人工制備抗體_免疫學(xué)與免疫制劑

第四節(jié)　人工制備抗體

抗體在疾病診斷和免疫防治中發(fā)揮重要作用，故對(duì)抗體的需求越來(lái)越大。人工制備抗體是大量獲得抗體的重要途徑。早年人工制備抗體的方法主要是以相應(yīng)抗原免疫動(dòng)物，獲得抗血清。由于天然抗原常含多種不同抗原表位，同時(shí)抗血清也未經(jīng)免疫純化，故所獲抗血清是含多種抗體的混合物，即多克隆抗體（polyclonal antibody）。用于制備抗血清的動(dòng)物由早期的小鼠、大鼠、兔、羊等小動(dòng)物發(fā)展到馬等大動(dòng)物，但所獲抗體的質(zhì)與量均不敷現(xiàn)代醫(yī)學(xué)生物學(xué)實(shí)踐之需。

1975年，Kohler和M ilstein建立了體外細(xì)胞融合技術(shù)，獲得免疫小鼠脾細(xì)胞與惡性漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞，從而使得規(guī)?；苽涓咛禺愋?、均質(zhì)性的單克隆抗體（monoclonal antibody，M cAb）成為可能。

一、多克隆抗體

在含多種抗原表位的抗原物質(zhì)刺激下，體內(nèi)多個(gè)B細(xì)胞克隆被激活并產(chǎn)生針對(duì)多種不同抗原表位的抗體，其混合物即為多克隆抗體。多克隆抗體是機(jī)體發(fā)揮特異性體液免疫效應(yīng)的關(guān)鍵分子，具有中和抗原、免疫調(diào)理、介導(dǎo)CDC、ADCC等重要作用。在體外，多克隆抗體主要來(lái)源于動(dòng)物免疫血清、恢復(fù)期病人血清或免疫接種人群。其特點(diǎn)是來(lái)源廣泛、制備容易。多克隆抗體是針對(duì)不同抗原表位的抗體的混合物，而并非僅針對(duì)某一特定表位，其缺點(diǎn)是:特異性不高、易發(fā)生交叉反應(yīng)，也不易大量制備，從而應(yīng)用受限，圖4-12為多克隆抗體制備示意圖。

二、單克隆抗體

制備單一表位特異性抗體的理想方法是獲得僅針對(duì)單一表位的漿細(xì)胞克隆，使其在體外擴(kuò)增并分泌抗體。然而，漿細(xì)胞在體外的壽命較短，也難以培養(yǎng)。為克服此缺點(diǎn)，Kohler和M ilstein將可產(chǎn)生特異性抗體但短壽的漿細(xì)胞與無(wú)抗原特異性但長(zhǎng)壽的惡性漿細(xì)胞瘤細(xì)胞融合，建立了可產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞和單克隆抗體技術(shù)（圖4-13）。

圖4-12　多克隆抗體制備示意圖

圖4-13　單克隆抗體的制備

單克隆抗體技術(shù)的基本原理是:哺乳類(lèi)細(xì)胞的DNA合成分為從頭（do novo）合成和補(bǔ)救（Salvage）合成兩條途徑。前者利用磷酸核糖焦磷酸和尿嘧啶，可被氨基喋呤（A）阻斷；后者則在次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（HGPRT）存在下利用次黃嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）；脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇（PEG）作用下可發(fā)生細(xì)胞融合；加入H A T選擇培養(yǎng)基（含H、A和T）后，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因其從頭合成途徑被氨基喋呤阻斷而又缺乏HGPRT不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA，因而死亡；未融合的脾細(xì)胞因不能在體外培養(yǎng)而死亡；融合細(xì)胞因從脾細(xì)胞獲得HGPRT，故可在HA T選擇培養(yǎng)基中存活和增殖。

融合形成的雜交細(xì)胞系稱(chēng)為雜交瘤（hybridoma），其既有骨髓瘤細(xì)胞大量擴(kuò)增和永生的特性，又具有免疫B細(xì)胞合成和分泌特異性抗體的能力。

單克隆抗體在結(jié)構(gòu)和組成上高度均一，抗原特異性及同種型一致，易于體外大量制備和純化。因此，其具有純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無(wú)血清交叉反應(yīng)、制備成本低等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于疾病診斷、特異性抗原或蛋白的檢測(cè)和鑒定、疾病的被動(dòng)免疫治療和生物導(dǎo)向藥物制備等。

三、基因工程抗體（genetic engineering antibody）

單克隆抗體問(wèn)世后，在生命科學(xué)理論研究和臨床實(shí)踐中得到極為廣泛的應(yīng)用。但是，迄今所獲單克隆抗體多為鼠源性，鼠免疫球蛋白會(huì)使機(jī)體產(chǎn)生人抗鼠抗體反應(yīng)，導(dǎo)致被快速清除，半衰期短，需給藥次數(shù)多、劑量大，鼠抗體可能引起嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)。如何去除M cAb的免疫原性而保留其免疫反應(yīng)性？理想的方案是M cAb只包含人的氨基酸序列，無(wú)鼠的氨基酸成分。即按不同的需要，將抗體的基因進(jìn)行加工、改造和重新裝配，然后再導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)的抗體分子，這也就是第三代抗體。

與單克隆抗體相比，所具有的優(yōu)點(diǎn)有:

