(huán)境因素等。由于mtDNA突變致病的分子機(jī)制還沒有被完全闡明，突變與疾病表型之間的確切關(guān)系至今仍顯得撲朔迷離。

(三)與點(diǎn)突變相關(guān)的遺傳性疾病

mtDNA點(diǎn)突變所引起的人類遺傳性疾病主要有：Leber遺傳性視神經(jīng)病變(Leber′s heredieary optic neuropaehy，LHON)、線粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(MELAS)、肌陣攣性癲癥和破碎紅纖維病(MERRF)、神經(jīng)性肌無力-共濟(jì)失調(diào)-色素性視網(wǎng)膜炎(neuropaely ataria and retinitis pigmentosa，NARP)、母系遺傳Leigh綜合征(maternally inherited leighs syndrome，MILS)、母系遺傳糖尿病伴耳聾(maternally inherited diabetes and deafness，MIDD)、氨基糖苷類誘導(dǎo)性耳聾或非綜合征耳聾、心肌病和肌紅蛋白尿等。此外，mtDNA點(diǎn)突變還與一些代謝疾病(如高血壓病、糖尿病、高膽固醇血癥等)和神經(jīng)變性疾病(如帕金森癥、阿爾茨海默癥等)的易感性有關(guān)。

1.Leber遺傳性視神經(jīng)病變(LHON)　遺傳性視神經(jīng)病變是一種母系遺傳性疾病，主要累及男性，常伴有家族史。發(fā)病年齡常在20～30歲，但最小可僅幾歲，最大可達(dá)70多歲。雙眼可同時(shí)或先后發(fā)病，受累眼視力可突然完全喪失，也可在2年內(nèi)漸進(jìn)性下降。最終視力預(yù)后因mtDNA突變位點(diǎn)不同而不同。11778A、3460A、14484C是目前公認(rèn)的致病性最強(qiáng)的3種原發(fā)性突變。11778點(diǎn)突變的患者最嚴(yán)重，預(yù)后最差，最終視力可為無光感；3460點(diǎn)突變次之；14484點(diǎn)突變視力預(yù)后最好，而且37%～50%患者在16個(gè)月后恢復(fù)。但現(xiàn)在用更靈敏的儀器檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，許多11778點(diǎn)突變的患者也存在視功能的恢復(fù)。

另外，有些患者體內(nèi)除了攜帶3種原發(fā)突變基因外還存在其他mtDNA位點(diǎn)的突變，如3394、4216、4019、5244、4777、9438、13708、15257、15812等，稱為繼發(fā)性突變。這些突變?cè)谡Ｈ巳褐幸部赡艽嬖?，但頻率遠(yuǎn)低于LHON患者。一般來說繼發(fā)性突變多是純合性的，必須與原發(fā)性突變同時(shí)存在才可致病。以往認(rèn)為，繼發(fā)性突變可以協(xié)助疾病表達(dá)，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)這些突變并不損害患者體內(nèi)的線粒體功能，因此推測(cè)它們只是人群中的多態(tài)位點(diǎn)。

由于LHON患者男女比例顯著不同，有人猜測(cè)是否存在一連鎖突變位點(diǎn)，對(duì)線粒體原發(fā)性突變有修飾作用。但現(xiàn)在許多實(shí)驗(yàn)并未發(fā)現(xiàn)X染色體存在易感基因。因而推測(cè)男性的一些特異性生理功能、解剖結(jié)構(gòu)、生活習(xí)慣都可能是誘發(fā)其發(fā)病的因素。

核基因?qū)σ暽窠?jīng)病變的發(fā)病可能也起到不容忽視的作用。在胞質(zhì)雜合體轉(zhuǎn)移試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在胞質(zhì)雜合體中也存在復(fù)合物I活性降低，但降低程度較原發(fā)突變細(xì)胞輕，所以推論核基因在LHON發(fā)病中也發(fā)揮一定作用。

