柯赫氏法則是植物病理學(xué)遵循的一項基本原理，它能夠證明引起某一病害的病原物，進(jìn)而開展病原物特性的研究以及寄主植物-病原物的互作關(guān)系探究等。

一、目的要求

學(xué)習(xí)柯赫氏法則的內(nèi)容，掌握基本的病原物分離和接種的方法，明確引起某一病害的病原物的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

二、材料和用具

（一）實驗材料

健康大豆幼苗（培育4d后）、大豆疫?。≒hytophthora sojae）病樣、健康馬鈴薯薯塊、馬鈴薯晚疫?。≒.in festans）病樣。

（二）實驗用具（藥品）

滅菌培養(yǎng)皿、玻璃棒、接種針、酒精燈、5%的Na Cl O消毒液、75%的酒精、剪刀、手術(shù)刀、鑷子、滅菌濾紙、移液槍、接種針、V8培養(yǎng)基、利福平、超凈工作臺等。

三、內(nèi)容和方法

（一）病原菌的分離、純化

在病組織的各個部位和其他基物中，病原細(xì)菌常常是和其他微生物混雜在一起的。 為了獲得某微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧氣等條件的不同要求，供給它適宜的生活條件，即讓病原細(xì)菌生活在適宜的培養(yǎng)基上，或加入某種抑制劑創(chuàng)造只利于此菌生長，而抑制其他菌生長的環(huán)境，從而得到純菌株。 為了獲得分離菌的純培養(yǎng)，必須要進(jìn)行分離菌的純化，病原菌的分離中最常用到的是組織分離法，操作簡單方便。

1.準(zhǔn)備工作

工作臺滅菌，準(zhǔn)備6個滅菌培養(yǎng)皿，其中1個加入75%的酒精，1個加入5%的Na Cl O消毒液，3個加滅菌水，1個加滅菌濾紙。

2.取材

選取發(fā)病癥狀比較典型、新鮮較嫩的病組織，用75%的酒精將組織表面先消毒，待組織表面干燥后用剪刀或手術(shù)刀切取大豆粒大小的病健交界處組織。

3.消毒

將取好的組織放置于事先準(zhǔn)備好的5%的Na Cl O消毒液中，消毒1~2min。

4.漂洗

將消好毒的植物組織放到滅菌水中，漂洗30~50s，依次漂洗3次。

5.干燥

滅好菌的植物組織放置于事先準(zhǔn)備好的濾紙上，過一會兒可以翻轉(zhuǎn)一下，使其快速干燥。

6.培養(yǎng)

將干燥后的植物組織放置于平板培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)。

7.純化

待培養(yǎng)基上植物組織塊周圍長出菌絲時，將其接種到新的培養(yǎng)基上，再次培養(yǎng)，直到得到純的病原物培養(yǎng)物時保存菌種。

（二）病原菌的接種、發(fā)病和再分離

取數(shù)皿之前分離所得的病原菌，切成小菌絲塊后，加入V8培養(yǎng)基中液體培養(yǎng)48h，再換水3次。 換水18h后吸取液體（含有大量游動孢子的菌懸液），將菌懸液用移液槍滴到大豆幼苗上，并在恒溫條件下（25℃）保濕1d。接下來每天觀察發(fā)病情況，并做好記錄。 從發(fā)病大豆幼苗的病健交界處分離病原菌，與最初獲得的分離物進(jìn)行對比。

（三）柯赫氏法則的內(nèi)容

1.在患病植物上常伴隨有一種病原微生物存在。

2.該微生物可在離體條件或人工培養(yǎng)基上分離純化而得到純培養(yǎng)。

3.將純培養(yǎng)接種到相同品種的健株上，出現(xiàn)癥狀相同的病害。

4.從接種發(fā)病的植物上再分離到其純培養(yǎng)，性狀與接種物相同。

（四）注意事項

1.病原物分離過程中，滅菌時間不能太久，避免病原菌被殺死，無法分離到所需病原菌；滅菌時間也不能太短，避免有太多雜菌，不利于病原菌的純化。

2.病原菌接種時，菌懸液濃度不能太高或太低，噴灑的菌懸液不宜太多，看到葉片上有一層薄霧，但水滴不會掉下即可。

3.病原菌的純化中，要及時地轉(zhuǎn)接到新的平板，這樣更有利于分離到較純的培養(yǎng)物。

四、實習(xí)時間

2天。

五、作業(yè)與思考題

1.每人書寫實驗報告1份，詳細(xì)記述實驗過程及觀測結(jié)果。

2.如何判斷所獲得的分離物是否為純培養(yǎng)物？

3.在柯赫氏法則證病實驗中，運用到了哪些植物病理學(xué)實驗技術(shù)？ 試舉例說明。