種子帶菌常成為病害發(fā)生的重要初染源和病害遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。因此，種子檢驗(yàn)是病害防治和病害研究的重要手段，其主要作用有：（1）用于植物檢疫；（2）用于種子質(zhì)量檢驗(yàn)，能判斷其是否符合良種的標(biāo)準(zhǔn)、決定其能否調(diào)運(yùn)及種植；（3）了解種子帶菌種類、帶菌量及病菌潛伏部位，并依據(jù)此結(jié)果選擇種子處理方法及藥劑；（4）用于病害發(fā)生與侵染循環(huán)的研究。常用的種子檢驗(yàn)方法有：直接檢驗(yàn)、過篩檢驗(yàn)、洗滌檢驗(yàn)、分離檢驗(yàn)、解剖檢驗(yàn)、萌芽檢驗(yàn)及隔離栽培檢驗(yàn)。 此外，還可用噬菌體檢驗(yàn)、血清學(xué)反應(yīng)檢驗(yàn)、電鏡檢驗(yàn)、熒光檢驗(yàn)、化學(xué)檢驗(yàn)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)等。 總之，檢驗(yàn)要根據(jù)不同的材料，選用簡單易行、快速準(zhǔn)確的方法，有時(shí)還需要用幾種不同的方法檢驗(yàn)，才能做出決定。

同時(shí)，種子帶菌也是當(dāng)?shù)夭『U(kuò)展蔓延的重要途徑。 進(jìn)行種子消毒處理，消滅種子所帶病原菌，是切斷遠(yuǎn)程傳病、防止病害迅速擴(kuò)大蔓延的重要方法，是病害防治的一種重要措施。 并且種子體積小，又比較集中，易于人為管理。 當(dāng)然，任何種子處理方法都應(yīng)以不損害種子發(fā)芽率為前提條件。 因此，種子處理不僅要注意對(duì)種子本身的影響，還要觀察殺菌效果、考慮農(nóng)藥的毒性和殘留。

一、目的要求

通過實(shí)驗(yàn)，掌握最常用的種子檢驗(yàn)方法，即洗滌檢驗(yàn)、分離培養(yǎng)檢驗(yàn)和保濕培養(yǎng)檢驗(yàn)，了解種子帶菌的主要病原菌種類。 并在此基礎(chǔ)上通過具體操作掌握常用的種子處理方法，明確種子處理的作用和效果，比較各種處理方法和藥劑的優(yōu)劣。

二、材料和用具

（一）實(shí)驗(yàn)材料

帶菌稻種、棉種。

（二）實(shí)驗(yàn)用具

顯微鏡，手柄放大鏡，離心機(jī)，天平，三角瓶，挑針，鑷子，酒精燈，滴管，滅菌吸水紙，紗布，載玻片，蓋玻片，滅菌水和乳酚油滴瓶，培養(yǎng)基（WA、PDA），滅菌水，0.1%的肥皂水，0.1%的升汞溶液，酒精（30%和70%），量筒（100m L），接物測(cè)微尺，接目測(cè)微尺，紐罷爾血球計(jì)數(shù)器，生石灰，殺菌劑（PCNB、拌種雙、拌種靈和多菌靈），藥匙，燒杯，電爐，電熱恒溫水浴鍋，花缽，瓷盤，玻璃棒，標(biāo)簽，滅菌培養(yǎng)皿，來蘇爾等。

三、內(nèi)容和方法

（一）種子檢驗(yàn)

1.用洗滌法檢驗(yàn)稻種外表附著的真菌種類和孢子負(fù)荷量

（1）取稻種100粒放入三角瓶中，注入滅菌水20m L，加0.1%的肥皂水幾滴，強(qiáng)烈搖動(dòng)洗刷（手搖40次以上）。

（2）將洗滌液注入2個(gè)離心管中，每管1/2，用粗天平平衡，1000r/min離心5min。

（3）取出離心管，倒去上清液，保留底部沉淀物，每管再加入0.5m L滅菌水。

（4）用滴管將沉淀物攪拌均勻后，每管各取1滴制片，在顯微鏡下觀察（放大倍數(shù)約300倍）。

鏡檢時(shí)，先找病原菌種類，并將病原菌名稱及其簡圖填入表23-1。

表23-1 稻種表面帶菌種類

2.測(cè)定稻種稻瘟病菌或稻粒黑粉病菌孢子負(fù)荷量

（1）血球計(jì)測(cè)定法

紐罷爾血球計(jì)數(shù)器是一種玻璃片，其上有若干小方格，每一小方格的面積為00.5mm×0.05mm，深度為0.1mm，因此每個(gè)小方格的體積為0.00025mm3。 操作時(shí)是將血球計(jì)數(shù)器的吸管與玻璃片充分洗凈并干燥，用吸管吸取離心后的沉淀懸浮液注入計(jì)數(shù)器內(nèi)（注意液體不能溢出，蓋片下也不可有氣泡），然后在顯微鏡下檢查，通常是觀察80個(gè)小方格。記錄每一小方格內(nèi)的孢子數(shù)，并算出每一小方格的孢子平均數(shù)。以小方格內(nèi)孢子平均數(shù)乘以“4×106”，即得出1m L所含有的孢子數(shù)。由此即可求出每粒稻種表面的平均孢子負(fù)荷量。