2.線粒體基因突變與糖尿病　線粒體基因突變糖尿病(mitochondrial diabetes mellitus，MDM)的發(fā)現(xiàn)是近年來糖尿病分子遺傳學(xué)研究的重要進(jìn)展之一，并成為糖尿病領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。1992年，Vanden Ouweland等報(bào)道了一個(gè)合并有糖尿病和耳聾的家系，同時(shí)存在母系遺傳史，后證實(shí)其致病原因?yàn)榫€粒體DNA(mitochondriaDNA，mtDNA)3243A→G的突變，此病被稱為母系遺傳糖尿病伴耳聾綜合征(maternally inherited diabetes and deafness syndrome，MIDD)，即線粒體基因突變糖尿病(MDM)。迄今，國內(nèi)已報(bào)道30多個(gè)家系，100多例突變攜帶者。目前已知的突變位點(diǎn)有20多個(gè)，但mtDNA轉(zhuǎn)移核糖核酸亮氨酸t(yī)RNA Leu(UUR)基因3243A→G點(diǎn)突變是最常見的突變點(diǎn)。

其他突變點(diǎn)：日本學(xué)者Kameoka等在mtDNA突變糖尿病的研究中，發(fā)現(xiàn)了線粒體tRNALys8296位點(diǎn)A→G突變，此位點(diǎn)突變是糖尿病的一個(gè)致病基因，該突變可以解釋約1%的糖尿病病因。nt3394T→C突變頻率在非胰島素依賴型糖尿病患者群為2.4%～6.0%，該突變是同質(zhì)性錯(cuò)義突變，屬于輕度有害性突變，在其他高危因素的協(xié)同作用下，誘發(fā)糖尿病。紀(jì)立農(nóng)等篩查716例非胰島素依賴型糖尿病患者得出，nt3316G→A突變發(fā)生率為2.2%，認(rèn)為該位點(diǎn)僅是mtDNA的多態(tài)性表現(xiàn)。國內(nèi)研究較多的16189T→C突變?cè)谡Ｈ巳褐械陌l(fā)生率為21%，多認(rèn)為是糖尿病易感基因，與非胰島素依賴型糖尿病的胰島素抵抗相關(guān)，而不是單基因致病突變。

(四)重組突變

mtDNA重組突變是最早被報(bào)道與人類疾病相關(guān)的mtDNA突變。雖然發(fā)生重組突變的mtDNA片段長(zhǎng)度可以從一個(gè)堿基變化到幾千個(gè)堿基，但重組突變主要分為：大片段缺失和倍增。缺失突變可以單獨(dú)存在于患者中，也能與倍增同時(shí)出現(xiàn)。最常見的一種重組突變是長(zhǎng)度在5kb左右、跨越Cytb基因和CoxⅡ基因之間區(qū)域(包含tRNAs和蛋白質(zhì)的編碼基因)的單個(gè)大片段mtDNA缺失或倍增。這種大片段重組突變通常與一些典型的疾病表型有關(guān)，如Pearson綜合征、Kearns-Sayre綜合征(KSS)、慢性進(jìn)行性外眼肌麻痹(CPEO)和Pearson骨髓-胰腺綜合征。然而，重組突變并不局限于上述幾種疾病表型，也能涉及糖尿病、聽力喪失和幾乎所有線粒體腦肌病。單個(gè)大片段的mtDNA重組突變可能形成于卵子發(fā)生時(shí)期或胚胎發(fā)育早期，與大片段缺失或倍增突變相關(guān)的疾病大多為散發(fā)性，且復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)小，據(jù)Chinnery等報(bào)道患病婦女下一代的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)僅為4.11%。

(五)體細(xì)胞mtDNA突變?cè)谀[瘤中的作用

1.mtDNA突變與腫瘤的密切關(guān)系　研究顯示不同組織發(fā)生的腫瘤其mtDNA突變位點(diǎn)不同，這可能是由于不同組織的腫瘤發(fā)生所必需的mtDNA突變率、線粒體數(shù)目和細(xì)胞分化固有數(shù)目存在差異。大體上，與實(shí)體腫瘤類型無關(guān)的mtDNA變化特點(diǎn)有兩種：一是主要的突變?yōu)閴A基替換從T→C和G→A；二是D-loop區(qū)似乎是一個(gè)體細(xì)胞突變的頻發(fā)位點(diǎn)。