1.通過(guò)基因工程技術(shù)的改造，可降低甚至消除人體對(duì)抗體的排斥反應(yīng)；

2.基因工程抗體的分子量較小，可部分降低抗體的鼠源性，更加有利于穿透血管壁，進(jìn)入病灶的核心部位；

3.可采用原核細(xì)胞、真核細(xì)胞和植物等多種表達(dá)方式，大量表達(dá)抗體分子，大大降低生產(chǎn)成本。

如人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）、改型抗體（reshaped antibody）、雙特異性抗體（bispecific antibody）、小分子抗體等。

圖4-14　小鼠嵌合抗體

圖4-15　改型抗體

（一）人-鼠嵌合抗體（chimeric antibody）

人-鼠嵌合抗體是將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體（圖4-14）。構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程是:將鼠源單抗的可變區(qū)基因克隆出來(lái)，連到包含有人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其他元件（如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等）的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞（如骨髓瘤細(xì)胞、CHO細(xì)胞）中表達(dá)。

（二）改型抗體或稱(chēng)CDR移植抗體

CDR移植即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區(qū)內(nèi)，所得到的抗體稱(chēng)CDR移植抗體或改型抗體，也就是人源化抗體（圖4-15）。美國(guó)正式上市的11種治療性單抗中多數(shù)是改型抗體，優(yōu)點(diǎn):（1）特異性較強(qiáng)；（2）不易發(fā)生變態(tài)反應(yīng)；（3）在人體內(nèi)維持的時(shí)間較長(zhǎng)。

圖4-16　雙特異性抗體

（三）雙特異性抗體

雙特異性抗體是指能同時(shí)識(shí)別兩種抗原的抗體（圖4-16），一種為對(duì)應(yīng)腫瘤相關(guān)抗原，另一種為對(duì)應(yīng)效應(yīng)成分。即既能結(jié)合靶腫瘤細(xì)胞又能結(jié)合高細(xì)胞毒性的效應(yīng)細(xì)胞，將效應(yīng)細(xì)胞富集在腫瘤周?chē)瑢?shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷和裂解。特點(diǎn):除了能特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞外，還能將循環(huán)血液中的免疫效應(yīng)細(xì)胞再導(dǎo)向至腫瘤細(xì)胞處，從而使效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤活性增強(qiáng)，發(fā)揮免疫導(dǎo)向作用。

（四）小分子抗體

小分子抗體包括Fab、Fv或ScFv、單域抗體及最小識(shí)別單位等（圖4-17）。小分子抗體有很多優(yōu)點(diǎn):可以用細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)，成本低；分子小，穿透力強(qiáng)；不含F(xiàn)c，沒(méi)有Fc帶來(lái)的效應(yīng)；在體內(nèi)循環(huán)的半衰期短，易清除，利于解毒排出；易于與毒素或酶基因連接，便于制備免疫毒素或酶標(biāo)抗體。

圖4-17　小分子抗體

【理解與思考】

1.設(shè)想你是免疫球蛋白，向別人介紹你是如何產(chǎn)生的？

2.當(dāng)機(jī)體受到病原微生物入侵，你作為免疫球蛋白，能做什么？如何做？在管腔如消化道或是在血液中免疫球蛋白又有什么不同的作用？

3.你是產(chǎn)生免疫球蛋白的漿細(xì)胞，請(qǐng)你將五種免疫球蛋白做一分工。

【課外拓展】

1.免疫球蛋白有哪些血清型？

2.基因工程抗體還有哪些種類(lèi)？有何特點(diǎn)？各有何作用？

【課程實(shí)驗(yàn)與研究】

1.設(shè)計(jì)一個(gè)檢測(cè)不同免疫球蛋白的實(shí)驗(yàn)。

2.設(shè)計(jì)一種檢測(cè)機(jī)體受到抗原刺激后抗體產(chǎn)生含量的分布圖。

3.設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn):檢測(cè)B淋巴細(xì)胞的種類(lèi)、數(shù)量及轉(zhuǎn)化成漿細(xì)胞的能力。

4.設(shè)計(jì)一種方案，檢測(cè)抗體的調(diào)理作用。

【課程研討】

1.不同的抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體一樣嗎？為何？

2.抗體有哪些結(jié)構(gòu)能適應(yīng)抗原的多樣性？你認(rèn)為機(jī)體內(nèi)的所有抗體都是有益嗎？請(qǐng)闡述你的理由。

3.用于免疫治療的抗體一定對(duì)機(jī)體有益嗎？對(duì)機(jī)體可能存在哪些危害？根據(jù)你掌握的知識(shí)，提出一些設(shè)想與思路，降低治療用抗體的副作用？

4.單克隆抗體的研究進(jìn)展與應(yīng)用前景如何？

5.就某一種人工制備的抗體在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用加以闡述。

6.幾種基因工程抗體的本質(zhì)是什么？你認(rèn)為人工制備的抗體有哪些進(jìn)展？

7.幾種基因工程抗體一定比多克隆抗體具有優(yōu)勢(shì)嗎？請(qǐng)比較其優(yōu)劣。

【課后思考】

1.什么是抗體和免疫球蛋白？二者有何關(guān)系？

2.試述Ig的基本結(jié)構(gòu)、功能區(qū)及其功能與水解片段。

3.試述免疫球蛋白分子生物學(xué)活性。

4.五類(lèi)免疫球蛋白的生物學(xué)活性是什么？

5.名詞解釋:多克隆抗體、單克隆抗體。

【課外閱讀】

分泌型免疫球蛋白A的研究進(jìn)展

分泌型免疫球蛋白A（secretoryimmunoglobulinA，SIgA）是20世紀(jì)60年代初在外分泌液中發(fā)現(xiàn)的一種IgA抗體，主要存在于乳汁、胃腸液、呼吸道分泌液等外分泌液中。SIgA分子是由2個(gè)IgA單體（每個(gè)單體含2條輕鏈和2條重鏈）、1條J鏈和1條分泌片（secreto-rycomponent，SC，為多聚免疫球蛋白受體的胞外裂解片段）構(gòu)成的異源十聚體，為了與血清IgA單體相區(qū)別而被命名為SIgA。研究表明，SIgA是外分泌液中存在的一種主要抗體，是呼吸道、消化道、泌尿生殖道等抵御病原體及有害物質(zhì)的第一道免疫防線(xiàn)，是機(jī)體黏膜免疫最重要的抗體。