（2）顯微鏡計(jì)測(cè)法

即先在顯微鏡下確定每一視野的平均孢子數(shù)，再通過一系列的計(jì)算方法確定一粒稻種表面的孢子負(fù)荷量，具體步驟如下。

①測(cè)定視野半徑

將接物測(cè)微尺安放在載物臺(tái)上，測(cè)定一個(gè)視野的直徑，重復(fù)3次，求出視野半徑R的平均值。

②計(jì)算顯微鏡視野中的孢子數(shù)

用滴管將制成的孢子沉淀液攪拌均勻后，每滴管各取1滴分別制片，每一玻片棋盤式檢查10個(gè)視野，重復(fù)3次，算出每一視野的孢子平均數(shù)A。

③測(cè)定1m L水的滴數(shù)

用前面所用滴管多次吸取50m L水并一滴一滴地滴下，統(tǒng)計(jì)50m L水的滴數(shù)，重復(fù)3次，求出1m L水的平均滴數(shù)M。

④以下列公式計(jì)算稻種表面平均孢子負(fù)荷量

X=A×K÷洗滌稻種粒數(shù)

X：每粒稻種表面平均孢子負(fù)荷量

A：每一視野的孢子平均數(shù)

K：固定系數(shù)K=H×M÷πR2

H：蓋玻片的面積（一般為18mm×18mm或20mm×20mm）

M：1m L水的滴數(shù)

R：視野半徑

3.用分離培養(yǎng)法檢驗(yàn)稻種內(nèi)部的病原菌

（1）將WA熔化后倒入滅菌培養(yǎng)皿（每皿10m L）備用。

（2）依次將70%的酒精（1皿）、0.1%的升汞液（1皿）、滅菌水（3皿）倒入滅菌培養(yǎng)皿中，貼上標(biāo)簽。

（3）取10粒稻種放入70%的酒精中濕潤數(shù)秒，以除去稻種表面的氣泡，然后放入0.1%的升汞液中消毒60s，再用滅菌水清洗3次，放于滅菌吸水紙上吸干表面水分。

（4）將稻種置于WA平板上，每皿5粒，7d后鏡檢。

（5）鑒定：挑取各粒稻種表面長出的各病原菌，制片鏡檢，記錄每粒稻種表面長出的病原菌種類。

4.用保濕培養(yǎng)法檢驗(yàn)稻種上稻瘟病的帶菌率

取1套滅菌培養(yǎng)皿，將4層滅菌吸水紙放入皿底，倒入滅菌水使吸水紙充分濕潤后放入2根曲玻棒。隨機(jī)取稻種100粒，清水沖洗后放于滅菌載玻片上，每片50粒，整齊排列成2行，使護(hù)穎一端向外，并將載玻片平放于曲玻棒上， 25℃恒溫保濕培養(yǎng)2~3d，逐粒鏡檢護(hù)穎部，記錄稻種上稻瘟病的帶菌率。

（二）種子處理

1.稻種浸種（石灰水浸種）

恰當(dāng)?shù)慕N方法不僅能消滅種子內(nèi)外的病原菌，而且有提高產(chǎn)量的趨勢(shì)。 石灰水浸種對(duì)防治水稻稻瘟病、胡麻葉斑病、惡苗病和小麥散黑穗病、腥黑穗病、稈黑粉病等都有很好的效果。 同時(shí)，用石灰水浸種，取材容易，操作簡單，對(duì)人畜無毒害，對(duì)種子生理亦無毒害。 因此石灰水浸種是較常用的一種種子消毒方法。

石灰水浸種殺菌并不是利用石灰本身的殺菌作用。 因?yàn)榍逅N被證明同樣具有一定的殺菌效果。 水中加入生石灰的目的在于防腐。 石灰水殺菌作用的原理被認(rèn)為有兩種：其一是種子處于水中無氧狀態(tài)下，其呼吸作用會(huì)產(chǎn)生酒精和醛類物質(zhì)，這些物質(zhì)可以殺菌，是“生理殺菌”作用；其二是種子處于水中，其周圍所沾染的某些嫌氣性細(xì)菌由于發(fā)酵產(chǎn)生大量對(duì)病原菌有害的蟻酸和琥珀酸等滲入種子內(nèi)部，是“有機(jī)酸發(fā)酵殺菌”作用。 相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明這兩種作用確實(shí)存在。