腫瘤細(xì)胞線粒體C-tract呈現(xiàn)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)是目前mtDNA突變的研究熱點(diǎn)。Nomoto等對(duì)19例肝細(xì)胞癌標(biāo)本的檢測(cè)顯示，8/19(42%)C-tract缺失或插入突變和5/19(26%)其他的錯(cuò)義、插入或缺失突變，幾乎都為同質(zhì)性的突變。13/19患者的mtDNA突變不出現(xiàn)于相應(yīng)的非腫瘤區(qū)域的D-loop區(qū)，證實(shí)突變的mtDNA在腫瘤細(xì)胞中具有優(yōu)勢(shì)。Habano等對(duì)結(jié)腸癌的研究得出類似結(jié)果，他認(rèn)為同質(zhì)性突變與腫瘤相關(guān)而且符合癌細(xì)胞的厭氧生存環(huán)境。Ha等的研究顯示頭頸部癌前病變存在mtDNA的MSI變化，其增加與疾病惡性進(jìn)展呈正相關(guān)。

2.mtDNA突變與腫瘤診斷　Fliss等檢測(cè)了人膀胱、頭頸部和肺原發(fā)性惡性腫瘤的mtDNA序列，結(jié)果顯示有高頻的同質(zhì)性突變，主要涉及D-loop區(qū)和ND4亞基。基于此，作者進(jìn)一步分析了具有mtDNA突變患者的體液標(biāo)本。結(jié)果顯示，膀胱癌患者3份尿樣中均檢測(cè)出源于腫瘤的mtDNA突變；頭頸部腫瘤患者唾液標(biāo)本6/9中，肺癌患者支氣管肺泡灌洗液樣本8/10中均存在mtDNA突變。在同時(shí)具有p53基因突變的患者，mtDNA突變豐度為p53基因的10～200倍。因此，mtDNA突變可望成為有效的分子標(biāo)記用于腫瘤早期診斷。

一項(xiàng)旨在利用mtDNA同質(zhì)和異質(zhì)性突變來鑒別肝細(xì)胞癌復(fù)發(fā)和肝臟第二次腫瘤發(fā)生的研究揭示，同一起源的肝腫瘤具有相同的mtDNA突變，不同的mtDNA突變意味著不同起源的肝腫瘤發(fā)生。如果原發(fā)性腫瘤中存在的mtDNA突變，第二次發(fā)生的腫瘤中未出現(xiàn)，則后者被認(rèn)為是獨(dú)立的病變。難確定克隆關(guān)系的是原發(fā)腫瘤無突變，而第二次發(fā)生的腫瘤存在突變，這或者是第二次發(fā)生的腫瘤具有克隆趨異性，因?yàn)橥蛔兛梢园l(fā)生于腫瘤的進(jìn)展過程中；或者是獨(dú)立發(fā)生的腫瘤。Nomoto等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示只有1例與臨床腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷不符，因?yàn)槠渚哂胁煌膍tDNA突變。因此，mtDNA突變可以幫助確立克隆關(guān)系并為臨床合理治療復(fù)發(fā)或第二次發(fā)生腫瘤患者提供依據(jù)。該方法也可用于常規(guī)的肝穿刺標(biāo)本。由于mtDNA突變的多態(tài)性和不同組織發(fā)生腫瘤的差別，利用mtDNA突變作為腫瘤特異性診斷應(yīng)建立在mtDNA全序列測(cè)序和同時(shí)檢測(cè)來自同一個(gè)體的正常和病變區(qū)域的mtDNA樣本。