一、分泌型IgA合成的相關(guān)機(jī)制

二聚體IgA（d IgA）或多聚體IgA（pIgA）從漿細(xì)胞分泌出來(lái)后，在上皮細(xì)胞的嗜堿性側(cè)與多聚免疫球蛋白受體（polyimmunoglobulinreceptor，p IgR）以共價(jià)健形成d IgA-p IgR或p IgA-p IgR復(fù)合物，然后通過(guò)內(nèi)吞作用和轉(zhuǎn)運(yùn)被運(yùn)輸?shù)金つね鈧?cè)，此后完整的SIgA分子通過(guò)p IgR分裂（p IgRC端跨膜部分和胞內(nèi)部分在黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)降解）釋放出來(lái)。SIgA在保護(hù)機(jī)體免受黏膜表面的微生物侵襲方面起著非常重要的作用，其合成與抗原遞呈、淋巴細(xì)胞歸巢遷移（trafficking）及周?chē)h(huán)境中的細(xì)胞因子均有很大關(guān)系。在黏膜免疫誘導(dǎo)部位，抗原加工、遞呈后，形成針對(duì)抗原的IgA型B細(xì)胞。在此過(guò)程中，B細(xì)胞的分化、增殖有賴(lài)T細(xì)胞的幫助。其中多種Th2樣因子參與了誘導(dǎo)部位B細(xì)胞增殖、分化，相關(guān)因子包括TGF-β、IL-4等。前體B細(xì)胞在誘導(dǎo)部位內(nèi)進(jìn)行同種型轉(zhuǎn)換（isotypesw itch），形成膜表面抗體IgA陽(yáng)性的B細(xì)胞，同種型轉(zhuǎn)換是形成IgA型漿細(xì)胞的關(guān)鍵之一。體外研究發(fā)現(xiàn)，在TGF-β作用下，B細(xì)胞基因重排，使Cα基因得以表達(dá)，從而使其轉(zhuǎn)型為IgA型B細(xì)胞。但有研究證實(shí)IL-4的作用遠(yuǎn)高于TGF-β。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，證實(shí)IL-4是調(diào)控B細(xì)胞在PP（潘氏結(jié)）內(nèi)分化的主要因子，IL-4^-/-小鼠失去合成IgA的功能，提示IL-4對(duì)于IgA的合成十分重要。

二、SIgA的結(jié)構(gòu)特征

IgA在分泌物中主要以二聚體形式存在，SIgA是由十肽組成的免疫球蛋白，來(lái)自2個(gè)不同的細(xì)胞系，沉降系數(shù)為11S，它包含2個(gè)單體的IgA、1條J鏈和1個(gè)分泌片，它們通過(guò)共價(jià)結(jié)合就形成所謂的SIgA單體。IgA主要存在于血清中，含量較低，其沉降系數(shù)為7S，相對(duì)分子質(zhì)量約為165×10³，是重鏈為α的免疫球蛋白。IgA分子由2條κ鏈或2條λ鏈和2條α鏈構(gòu)成，α鏈稍大于γ鏈。IgA經(jīng)木瓜蛋白酶水解可以得到3個(gè)大小相當(dāng)?shù)钠?，其中?個(gè)相同的片段因具有抗原特異性結(jié)合能力，而被稱(chēng)為抗原結(jié)合片段（fragmentanti-genbinding，F(xiàn)ab）。另一個(gè)片段是含有Cα2和Cα3的重鏈片段，它能從溶液中結(jié)晶出來(lái)，呈明顯的均一性，故被稱(chēng)為結(jié)晶片段（fragmentcrystallizablc，F(xiàn)c），F(xiàn)c不能結(jié)合抗原，但具有各類(lèi)Ig的抗原決定簇及生物活性，Ig的許多效應(yīng)功能由Fc部分介導(dǎo)。Fab和Fc之間有一個(gè)鉸鏈區(qū)（hingeregion），它的存在可以保證抗體分子的柔性，從而使抗體分子的許多結(jié)合位點(diǎn)在空間上能與抗原相互作用。人類(lèi)的IgA包括IgA1和IgA2共2個(gè)亞型，它們由不同的基因表達(dá)。IgA1和IgA2的最大不同之處在于IgA1的鉸鏈區(qū)比IgA2多13個(gè)氨基酸殘基。IgA2有3種亞型，即IgA2m（1）、IgA2m（2）和IgA2n。

