1．檢驗目的

對臨床標本培養(yǎng)出的真菌進行抗生素敏感性試驗，為臨床合理用藥提供依據(jù)，能夠幫助臨床醫(yī)生為患者的治療選擇合適的抗真菌藥物，也對監(jiān)測耐藥真菌的出現(xiàn)和耐藥性變化趨勢有重要意義。

2．試驗方法

目前可用于檢測抗真菌藥物敏感性試驗的方法有ATB-FUNGUS真菌藥敏試驗、紙片擴散法、液體稀釋法和E-test方法。

3．實驗原理

ATB（Authorritative、Typical、Broad權威、經(jīng)典、全面）真菌藥敏試驗采用比濁和散射測濁的原理，估計細菌生長的密度，不同抗菌藥物設置不同的閾值，以最低藥物濃度達到細菌不生長或達到80%抑制生長為最低抑菌濃度。此條包括16對杯，2對不含有任何抗生素，可作為陽性生長的對照，其他每對含有不同的抗真菌劑，有的杯用于最低抑菌濃度的測定，要測的酵母懸浮在安瓿的懸液中，然后轉(zhuǎn)到生長培養(yǎng)基中，接種到試驗條中，培養(yǎng)24到48 h后，生長與否可用肉眼觀察或用自動ATB記錄儀，所得結果可歸類成敏感、中度敏感或耐藥。

4．方法及操作

4.1 ATB-FUNGUS真菌藥敏試驗：用于酵母樣真菌。

4.1.1 首先從包裝中取出試驗條，菌株的參考材料可標在試驗條的側(cè)邊；用單純菌落在蒸餾水中植被酵母懸液，其濁度相當于2號McFarland的真菌懸液。

4.1.2 用加樣器轉(zhuǎn)100μl菌懸液到ATBF培養(yǎng)基的安瓿中，小心混合，避免有氣泡形成。

4.1.3 再用ATB吸管均勻分配已接種過菌液的ATBF培養(yǎng)基，倒到第一部分試驗條的每個杯內(nèi)，每杯135μl，每個杯有104菌數(shù)。

4.1.4 將在管頭中留下來的培養(yǎng)基放回安瓿中，以提高其pH，用已調(diào)好pH的培養(yǎng)基接種第二部分的試驗條，每杯135μl。

4.1.5 加蓋，并把試條放置30℃培養(yǎng)24～48 h。

4.1.6 結果判讀：肉眼記錄，置試驗條于垂直位置，觀察每管中可見生長物，記為“+”，不生長記為“-”；本試條中包括六種藥物，即氟胞嘧啶、兩性霉素B、制霉菌素、咪康唑、益康唑和酮康唑。對咪唑類（MIC、ECO、KET），會有殘渣狀的生長物，在這種情況時，應比較對照管的生長（表11-66）。

表11-66　ATB-FUNGUS真菌藥敏試驗

4.1.7 MIC測定：將試驗條置于水平位置，降低濃度，讀杯的結果，MIC是不生長的最后一個杯的值，記錄結果于報告單。

4.1.8 自動記錄結果：置試驗條于ATB記錄儀上，從計算機讀結果。

4.1.9 質(zhì)量控制

4.1.9.1 可選用ATCC推薦菌株同時試驗，以保證結果的準確性。

4.1.9.2 所測試菌株必須是純菌落。

4.1.9.3 嚴格按試劑盒內(nèi)操作說明進行，菌液配制完應在15 min內(nèi)接種完畢。

4.2 Etest方法：按試劑盒內(nèi)操作說明進行。

4.3 絲狀真菌的藥敏試驗方法

4.3.1 培養(yǎng)基：使用含有L-谷氨酰胺及酚紅指示劑、不含碳酸氫鈉的RPMI1640液，將10.4 g RPMI1640 藥粉溶解于900 ml雙蒸水，加MOPS（3-N-嗎啡啉丙磺酸）使終濃度為0.165 mol，邊加邊攪拌至藥粉溶解，用1 mol/L的NaOH調(diào)pH至7.0±0.1，加水至1 L，過濾滅菌后保存于4℃。

4.3.2 藥物的溶解、稀釋和儲存：不同抗真菌藥物選擇相應溶劑，氟康唑、氟胞嘧啶用滅菌水溶解，兩性霉素B、酮康唑、伊曲康唑使用二甲亞砜溶解。藥物重量按其生物活性度計算：

重量（mg）=［體積（ml）×濃度（μg/ml）］/生物活性度（μg/mg）

4.3.3 菌液：將絲狀真菌接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面上于35℃生長7 d，用1ml無菌生理鹽水沖洗斜面，獲得分生孢子懸液，靜置3～5 min，自然沉降粗大顆粒，取上層均勻混懸部分（即含有非芽生分生孢子或孢子囊孢子與菌絲的混合液）于無菌管，加蓋，在漩渦震蕩器上震蕩15 s，用分光光度計測定530 nm的光密度值，曲霉為0.09～0.11，鐮孢菌、根霉為0.15～0.17，再進行1∶50稀釋成接種液。

4.3.4 接種孵育：取已倍比稀釋抗真菌藥物及真菌接種液各100μl，混勻，于35℃孵育21～26 h（根霉）、45～50 h（曲霉、鐮刀霉）。

4.3.5 結果判讀：將每一測試孔與生長對照孔比較，肉眼可見顯著抑制真菌生長的抗真菌藥物最低濃度為MIC。

0級：清亮或無生長；

1級：少量生長或為生長對照的25%；

2級：明顯生長減少或為生長對照的50%；

3級：輕微生長減少或為生長對照的75%；

4級：生長未見減少。

兩性霉素B和伊曲康唑少有拖尾，取0級為MIC，氟康唑、氟胞嘧啶和酮康唑應取50%生長抑制為MIC。

5．臨床意義

隨著感染患者廣譜抗生素的廣泛應用和器官移植患者免疫抑制劑的增加，真菌的感染率及嚴重性均趨于嚴重，導致臨床患者的死亡率增高；同時，隨著抗真菌藥物的治療增加，真菌對抗生素的耐藥性也在增高，使得真菌的藥物敏感性測定意義更加重要，為感染患者的個體化治療提供依據(jù)；也可以進行連續(xù)監(jiān)測及流行病學調(diào)查，為臨床經(jīng)驗用藥提供依據(jù)。