培養(yǎng)基及棉塞是植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)常用的材料，培養(yǎng)基依其性狀、成分、用途的不同而有不同的分類，培養(yǎng)基和棉塞的制作與滅菌方法的掌握，是今后開展病理學(xué)研究的一項(xiàng)基本功。

一、目的要求

了解培養(yǎng)基的類型及用途，掌握常用培養(yǎng)基和棉塞的制作方法，學(xué)習(xí)滅菌原理及操作方法。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

馬鈴薯。

（二）實(shí)驗(yàn)用具（藥品）

燒杯、玻璃棒、紗布、錐形瓶、棉花、扎線、滅菌鍋、試管、葡萄糖、瓊脂、1mol/LNa OH溶液、1mol/LHCl溶液、p H試紙等。

三、內(nèi)容和方法

（一）滅菌的原理及方法

滅菌的方法有熱力滅菌、過濾滅菌、化學(xué)滅菌和輻射滅菌等，而培養(yǎng)基的滅菌一般都使用加壓蒸氣滅菌法。 加壓蒸氣滅菌法是一種迅速而有效的滅菌方法，它使用高壓蒸氣滅菌器，利用加熱產(chǎn)生蒸氣，隨著蒸氣壓力不斷增加，溫度隨之升高。通常壓力在103.4k Pa時(shí)，器內(nèi)溫度可達(dá)121.0℃，維持該溫度15~30min，可殺滅包括芽孢在內(nèi)的所有微生物。 該方法具有穿透力強(qiáng)，傳導(dǎo)快，能使微生物蛋白質(zhì)較快變性或凝固的特點(diǎn)，作用可靠，操作簡便。

（二）常用培養(yǎng)基PDA的制作方法

1.稱量

稱200g去皮的馬鈴薯并切成玉米粒大小的小塊，用燒杯量取1000m L水。

2.煮沸

將量好的馬鈴薯和水加入鍋中，加熱煮沸15min；煮好后用4層紗布過濾，并定容至1000m L；加入17g瓊脂條加熱至瓊脂完全熔化即可。

3.定容、調(diào)節(jié)p H

加入20g葡萄糖，用玻璃棒攪拌使葡萄糖完全溶解，最后定容至1000m L，并用1mol/L的Na OH或1mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)p H至7.0。

4.分裝、滅菌

將配制好的PDA分裝到錐形瓶或試管中，并包扎好瓶口或試管口，置于滅菌鍋中，121℃滅菌30min。注意試管和錐形瓶的分裝容量標(biāo)準(zhǔn)。

（三）棉塞的制作方法

取1塊適當(dāng)大小的紗布，將其中心鋪于管口任其自然下垂至管壁，將試管上端與紗布一并握住，用1根小木棒或玻璃棒將紗布中心向管內(nèi)推進(jìn)，至該棉塞所需長度后握緊試管上端，用小木棒或玻璃棒將適量棉花向管內(nèi)填塞并壓緊，充實(shí)后將紗布尾端斂緊，抽出1/3長度，散開紗布向棉塞尾部加適量棉花并壓緊使之略大于試管口，再斂緊尾部紗布并用棉線扎緊，剪去多余的線頭和紗布即可。

（四）注意事項(xiàng)

1.滅菌鍋使用過程中應(yīng)該注意以下問題：

（1）檢查滅菌鍋中的存水量，加水到指定的指標(biāo)。

（2）在加熱過程中，當(dāng)空氣完全排除后（當(dāng)蒸氣開始有力地沖出時(shí)）關(guān)閉氣門。

2.在培養(yǎng)基分裝的過程中，不要讓培養(yǎng)基沾到瓶口上，避免被污染。

3.棉塞制作時(shí)，棉花的填塞要連續(xù)均勻，避免形成松緊不一的兩、三個(gè)節(jié)段。

四、實(shí)習(xí)時(shí)間

1天。

五、作業(yè)與思考題

1.每人上交帶棉塞的試管培養(yǎng)基2支、三角瓶1個(gè)。

2.按性狀和用途可將培養(yǎng)基分為哪些類型？試舉例說明。

3.在分裝培養(yǎng)基過程中，需要注意什么？

4.簡述蒸汽滅菌的操作步驟，并說一說應(yīng)注意哪些安全環(huán)節(jié)。