人類(lèi)J鏈?zhǔn)窍鄬?duì)分子質(zhì)量約15×10³的多肽，與其他物種的J鏈高度同源。人J鏈基因有4個(gè)外顯子，外顯子1編碼前導(dǎo)肽，外顯子2～4編碼含有137個(gè)氨基酸殘基的成熟肽，J鏈基因不是Ig基因簇的一部分，它定位于15號(hào)染色體。人類(lèi)J鏈有8個(gè)半胱氨酸殘基，Cys¹⁵和Cys⁶⁹通過(guò)二硫鍵與IgA的α鏈相連，其他6個(gè)半胱氨酸殘基形成鏈內(nèi)二硫鍵（Cys¹³∶Cys¹⁰¹，Cys⁷²∶Cys⁹²，Cys¹⁰⁹∶Cys¹³⁴）。Johansen等發(fā)現(xiàn)，J鏈C端對(duì)于IgA聚合體的形成并非必要，但對(duì)于保持與SC的親和力有著重要的作用；同時(shí)他們也發(fā)現(xiàn)，2個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵（Cys¹³∶Cys¹⁰¹和Cys¹⁰⁹∶Cys¹³⁴）對(duì)于SC的結(jié)合是不可缺少的，但對(duì)于IgA聚合體形成則可有可無(wú)，僅Cys15或Cys69的存在就足夠保持多聚體IgA的穩(wěn)定性。J鏈產(chǎn)生于合成IgA和IgM的漿細(xì)胞中，而且也產(chǎn)生于合成IgG的未成熟漿細(xì)胞，但它并不與IgG分子結(jié)合。用J鏈-/-鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p IgA不能與SC結(jié)合，也不能被表達(dá)SC的上皮細(xì)胞有效轉(zhuǎn)運(yùn)，這說(shuō)明J鏈參與了SC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)。J鏈不僅是SC結(jié)合IgA的重要媒介，而且還在通過(guò)調(diào)節(jié)IgA結(jié)構(gòu)而影響IgA在細(xì)胞內(nèi)裝配中起重要作用。

SC是上皮細(xì)胞上的p IgR的一部分，p IgR為免疫球蛋白超家族成員。p IgR由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，與pIgA特別是dIgA相結(jié)合，成為IgA聚合體的轉(zhuǎn)運(yùn)受體，是SIgA的重要組成部分。人Fc介導(dǎo)了p IgA和p IgR的相互作用，p IgR細(xì)胞外部分包含5個(gè)與免疫球蛋白相似的功能域（D1～D5）。其中D1在與d IgA的Cα3功能域非共價(jià)結(jié)合過(guò)程中起了重要的作用，D5與IgA的Cα2共價(jià)結(jié)合使復(fù)合物分子更加穩(wěn)定。正是SC的存在，使SIgA對(duì)蛋白酶的敏感性下降，黏液更黏稠，增強(qiáng)了黏附作用及防御能力。在SIgA的運(yùn)輸過(guò)程中，p IgR的細(xì)胞外部分與分泌性抗體結(jié)合成為固定SC，即我們經(jīng)常所指的SC，可抵抗蛋白酶的降解，從而起到穩(wěn)定SIgA的作用。有些未與SIgA結(jié)合的p IgR分子也被轉(zhuǎn)運(yùn)到黏膜外側(cè)，并通過(guò)水解與細(xì)胞脫離，形成游離SC，與固定SC相似，亦為相對(duì)分子質(zhì)量為80×10³的蛋白。SC是黏膜免疫系統(tǒng)的重要組分，參與SIgA形成和分泌，在SC^-/-轉(zhuǎn)基因小鼠中，由于SC基因的缺失，不能進(jìn)行p IgA的選擇性上皮運(yùn)輸，導(dǎo)致該小鼠完全沒(méi)有黏膜免疫功能。

三、SIgA的功能

與普通的抗體分子相比，SIgA具有許多優(yōu)良特性。SIgA分子中的J鏈將2個(gè)IgA單體連接起來(lái)，由于每個(gè)IgA單體具有2個(gè)抗原結(jié)合部位，因此每個(gè)SIgA抗體即有4個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)（四價(jià)），從而比普通抗體分子具有更高的親和力。SIgA具有很高的穩(wěn)定性，其在黏膜表面的半衰期為IgG的3倍，其在人體外分泌道中的保護(hù)作用可以持續(xù)4個(gè)月以上。這種高穩(wěn)定性主要是由以下幾種因素所致:一是由于SIgA的鉸鏈區(qū)較之其他抗體分子短，而鉸鏈區(qū)是最容易受到蛋白酶攻擊的部位，鉸鏈區(qū)的縮短有利于抵抗蛋白酶的降解；二是由于SIgA的分泌片高度穩(wěn)定，其多糖側(cè)鏈具有防止蛋白酶降解的作用，分泌片對(duì)抗體分子的包裹使整個(gè)抗體分子變得十分穩(wěn)。此外，分泌片還賦予SIgA特殊的免疫保護(hù)作用:首先，分泌片具有非特異性的病原微生物中和活性；其次，分泌片上的糖基黏附于黏膜上皮，更使SIgA整齊地排列在黏膜表面，形成隔離保護(hù)層，可有效地阻止病毒的入侵。

四、重組SIgA

基因工程抗體藥物是現(xiàn)代免疫學(xué)和生物工程技術(shù)的重要產(chǎn)物，已經(jīng)發(fā)展成為一大類(lèi)市場(chǎng)上熱銷(xiāo)的產(chǎn)品，約占整個(gè)生物類(lèi)藥品的1/3。已經(jīng)上市的抗體藥物主要用于器官移植及腫瘤、免疫性疾病和心血管疾病等，僅有一種抗病毒感染的抗體藥物。但是，處于臨床前研究和臨床研究的抗病毒感染抗體藥物數(shù)量卻很多，抗病毒基因工程抗體已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)。

