二、微生物DNA的提取

（一）實驗原理

為了研究微生物中遺傳物質DNA的生物、化學和物理特性，必須分離得到具有高度聚合態(tài)的天然DNA。

由于細菌具有堅韌的細胞壁，有的細菌對十二烷基磺酸鈉（SDS）有抗性，因此可先用溶菌酶溶解細胞壁，然后再用SDS處理，使菌體進一步溶解而釋放出核酸與蛋白質。另外SDS具有抑制脫氧核糖核酸酶的作用并使部分蛋白質變性。溶菌后所得的高黏度懸液在pH值為8.2的水飽和酚的作用下，可以使DNA活性不喪失而蛋白質變性，離心去除變性蛋白質。但必須注意細菌細胞中含有大量的RNA，如要得到較純的DNA可用核糖核酸酶處理，使RNA降解而除去，也可用異丙醇選擇性的沉淀DNA，而RNA留在溶液中，最后用95％乙醇作沉淀劑而得白色纖維狀的DNA。

（二）實驗藥品

1．0.15mol/L NaCl-0.1mol/L EDTA溶液，pH值為8.0。稱取8.76g氯化鈉，37.2g乙二胺四乙酸二鈉，溶于800mL蒸餾水中，并以NaOH調至pH8.0，定容到1000mL；

2．Tris-SDS緩沖液：pH值為9.0，0.1mol/L Tris（三羥甲基氨基甲烷）緩沖液中含有1％SDS和1mol/L氯化鈉；

3．水飽和酚：新鮮重蒸酚用水飽和后，用5mol/L NaOH調至pH值為8.2；

4．SSC溶液：含0.15mol/L氯化鈉和0.015mol/L檸檬酸三鈉的溶液，pH值為7.0；

5．0.1×SSC溶液：取SSC溶液用蒸餾水稀釋10倍即成；

6．10 SSC溶液：含1.5mol/L氯化鈉和0.15mol/L檸檬酸三鈉的溶液；

7．結晶溶菌酶：（生化試劑，活力10，000～20，000單位），以氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉（pH值為8.0）溶液配成2mg/mL的酶液；

8．結晶牛胰核糖核酸酶（RNase，生化試劑），以0.1mol/L氯化鈉-0.01mol/L pH值為5.4醋酸鹽緩沖液配成2mg/mL的酶液，使用前此酶先在80℃水浴中加熱10min進行預處理，使污染的脫氧核糖核酸酶失去活性；

9．干冰；

10．NaCl（C.P.）；

11．70％乙醇，95％乙醇。

（三）實驗方法

1．枯草桿菌（B.Subtilis）的培養(yǎng)：在20個250mL三角燒瓶內分別加30mL肉湯培養(yǎng)基，在1.05kg/cm²（溫度為121℃）滅菌15min，冷卻后接種，在37℃搖床上動態(tài)培養(yǎng)12～15h。

2．菌體收集及洗滌：將枯草桿菌培養(yǎng)液合并在冰水浴中預冷，經3000r/min離心20min，棄去上清液，以預冷的25mL氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉（pH值為8.0）溶液洗滌菌體，經3000r/min離心20min，棄去上清液。

以少量氯化鈉-乙二胺四乙酸二鈉（pH值為8.0）溶液將菌體完全轉移到已稱重的刻度離心管中（重量記為W₁），經3000r/min離心20min，小心吸去上清液后稱重（重量記為W₂），計算出濕菌體重量W。

3．溶菌：加入與濕菌體同體積的2mg/mL溶菌酶溶液，攪勻后在37℃水浴中保溫10～20min，當菌液開始發(fā)黏時取出，倒于50mL燒杯中，立即將燒杯放入干冰浴中冷凍。按1g濕菌體加8mLTris-SDS緩沖液的比例把緩沖液加入到已冷凍的菌體中，用玻棒搗碎，使成懸浮液。在60℃水浴中使此懸浮液溫熱到完全融化。溶菌完成后得到黏稠狀溶液。

4．酚去蛋白質：已溶菌的懸浮液置于帶磨口塞的細口瓶中，加入等體積的水飽和酚，在4℃下手搖20min，得到乳濁液于3000r/min離心15min，離心后分三層，上層液相含有DNA，中間為變性蛋白質，下層為酚層。小心吸出上層液相，量其體積，再加等體積的水飽和酚抽提去蛋白質。如此反復3～4次直至中間蛋白質層極少或消失為止。小心吸出上層水相，并量其體積。

5．核糖核酸酶去RNA：在含DNA的上層水相中，加經預處理過的2mg/mL核糖核酸酶溶液使此酶的最終濃度為50μg/mL，混合液在37℃下保溫30min，冷卻后再加等體積的水飽和酚，4℃下?lián)u動10min，離心后，收集含有DNA的上層水相，量其體積。

6．DNA的沉淀：加2倍于DNA溶液體積的預冷95％乙醇，即有白色纖維狀的DNA沉淀析出，以玻棒緩慢轉動，白色纖維狀的DNA即纏繞于玻棒上。

DNA沉淀分別在70％、95％乙醇中洗滌后，壓干，將此DNA放入試管內，加4mL0.1SSC溶液，待DNA溶解后補加0.4mL 10 SSC溶液，使DNA成1 SSC溶液。

7．含量測定：改良二苯胺法測定DNA含量（見實驗八中二），F(xiàn)olin-酚試劑法測蛋白質含量（見實驗五中第二點）。計算出每克濕菌體中DNA的含量及DNA制品中蛋白質的含量。

（四）實驗記錄

1．DNA含量測定（見實驗八中第二點）。

2．Folin-酚試劑法測定蛋白質含量（見實驗五中第二點）。