(六)體細(xì)胞mtDNA突變與衰老

人類衰老過程的一個(gè)重要特征，是伴隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)的各種組織線粒體功能降低。呼吸鏈功能衰竭可能在衰老過程中起作用，伴隨衰老，一些組織的狀態(tài)與呼吸速率明顯降低，組化檢查也發(fā)現(xiàn)缺乏細(xì)胞色素氧化酶活性的肌肉纖維在老年人大量增多。Fayet等選取69～82歲沒有肌肉疾病的個(gè)體來研究肌纖維中mtDNA突變情況，在8組細(xì)胞色素C氧化酶缺乏的肌纖維中檢測(cè)到5個(gè)tRNA突變，而在正常組織中沒有發(fā)現(xiàn)點(diǎn)突變；在7個(gè)細(xì)胞色素C氧化酶缺乏的個(gè)體和一個(gè)正常個(gè)體中檢測(cè)到4個(gè)不同的大片段缺失。研究表明，盡管肌肉mtDNA突變總體水平較低，但突變的積累引起了線粒體功能的嚴(yán)重?fù)p失。

大多數(shù)伴有mtDNA缺失的疾病往往在成年期開始表現(xiàn)出來，且隨著年齡的增長(zhǎng)癥狀逐漸加重，缺失的mtDNA也漸進(jìn)性增殖，提示隨年齡增長(zhǎng)可能伴有特異的mtDNA缺失。這種突變累積的結(jié)果，使線粒體氧化磷酸化的能力逐漸降低，細(xì)胞產(chǎn)生的ATP越來越少，表現(xiàn)出來的癥狀越來越明顯。老年人各組織的mtDNA存有12處以上的大片段缺失，其中以4977bp和7346bp的缺失最常見。這種隨年齡增長(zhǎng)而明顯增加的缺失只聚積在老化的有絲分裂后的細(xì)胞內(nèi)，在40～80歲年齡段隨年齡增長(zhǎng)呈指數(shù)增加。Roberto等在年老的骨骼肌中發(fā)現(xiàn)，D環(huán)中存在2個(gè)點(diǎn)突變，對(duì)來源于91個(gè)不同年齡、不同個(gè)體的活體組織中的這兩個(gè)突變的發(fā)生率和異質(zhì)水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)突變隨著年齡增加而顯著積累。在堿基缺失的患者組中存在較高的突變，而且有證據(jù)表明多堿基缺失的患者mtDNA突變的風(fēng)險(xiǎn)有增加趨勢(shì)。mtDNA突變隨年齡的增長(zhǎng)而增多，使mtDNA基因組高突變率常作為衰老過程的潛力生物學(xué)標(biāo)記。

1988年，有研究者首次證實(shí)線粒體疾病與線粒體突變之間的關(guān)系。在隨后的10余年間，研究者又發(fā)現(xiàn)許多與衰老相關(guān)的退行性疾病的主要原因是mtDNA的變異。與此相關(guān)的衰老性疾病包括阿爾茨海默癥、帕金森綜合征等。阿爾茨海默癥是一種大腦疾病，5%～10%的65歲以上的人會(huì)患這種疾病，這種疾病與損害神經(jīng)細(xì)胞的毒性蛋白質(zhì)-－β淀粉體在大腦中的堆積有關(guān)。β淀粉體進(jìn)入線粒體并與那里產(chǎn)生的一種酶相互作用，損害了線粒體，使一種損害整個(gè)神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)泄漏，造成神經(jīng)細(xì)胞的死亡，導(dǎo)致記憶的喪失和其他阿爾茨海默癥狀的出現(xiàn)。Valente等對(duì)一組歐洲家族的基因分析時(shí)發(fā)現(xiàn)了在PINKI基因上的變異，該基因編碼一種位于線粒體上的蛋白質(zhì)，他們假設(shè)，正常PINKI基因也許會(huì)保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免遭線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡。

大量研究證實(shí)正常個(gè)體也會(huì)出現(xiàn)mtDNA突變，并且隨增齡而積累。對(duì)于mtDNA突變和衰老之間關(guān)系的研究主要是利用PCR、 SSCP等方法縱向或橫向比較體細(xì)胞mtDNA突變積累和年齡增長(zhǎng)的關(guān)系，而mtDNA突變?cè)谌祟愃ダ现械拇_切作用和機(jī)制還有待于深入探討。