目前已上市和處于研發(fā)階段的抗體多為IgG類(lèi)型，還沒(méi)有IgA或SIgA抗體產(chǎn)品上市，國(guó)外有一些研究小組在進(jìn)行基因工程SIgA研究，而國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到SIgA基因工程抗體的報(bào)道。天然的SIgA是由2種不同細(xì)胞產(chǎn)生的，IgA單體和J鏈由漿細(xì)胞產(chǎn)生，分泌片則由黏膜上皮細(xì)胞合成。SIgA的相對(duì)分子質(zhì)量比較大，約為400×10³（單體IgA約為165×10³，SC約為80×10³，J鏈約為15×10³），組裝起來(lái)相當(dāng)困難，盡管如此還是有許多SIgA的表達(dá)和組裝系統(tǒng)被建立。Ma等利用轉(zhuǎn)基因煙草表達(dá)了鼠源SIgA抗體的κ鏈、重鏈、J鏈及兔的SC，且在植物中組裝成分泌型抗體。而Johansen等證明，經(jīng)共轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物細(xì)胞（CHO）也能夠組裝完整的SIgA分子。Berdoz等也利用CHO細(xì)胞共轉(zhuǎn)染建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，該細(xì)胞株能高效表達(dá)人鼠嵌合IgA抗體的重鏈和輕鏈、人J鏈和人SC，并能產(chǎn)生高濃度的、具有抗原特異性的人鼠嵌合單體IgA、d IgA和SIgA抗體。Chintalacharuvu等分別在CHO細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞中表達(dá)和組裝了不同形式的IgA分子，并發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)產(chǎn)物在不同形式的IgA組分（單體、二聚體和分泌型）上有所區(qū)別。上述一系列實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，利用抗體工程的手段，在單個(gè)非免疫細(xì)胞中表達(dá)SIgA的4種多肽鏈，并組裝成具有天然結(jié)構(gòu)和功能的SIgA分子是完全可能的。CHO細(xì)胞作為目前最常用的抗體工程的表達(dá)系統(tǒng)，其發(fā)酵和純化工藝成熟，且與其他常用的表達(dá)系統(tǒng)相比與人類(lèi)細(xì)胞最為接近，表達(dá)的抗體在糖基化和構(gòu)象等特性方面與人體內(nèi)的天然抗體最為接近，因此用CHO細(xì)胞作為SIgA表達(dá)的宿主細(xì)胞是一種較好的選擇。

五、結(jié)語(yǔ)

與普通的非分泌型抗體相比，SIgA局部用于呼吸道或消化道，使用方便，使用劑量小，無(wú)須進(jìn)入血液，其純度要求不必過(guò)高，因此非常適合于在特定條件下的緊急生產(chǎn)制備。而重組SIgA作為基因工程抗體產(chǎn)品，對(duì)于進(jìn)一步研究SIgA阻斷細(xì)菌和病毒的黏附機(jī)制有著重要的意義。

（資料來(lái)源:張寶中.分泌型免疫球蛋白A的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通訊，2009，20（2）:263-265）

單克隆抗體研究進(jìn)展

一、臨床治療

◆2006年研制出的α-抗腫瘤壞死因子是一種抗炎單克隆抗體。

一項(xiàng)新的研究試驗(yàn)證實(shí)，接受了α-抗腫瘤壞死因子治療的具有中等哮喘癥狀的患者與服用空白安慰劑的個(gè)體相比，疾病的惡化明顯較輕。倫敦皇家Brompton醫(yī)院心臟和肺臟研究中心的研究人員將這些發(fā)現(xiàn)發(fā)表在10月的American Journal of Repiratory and Criti-cal Care Medicine雜志上。負(fù)責(zé)這項(xiàng)研究的Trevor T.Hansel博士和11名同事將一種叫做inflixmab的單克隆抗體注射給14名患者。這種單抗能夠結(jié)合并中和腫瘤的α壞死因子（TNF-α）。另外，有18名患者在8周的雙盲試驗(yàn)中接受了安慰劑，以作為對(duì)照組。研究人員指出，哮喘的結(jié)構(gòu)性和炎性細(xì)胞都能釋放TNF-α——一種細(xì)胞內(nèi)的信史蛋白質(zhì)，由白細(xì)胞制造。試驗(yàn)結(jié)果表明，抗TN F-α療法對(duì)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、僵直性脊椎炎、克隆氏癥和牛皮癬具有治療效果，但是對(duì)慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者卻無(wú)效。該抗體對(duì)患有伴隨性風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的哮喘患者具有明顯的療效。在18名接受安慰劑處理的患者中，13人病情發(fā)生了惡化，而在14個(gè)接受inflixibmab抗體治療的患者中只有4人發(fā)生惡化。研究人員還指出，在試驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與使用單克隆抗體相關(guān)的副作用。相反，患者對(duì)infliximab治療表現(xiàn)出了良好的耐受性，患者的哮喘惡化發(fā)生率明顯降低。接下來(lái)，研究人員將會(huì)對(duì)嚴(yán)重哮喘患者進(jìn)行這種抗體的更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)。

從臨床試驗(yàn)的適應(yīng)癥來(lái)看，單抗主要用于癌癥治療，如結(jié)腸癌、直腸癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、白血病、前列腺癌和胰腺癌等。還有治療感染性休克和膿毒血癥的單抗，個(gè)別也有治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、Ⅰ型糖尿病和腸炎的單抗。此外，還有臨床試用于預(yù)防器官移植抗排異反應(yīng)、抗血小板凝集和艾滋病的單抗。

