滅活疫苗（細胞源，－株_十年護牧：保山市動物疫病預(yù)防控制中心成立十周年論文成果集

濮永華1，龔興建1，釧有科1，黃 杰2，周開艷1，李玉靜2，楊 芳1，段 寧1

（1.保山市動物疫病預(yù)防控制中心，云南保山678000；2.施甸縣動物疫病預(yù)防控制中心，保山施甸678200）

摘 要：為驗證重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）對家禽的安全性和免疫效果，通過注射3個雞群7580只，注射疫苗后連續(xù)2周觀察雞只的精神狀態(tài)、采食量、糞便及雞群死亡率，均未發(fā)生異常情況，與注射之前無明顯差異。對其中2群35日齡鳳翔麻雞疫苗注射前后采血，按照 《高致病性禽流感免疫技術(shù)規(guī)范》（NYT769－2004）血凝抑制 （HI）試驗操作進行HI抗體效價測定。測定結(jié)果：兩群試驗雞在疫苗免疫前抗體合格率為0，第1群疫苗免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天，平均抗體滴度分別為1.63log2、3.78log2、5.21log2、5.39log2、5.13log2、4.5log2，免疫抗體合格率分別為18.64％、51.02％、84.21％、91.07％、88.68％、75.00％；第2群疫苗免疫后15天、30天、45天、60天、75天，平均抗體滴度分別為2.52log2、7.74log2、7.31log2、7.15log2、6.6log2，免疫抗體合格率分別為24％、100.0％、97.92％、100.0％、95.38％。結(jié)果顯示：在田間試驗條件下，重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）安全性高、副反應(yīng)小，免疫效果較好。試驗結(jié)果為推廣應(yīng)用最新技術(shù)生產(chǎn)的高致病性禽流感疫苗提供了參考。

關(guān)鍵詞：禽流感；Re－6株；細胞源滅活疫苗；田間試驗；免疫效果觀察

在家禽業(yè)生產(chǎn)中，目前應(yīng)用的禽流感疫苗主要是雞胚源滅活疫苗，這類疫苗存在批間抗原差異大、同源疫病病原污染危險性和免疫應(yīng)急大等缺點。專家認為，當前理想禽流感疫苗的要求之一是尋找新方法來代替蛋內(nèi)制備禽流感疫苗的方法［1］。據(jù)相關(guān)資料介紹，利用國際最先進的細胞懸浮培養(yǎng)技術(shù)，生產(chǎn)的重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗（細胞源，Re－6株），克服了雞胚源疫苗的缺點，是我國禽流感疫苗生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。為了驗證重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）對家禽的安全性和免疫效果，于2013年6～10月在施甸縣仁和鎮(zhèn)進行了免疫試驗，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 疫 苗

試驗用疫苗為重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株），由某動物疫苗有限公司提供，批準文號：獸藥生字 （2013）153122206，批號：20130401，生產(chǎn)日期：2013年4月15日，有效期至：2014年4月14日。

1.1.2 血凝抑制 （HI）試驗用抗原

禽流感 （H5N1）HI抗原，血凝效價≥7log2，批號：2013002，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.3 血凝抑制 （HI）試驗用陰性血清

SPF雞感染禽流感H5亞型高免血清，HI≥7log2，批號：2013001，哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)。

1.1.4 試驗動物

用于試驗觀察疫苗免疫安全性的蛋雞群為施甸縣由旺鎮(zhèn)周正蛋雞專業(yè)合作社60日齡蛋用雛雞6000只，雞群健康、生長良好；用于試驗觀察疫苗免疫安全性和免疫效果測定的兩個雞群為施甸縣仁和鎮(zhèn)賈愛萍育雛戶的35日齡鳳翔麻雞，第1群780只、第2群800只，雞群健康、生長良好，均為禽流感非免疫雞群。

1.1.5 主要儀器

一次性96孔V型微量反應(yīng)板、微量移液器 （配有滴頭）、低速離心機、德國海道夫搖床等。

1.1.6 主要試劑

0.01摩爾／升的PBS液 （p H7.2）、阿氏液 （血球保護液）、1％紅細胞懸液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方 法

1.2.1 疫苗接種

將試驗用疫苗恢復(fù)到常溫后，雞頸部皮下注射，每只0.5毫升，免疫1次。

1.2.2 采 血

第1群疫苗免疫之前當天及免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天各采血1次；第2群疫苗免疫之前當天及免疫后15天、30天、45天、60天、75天各采血1次。翅下靜脈采血，1～2毫升／只，分離血清，冷藏或冷凍備用。

1.2.3 HI抗體效價測定

按照《高致病性禽流感免疫技術(shù)規(guī)范》（NYT769－2004）［2］血凝抑制（HI）試驗操作進行，HI效價≥4log2判定為陽性，HI效價＜4log2判定為陰性，以陽性數(shù)占檢測數(shù)的比例計算抗體合格率。

2 試驗結(jié)果

2.1 安全性試驗結(jié)果

經(jīng)注射疫苗后，連續(xù)觀察2周，雞只的精神狀態(tài)、采食量、糞便，以及雞群的死亡率，按照說明注射劑量注射的3個雞群均無異常情況發(fā)生，疫苗對肉用和蛋用雛雞群免疫都是安全的，而且疫苗引起的副反應(yīng)較小。