（1）操作方法

將500g生石灰用少量水化開，再加50kg水，配成1%的石灰水，浸沒種子后水面高出10~20mm，以免種子發(fā)芽（50kg石灰水可浸種30kg）。先要充分?jǐn)噭?dòng)，并加蓋，此后不再攪動(dòng)直至達(dá)到浸種時(shí)間。 然后撈出晾干播種。

提示:浸種時(shí)間的長短要因氣溫高低而定,一般35℃時(shí)需1d,30℃時(shí)需1~2d,25℃時(shí)需2d,20℃時(shí)需3d,15℃時(shí)需6d。

（2）注意事項(xiàng)

①要求是新鮮的生石灰；②水要求清潔，以減少腐敗因素；③調(diào)制石灰水時(shí)必須先用少量清水將石灰化開，再按約1∶100的比例加入清水，否則生石灰塊不能在水中溶解；④浸種種子不宜過多，如果水中種子層集過厚，種子有發(fā)熱并喪失發(fā)芽能力的危險(xiǎn)，因此一般以不超過0.6m為度；⑤種子必須浸入水中10~20mm并一直保持此水層，否則有發(fā)芽的危險(xiǎn)；⑥浸種應(yīng)避免陽光直射，防止水溫升高影響浸種時(shí)間；⑦浸種時(shí)間內(nèi)嚴(yán)禁攪動(dòng)；⑧浸種最好在晴天進(jìn)行，晴天氣溫高，浸種時(shí)間短，浸后種子也易干燥，浸種后如遇陰雨，種子不易干燥，可用草木灰拌種，并攤晾于通風(fēng)處，避免種子發(fā)芽和霉?fàn)€；⑨受傷、發(fā)育不良、發(fā)芽力弱的種子不能用石灰水浸種；⑩預(yù)先用硫酸銨等汰選過的種子，必須經(jīng)過清水漂洗后才能用石灰水浸種，經(jīng)過石灰水處理的種子如果要再用矮壯素（CCC）處理，矮壯素處理前也必須要充分干燥。

（3）浸種效果檢查

①檢查處理后的種子發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率

取經(jīng)過處理和未處理的種子各100粒，分別放于充分保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)（每皿50粒，各皿條件一致），置于25~30℃溫箱中發(fā)芽，記錄開始發(fā)芽的日期和每日發(fā)芽數(shù)，最后計(jì)算發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率。

②檢查種子處理的滅菌效果

取經(jīng)過處理和未處理的種子各15粒，無菌操作放置于WA平板上（每皿5粒），25℃培養(yǎng)5d后鏡檢，記錄病原菌的種類和出現(xiàn)頻率。

2.棉種溫湯浸種和拌種

（1）種子接菌

用人工培養(yǎng)的炭疽菌制成孢子懸浮液并浸棉種12h，然后取出棉種晾干備用。

（2）土壤接菌

將用麥粒沙培養(yǎng)的立枯病菌的固體菌以1∶100的比例與土壤混勻，裝入花缽中，插上標(biāo)簽備用。

（3）溫湯浸種

①將接菌的棉種在冷水中預(yù)浸24h；②將種子放入65~70℃的溫水中，種子與水的比例為1∶4，并在55~60℃下恒溫保持30min；③取出晾至絨毛發(fā)白，備用。

（4）藥劑拌種、蓋種

將拌種雙（或拌種靈、多菌靈）與細(xì)沙或過篩草木灰混勻，拌上已處理的棉種，拌成羊糞狀，并可用藥土蓋種（與種子混合播種亦可），每窩蓋藥土100~150g。

（5）處理效果檢查

取經(jīng)過處理的棉種100粒，分別播種于接菌土壤，同時(shí)以未接菌的土壤為空白對(duì)照，以0.5%PCNB處理的土壤作參考對(duì)照。棉種播種后按一般栽培方法進(jìn)行管理，并注意觀察和記錄種子發(fā)芽情況與發(fā)病情況。

①種子發(fā)芽情況觀察記錄

參照稻種浸種處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)檢查方法進(jìn)行。

②發(fā)病情況觀察

棉苗長出第一片真葉后，將其拔起并用水清洗干凈，檢查炭疽病、立枯病等的發(fā)病情況（必要時(shí)進(jìn)行分離培養(yǎng)觀察）。將以上結(jié)果記錄于表23-2。

表23-2 棉種處理效果記錄

五、作業(yè)與思考題

6~8學(xué)時(shí)。

四、實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)

1.記錄并計(jì)算種子檢驗(yàn)結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果做簡要的分析，并提出種子處理的意見。

2.寫一份種子處理的試驗(yàn)報(bào)告，內(nèi)容包括處理方法、處理效果，比較各處理方法的優(yōu)劣，并分析其原因。