美國(guó)臨床試用的單抗藥物劑型種類(lèi)繁多，除單獨(dú)使用單抗外，還有同位素標(biāo)記的單抗、毒素-單抗耦聯(lián)物、藥物-單抗耦聯(lián)物。在體外補(bǔ)體非依賴(lài)性細(xì)胞毒試驗(yàn)、免疫組織化學(xué)試驗(yàn)、CFU-GM集落形成的實(shí)驗(yàn)顯示，單抗-柔紅霉素耦聯(lián)物對(duì)T源性淋巴瘤有較強(qiáng)的親和力，并能特異地殺傷白血病T淋巴細(xì)胞，但不損傷骨髓干細(xì)胞。

◆狂犬病病毒（RV）特異性M cAbs中和作用

M cAbs中和作用的機(jī)制研究和應(yīng)用研究相輔相成。針對(duì)RV糖蛋白特異性M cAbs中和RV的作用機(jī)制研究也在不斷開(kāi)展，但是所獲成果不大。

早在1987年，Bernhard等人就對(duì)識(shí)別糖蛋白的特異性M cAbs中和RV的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，細(xì)胞（BHK-21）實(shí)驗(yàn)證明，具有中和活性的M cAbs與放射性標(biāo)記的RV體外孵育后，可以完全抑制病毒對(duì)細(xì)胞的感染，但是，中和抗體對(duì)于那些已經(jīng)病毒內(nèi)化感染了的細(xì)胞只能部分抑制。一些具有中和活性的M cAbs能夠阻止病毒吸附細(xì)胞后的感染作用，將M cAbs同已經(jīng)包含或吸附有病毒的細(xì)胞在4℃下作用，30%的病毒可以重新釋放出來(lái)，這表明，吸附在細(xì)胞上的病毒，只能部分因?yàn)椴《九cM cAbs的中和作用而被釋放出來(lái)。為了研究吸附病毒細(xì)胞的中和機(jī)制，他們進(jìn)行了溫度變化試驗(yàn)，在37℃用病毒感染細(xì)胞，然后進(jìn)行治療。結(jié)果表明，對(duì)37℃下吸附病毒的細(xì)胞，任何一種M cAb都沒(méi)有效果，M cAbs與病毒都被細(xì)胞的內(nèi)攝作用內(nèi)吞了。但是，各種McAbs中和吸附在細(xì)胞上病毒的能力，與體外孵育抑制病毒的活性在比例上是一致的。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，該研究組推測(cè)，這些McAbs中和RV是通過(guò)抑制內(nèi)核內(nèi)涵體的酸催化溶合作用，從而導(dǎo)致病毒的脫衣殼而實(shí)現(xiàn)的。

1992年，Schumacher等做了深一步的機(jī)制研究，他們使用鼠源M cAbs進(jìn)行雞尾酒療法（cocktail ofmurine anti-rabiesmonoclonal antibodies，M cAb-C）的小鼠治療試驗(yàn)。研究發(fā)現(xiàn):小鼠體內(nèi)具有某種封閉狂犬病疫苗免疫所產(chǎn)生的病毒中和性抗體的能力，使用M cAb-C治療實(shí)驗(yàn)小鼠，可以抑制小鼠體內(nèi)的這種封閉能力。M cAbs介導(dǎo)的抑制作用可能是由于體內(nèi)形成的抗原-抗體復(fù)合物所引起，該復(fù)合物對(duì)于早期B細(xì)胞具有負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)作用。同時(shí)，McAb-C的使用也不影響RV特異性的Th細(xì)胞的誘導(dǎo)作用。

2001年，Hanlon CA等的一項(xiàng)以敘利亞地鼠為研究模型的實(shí)驗(yàn)也表明M cAb具有很好的甚至是優(yōu)于RIG的治療作用。然而，他們又發(fā)現(xiàn):7株可以中和典型RV突變體的人源M cAbs以及R IG都不能中和一種來(lái)自歐洲蝙蝠的RV；更有甚者，杜文黑基病毒（Duven-hage virus）能被RIG中和，而不能被M cAbs中和；同時(shí)，Lagos蝙蝠株以及狂犬相關(guān)病毒能被M cAb中和，而不能被RIG中和。這也說(shuō)明M cAb以及RIG用于防治狂犬病還有許多不確定因素，有待于對(duì)其作用機(jī)制做更深入的研究來(lái)闡明。

◆蛋白質(zhì)分離純化

從發(fā)酵液、血清、組織或細(xì)胞勻漿上清液中分離純化出來(lái)某些具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或酶類(lèi)時(shí)，一般采用鹽析、離子交換層析、凝膠過(guò)濾等方法，但這些方法的選擇性都不理想，很難經(jīng)一兩步處理就能達(dá)到純化的目的，所以既費(fèi)時(shí)費(fèi)力，又不能適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的需要。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)制藥的發(fā)展，單抗免疫親和層析作為高效的分離純化方法已得到廣泛的應(yīng)用。Staehelin等用？-干擾素單抗進(jìn)行免疫親和層析，使大腸桿菌產(chǎn)生的干擾素，經(jīng)進(jìn)一步處理純化達(dá)1000倍。

二、單抗靶向給藥系統(tǒng)

隨著雜交瘤技術(shù)的問(wèn)世，人們已能篩選出特異性較高的單抗。這種抗體不僅有均一的特異性，而且免疫球蛋白的類(lèi)、亞類(lèi)、型也都是均一的，并具有高度的特異性，能從正常組織中識(shí)別腫瘤細(xì)胞。將藥物聯(lián)到單抗上，可提高藥物的療效，降低毒性，是靶向藥物的理想載體。