2.2 母源抗體測定結(jié)果

經(jīng)對施甸縣仁和鎮(zhèn)賈愛萍育雛戶日齡為35天的2群鳳翔麻雞采血進行抗體檢測，結(jié)果禽流感抗體合格率均為0，表明兩雞群為禽流感非免疫雞群，而且已無母源抗體。

2.3 免疫效果測定結(jié)果

免疫效果測定結(jié)果詳見表1和圖1、圖2。

表1顯示：通過對2群35日齡鳳翔麻雞疫苗注射前后采血進行抗體測定，結(jié)果表明：疫苗免疫前禽流感抗體合格率為0，第1群疫苗免疫后15天、21天、30天、45天、60天、75天，免疫抗體合格率分別為18.64％、51.02％、84.21％、91.07％、88.68％、75.00％，平均抗體滴度分別為1.63log2、3.78log2、5.21log2、5.39log2、5.13log2、4.5 log2；第2群疫苗免疫后15天、30天、45天、60天、75天，免疫抗體合格率分別為24％、100.0％、97.92％、100.0％、95.38％，平均抗體滴度分別為2.52log2、7.74log2、7.31log2、7.15log2、6.6log2。

表1 重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）免疫試驗結(jié)果統(tǒng)計表

圖1 疫苗注射后平均抗體滴度上升曲線

圖1顯示：兩期試驗疫苗免疫后抗體滴度曲線一致，免疫后15天產(chǎn)生抗體，分別為1.63log2、2.53log2，免疫后30天抗體滴度分別為5.21log2、7.74log2，監(jiān)測到免疫后75天，抗體滴度仍分別為4.50log2、6.60log2。說明疫苗免疫后抗體滴度上升快，維持時間長，在土雜肉雞養(yǎng)殖中，35日齡時使用該疫苗免疫，一次即可。

圖2 疫苗注射后免疫抗體合格率上升曲線

圖2顯示：兩期試驗疫苗免疫后抗體合格率曲線一致，免疫后30天抗體合格率分別為84.21％、100％，平均為92.1％，監(jiān)測到免疫后75天，抗體合格率仍分別為75％、95.38％，平均為85.19％，從免疫30天起至75天，兩期試驗的抗體合格率均超過農(nóng)業(yè)部重大動物疫病強制免疫抗體合格率應(yīng)保持在70％以上的要求。

3 小結(jié)與討論

3.1 安全性

本次免疫試驗的3個雞群共7580只，均未出現(xiàn)免疫副反應(yīng)，說明重組禽流感病毒（H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）安全性高、副反應(yīng)小，在基層推廣具有可行性。

3.2 免疫效果

對2群35日齡禽流感H5亞型抗體為陰性雞群免疫后進行抗體檢測，結(jié)果顯示：疫苗免疫后15天可檢測出抗體，抗體合格率分別為18.64％、24％，平均25.32％，30天抗體合格率分別為84.21％、100％，平均92.1％，45天抗體合格率分別為91.07％、97.92％，平均94.5％，監(jiān)測到免疫后75天，抗體合格率分別為75.00％、95.83％，平均仍然達85.42％?？贵w合格率在免疫后30天遠超過農(nóng)業(yè)部重大動物疫病強制免疫抗體合格率應(yīng)保持在70％以上的要求。從評價抗體滴度分析，疫苗免疫后15天兩群平均2.07log2，30天兩群平均6.48log2，達到最高，并已遠超過判斷陽性率HI效價 （4.0 log2），免疫45天兩群平均抗體滴度為6.35log2，監(jiān)測到免疫后75天，兩群平均抗體滴度仍為5.55log2。上述結(jié)果與農(nóng)業(yè)部1857號公告［3］：“接種后14日產(chǎn)生免疫力，雞免疫期為6個月”的規(guī)定基本一致，在田間試驗條件下、試驗雞為非SPF的情況下，免疫抗體合格率、平均抗體滴度均顯示出該疫苗具有較好的免疫效果。

3.3 綜合評價

根據(jù)本次免疫試驗結(jié)果及分析，重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源， Re－6株）安全性高、副反應(yīng)小，免疫效果較好。

3.4 分析討論

本次試驗與同類試驗免疫后21天抗體滴度達4.0log2、抗體合格率達70％的要求相比較，第1期試驗免疫后21天抗體滴度3.78log2、抗體合格率50.02％，有一定差距；第2期免疫后21天沒有測定。本次試驗受條件限制，僅用一批疫苗兩期試驗雞進行免疫效果測定，要更全面、更準確驗證顯示該疫苗的免疫效果，還需進行兩批以上疫苗和試驗雞重復(fù)試驗，并與傳統(tǒng)雞胚源滅活疫苗進行比較試驗，將有待以后的試驗得出更全面、更切合實際的結(jié)論。

參考文獻

［1］沈志強，王金良，管宇，等.禽流感疫苗的研究進展與挑戰(zhàn)及展望 ［A］.第三屆中國水禽發(fā)展大會會刊 ［C］.2011：189.

［2］高致病性禽流感免疫技術(shù)規(guī)范 ［S］，中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NYT769－2004.

［3］重組禽流感病毒 （H5N1亞型）滅活疫苗 （細胞源，Re－6株）質(zhì)量標準 ［S］，中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第1857號公告，2012年11月.

［本文發(fā)表于 《中國家禽》（中文核心期刊）2014.14期］