◆免疫脂質(zhì)體

脂質(zhì)體本身具有靶向作用，但其特異性不強(qiáng)，要使脂質(zhì)體分布到特異性靶器官，就需在脂雙層接上特異性抗體，成為免疫脂質(zhì)體。將抗癌細(xì)胞的單抗接到帶藥脂質(zhì)體上，由于單抗能有效地識(shí)別腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的抗原，具有高度的特異性，使脂質(zhì)體與癌細(xì)胞特異性地結(jié)合，提高脂質(zhì)體的靶向性，使藥物特異性地輸送到癌細(xì)胞，進(jìn)而減少用藥劑量，降低不良反應(yīng)。又由于單抗對(duì)腫瘤細(xì)胞有較好的親和力，使藥物的抗癌活性專(zhuān)一，故能選擇性地殺傷癌細(xì)胞，起到良好的治療作用。

免疫脂質(zhì)體作為藥物載體，既具有載藥量大、在體內(nèi)滯留時(shí)間長(zhǎng)，又具有靶細(xì)胞專(zhuān)一性等優(yōu)點(diǎn)，是最有前途的單抗靶向給藥系統(tǒng)。

◆免疫毫微粒

將單抗通過(guò)共價(jià)交聯(lián)或吸附到毫微粒表面，形成具有免疫活性的毫微粒。免疫毫微粒具有雙重靶向性，即被動(dòng)靶向性和主動(dòng)靶向性。一方面它屬于毫微粒體系，可通過(guò)控制粒子大小，使其選擇性被動(dòng)滯留在特定的臟器；另一方面可通過(guò)改變粒子表面修飾的抗體而作用于具有相關(guān)抗原的靶細(xì)胞。

◆免疫毫微球與免疫微球

微球是藥物分散或被吸附在高分子聚合物基質(zhì)中而形成的微粒分散系統(tǒng)，粒徑較小的微球也稱(chēng)毫微球。微球具有靶向性、緩釋性和避免抗藥性。免疫微球的應(yīng)用很廣，除了可用作抗癌藥的靶向治療外，還可以用于標(biāo)記和分離細(xì)胞、疾病的診斷和治療等。

◆免疫磁性載體

磁性藥物制劑是將藥物和鐵磁性物質(zhì)共包于或共分散于載體中，應(yīng)用于人體后，利用體外磁場(chǎng)的效應(yīng)使藥物在體內(nèi)定向移動(dòng)和定位集中的靶向給藥制劑。免疫磁性微球是將單抗偶聯(lián)在磁性微球的表面，使其靶向性和專(zhuān)一性更強(qiáng)，從而達(dá)到高效、速效、低毒的新型藥物制劑。

由于單抗靶向給藥系統(tǒng)具有高度特異性和強(qiáng)大的殺傷力等優(yōu)點(diǎn)，給廣大腫瘤患者帶來(lái)了福音，也預(yù)示了癌癥化療的一個(gè)新途徑。但要將單抗靶向給藥制劑作為臨床上治療腫瘤的常規(guī)制劑，目前還有許多亟待解決的問(wèn)題，如提高單抗的特異性，減少與正常細(xì)胞的交叉反應(yīng)；防止鼠源性單抗引起的抗鼠抗體反應(yīng)；使用人源單抗、人鼠雜交抗體或去除Fc段的單抗；防止結(jié)合的藥物在到達(dá)腫瘤細(xì)胞前即已釋放，或受網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而將藥物釋放，引起全身性毒性；增加到達(dá)靶部位的藥物量等。

（資料來(lái)源:吳永強(qiáng).人源化單克隆抗體研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2008，36（2）:73-76）

能與2種不同抗原結(jié)合的抗體

美國(guó)科學(xué)家近日通過(guò)研究，打破了一個(gè)古老的免疫學(xué)教條——一個(gè)抗體只能結(jié)合到一個(gè)抗原上。他們成功地使一個(gè)抗體緊密地結(jié)合到兩個(gè)不同的抗原上。相關(guān)論文發(fā)表在2009年3月20日的《科學(xué)》雜志上。

這一抗體作用于2種蛋白——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和人類(lèi)表皮生長(zhǎng)因子受體2（H ER2），前者被認(rèn)為會(huì)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，而后者則在一些侵略性的乳腺腫瘤里高表達(dá)。

科學(xué)家以前經(jīng)常發(fā)現(xiàn)一些抗體能夠松散地結(jié)合到多個(gè)抗原上，但一直沒(méi)有發(fā)現(xiàn)或通過(guò)操作實(shí)現(xiàn)單個(gè)抗體特異性地緊密結(jié)合到2個(gè)不同抗原上。

在此次研究中，美國(guó)加州基因技術(shù)公司（Genentech）的Germaine Fuh和同事突變了HER2的抗體，然后在突變體中篩選出了能夠同時(shí)結(jié)合HER2和VEGF的變異。這是首次創(chuàng)造出能結(jié)合到2種無(wú)關(guān)聯(lián)蛋白的抗體。Fuh說(shuō):“這將開(kāi)啟雙重標(biāo)靶型療法之門(mén)?！?/p>

重點(diǎn)研發(fā)抗體療法的Genmab生物技術(shù)公司副總裁Paul Parren表示，結(jié)果令人吃驚。他說(shuō):“我們以前根本沒(méi)有這樣考慮過(guò)抗體，它讓人不禁要猜測(cè)，這種分子是否也有可能在自然界中存在。”

（資料來(lái)源:Science 20 March 2009:DO I:10.1126/science.1165480）

美研究發(fā)現(xiàn)抗多種流感病毒人單克隆抗體

美國(guó)研究人員2009年2月22日發(fā)表報(bào)告說(shuō)，他們發(fā)現(xiàn)了能中和多種流感病毒毒株的人單克隆抗體。這些抗體由單個(gè)B淋巴細(xì)胞分泌合成，可中和的流感病毒包括H5N1型高致病性禽流感病毒和季節(jié)性流感病毒，將來(lái)在此研究基礎(chǔ)上有望開(kāi)發(fā)出高效流感疫苗。

研究人員介紹說(shuō)，組成流感病毒的血凝素蛋白共有16種亞型，他們發(fā)現(xiàn)的人單克隆抗體能中和其中9種，除了目前已知的4種禽流感病毒和季節(jié)性流感病毒，還包括造成1918年西班牙大流感的H1N1型流感病毒。

美國(guó)國(guó)家過(guò)敏和傳染病研究所所長(zhǎng)安東尼·福奇指出，這項(xiàng)研究意義重大，它表明在流感暴發(fā)而疫苗尚未生產(chǎn)出來(lái)之前，人單克隆抗體將是重要的抗病毒補(bǔ)充藥物。

該研究報(bào)告的第一通訊作者、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院旅美中國(guó)學(xué)者隋建華博士對(duì)記者說(shuō)，人類(lèi)患流感或接種流感疫苗后通常會(huì)產(chǎn)生抗體，但是這些抗體通常僅能中和以前接觸過(guò)的相同病毒毒株。新發(fā)現(xiàn)的人單克隆抗體則具有廣泛的中和活性，并且可在較短的時(shí)間內(nèi)大量制備。這些抗體可與抗病毒藥物聯(lián)合使用以阻止病毒的傳播，預(yù)防流感。

據(jù)研究人員22日發(fā)表在英國(guó)《自然—結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)》（Nature Structural& Molec-ular Biology）雜志網(wǎng)絡(luò)版的報(bào)告介紹，流感病毒有一個(gè)隱蔽且序列和結(jié)構(gòu)保守的區(qū)域，該區(qū)域位于流感病毒的主要膜蛋白——血凝素蛋白的頸干部位，人體很少產(chǎn)生針對(duì)這一區(qū)域的抗體。而他們通過(guò)體外方法分離的人單克隆抗體能有效地與這一區(qū)域結(jié)合，阻止流感病毒變異，使其喪失感染人體細(xì)胞的能力。

領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)研究的達(dá)納—法伯癌癥研究所副教授韋恩·馬拉斯克說(shuō)，這些單克隆抗體是人源抗體，目前已可用來(lái)實(shí)施更進(jìn)一步的臨床前及臨床研究。他認(rèn)為，這些人單克隆抗體可在流感季節(jié)用來(lái)治療免疫能力低、高齡個(gè)體和醫(yī)療工作者等高危人群。

研究人員下一步的計(jì)劃是，針對(duì)流感病毒所在的區(qū)域開(kāi)發(fā)疫苗，這樣的疫苗有望使人體獲得長(zhǎng)期的抗流感病毒能力。

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有25萬(wàn)至50萬(wàn)人死于季節(jié)性流感。歷史上曾發(fā)生多次流感大流行，1918年發(fā)生的西班牙大流感曾導(dǎo)致上千萬(wàn)人死亡。

影響B(tài)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白

美國(guó)研究人員最近鑒別出一種在B淋巴細(xì)胞分裂、增殖過(guò)程中所必需的關(guān)鍵蛋白?？茖W(xué)家說(shuō)，這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)將能幫助開(kāi)發(fā)針對(duì)多發(fā)性骨髓瘤等疾病的新療法。

大量、快速生成B淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞是構(gòu)建免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵。但如果B淋巴細(xì)胞的分裂、增殖得不到控制，就可能引發(fā)多發(fā)性骨髓瘤等疾??；如果B淋巴細(xì)胞攻擊目標(biāo)錯(cuò)誤，就可能引發(fā)自體免疫性疾病。

美國(guó)加州大學(xué)圣迭戈分校醫(yī)學(xué)院的研究人員8日在《自然·免疫學(xué)》雜志網(wǎng)絡(luò)版上說(shuō)，他們發(fā)現(xiàn)一種名為CD98hc的蛋白可影響B(tài)淋巴細(xì)胞分裂、增殖，這種蛋白在幾乎所有脊椎動(dòng)物身體中都存在，但科學(xué)家一直不清楚它在免疫過(guò)程中的作用。

論文第一作者約瑟夫·坎托說(shuō)，過(guò)去人們?cè)陟o息淋巴細(xì)胞過(guò)程中發(fā)現(xiàn)這種蛋白的含量較低，因此用它做活化標(biāo)記物。但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，當(dāng)B淋巴細(xì)胞受抗原刺激，比如在阻止細(xì)菌入侵機(jī)體時(shí)，CD98hc蛋白的含量會(huì)激增。

進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏這種蛋白的小鼠對(duì)病原體不會(huì)產(chǎn)生正常的抗體反應(yīng)。

坎托說(shuō)，當(dāng)缺乏CD98hc蛋白時(shí)，B淋巴細(xì)胞就不能快速分裂。這表明，CD98hc蛋白在大量增加B淋巴細(xì)胞、促發(fā)免疫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮著不可缺少的作用。

研究人員推測(cè)，人們將來(lái)也許可以通過(guò)抑制CD98hc蛋白，阻止B淋巴細(xì)胞異常增殖或阻止B淋巴細(xì)胞發(fā)生錯(cuò)誤攻擊，進(jìn)而阻止多發(fā)性骨髓瘤等疾病的發(fā)生。

（資料來(lái)源:Nature Immunology 8 March 2009｜doi:10.1038/ni.1712）