第一節(jié)　限制性內(nèi)切核酸酶

在DNA重組及核酸雜交等技術(shù)中，分子生物學(xué)家需利用一些基本的工具酶對DNA和RNA進行操作。例如:對目的基因進行操作時，需限制酶在準確的位置切割，使較大的DNA分子成為一定大小的片段;構(gòu)建重組DNA分子時，必須在DNA連接酶的催化下，才能使DNA片段與載體共價連接。此外還有一些DNA修飾酶和RNA修飾酶也是進行DNA和RNA操作時所必不可少的，比如DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA聚合酶、RNA連接酶、末端轉(zhuǎn)移酶、核酸酶及磷酸酶等。本章重點介紹這些酶類的性質(zhì)及其基本原理和實驗方案。

本章共分五部分。第一部分介紹限制性內(nèi)切核酸酶的功能與特性，酶切的基本方法及影響酶切效率的因素。對每種商品酶的識別序列、反應(yīng)條件及熱滅活條件也進行了較為詳細的介紹。

第二部分介紹限制性作圖的3種方法。一種是用多種限制酶消化DNA，通過凝膠電泳分析不同的酶切片段，從而推導(dǎo)出完整的DNA圖譜。另一種是部分消化法，即首先以某個酶對DNA進行完全消化，再進行部分消化，部分消化的DNA大片段必定等于完全消化中相應(yīng)部分的兩個以上小片段之和，再根據(jù)兩類消化中片段大小的關(guān)系和交錯重疊現(xiàn)象，找出各片段的鄰近位置，排出它們的順序。第三種為末端標記法，對在特定區(qū)段頻繁出現(xiàn)的限制性位點或小片段進行限制作圖。

第三部分討論除限制酶外其他用于DNA和RNA操作的酶類的性質(zhì)、主要用途、實驗方案及反應(yīng)條件等。這些酶包括:DNA聚合酶，用來催化以雙鏈DNA或帶引物的單鏈DNA為模板的合成反應(yīng);連接酶，用來連接雙鏈DNA片段或單鏈RNA片段;RNA聚合酶，用來催化以雙鏈DNA為模板的RNA合成;磷酸酯酶，用以除去核酸5'端的磷基;激酶，用以磷酸化5'端的羥基。

第四部分是構(gòu)建重組DNA分子的一般技術(shù)。由于這些技術(shù)含有大量的專業(yè)技巧，這里僅介紹克隆實驗的最佳方案及其基本原理。并對某些特例作了較為詳細的討論，如平端或黏性末端片段的亞克隆、定向克隆、非匹配末端的連接及寡核苷酸接頭的連接、PCR技術(shù)在DNA重組中的應(yīng)用等。

第五部分討論非放射性探針的標記和檢測方法。生物素和地高辛標記的探針正廣泛用于各種雜交反應(yīng)中，使用這些探針具有相當?shù)姆€(wěn)定性和敏感性，可用比色法或化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測。更重要的是可以免除放射性對人體的損害，因而受到廣大科技工作者的歡迎，有取代放射性標記探針之勢。

一、限制性內(nèi)切核酸酶的特性

限制性內(nèi)切核酸酶的特性主要有以下幾點。

(1)各種限制性內(nèi)切核酸酶具有專一的識別與切割序列(見表1-4)。

(2)識別堿基對數(shù)目一般為4bp、5bp、6bp長度范圍。但亦有識別序列為8bp或8bp以上者，如NstⅠ和SfiⅠ的識別序列為8bp，可將基因組DNA切割為較大DNA片段，對制作真核基因組物理圖譜極為有用。

(3)識別序列大多為二重對稱(即回文結(jié)構(gòu))。

(4)多數(shù)限制性內(nèi)切核酸酶的切割位點就在識別位點內(nèi)，但少數(shù)限制酶的切割位點不在識別位點之內(nèi)，而是在識別位點的旁側(cè)。例如:HgaⅠ的識別位點是GACGC(5/10)，切割位點在兩條DNA鏈上分別在距識別位點5個和10個核苷酸處。

5'－GACGCNNNNN↓NNNNNN－3'

3'－CTGCGNNNNNNNNNN↑N－5'

表1-4　　　　商品化限制酶的識別序列與反應(yīng)條件

續(xù)表

(5)限制性內(nèi)切核酸酶對底物的切割有兩種方式。有些限制性內(nèi)切核酸酶在二重對稱軸處同時切割DNA的兩條鏈，產(chǎn)生帶平端的DNA片段，如PuvⅡ酶切后的DNA為平瑞，而大多數(shù)酶則在對稱軸處的兩側(cè)類似的位置切割產(chǎn)生單鏈的突出DNA黏性末端。如EcoRⅠ切DNA后產(chǎn)生5'-P端的突出黏性末端，而PstⅠ則產(chǎn)生3'-OH端的突出黏性末端。

(6)有些限制性內(nèi)切核酸酶雖然來源及識別位點不同，但切割DNA后產(chǎn)生相同匹配的黏性末端，這些酶稱為同裂酶。如BamHⅠ識別位點為5'－G↓GATCC－3'，與其相匹配的黏性末端的酶就有BclⅠ、BglⅡ、MobⅠ、XboⅠ。

(7)限制性內(nèi)切核酸酶一般都以Mg²⁺為惟一的輔助因子，并要求有一定的鹽離子濃度。

(8)限制性內(nèi)切核酸酶極易失活，要特別注意酶活力的保存，酶保存緩沖液一般為: 10mmol/L Tris-HCl(pH7.4，緩沖pH)、50～100mmol/L NaCl或KCl(鹽離子)、1mmol/L DTT(還原性保持酶活性)、100～200μg/mL BSA(保持蛋白濃度，使酶穩(wěn)定)、50%甘油(存于－20℃不結(jié)冰，結(jié)冰反復(fù)解凍使酶失活)。

二、限制性內(nèi)切核酸酶消化DNA的方法

單酶對DNA樣品的消化只需要酶和DNA樣品放在合適的反應(yīng)緩沖液中溫育，其中DNA和酶的量、緩沖液的離子強度、溫育溫度和時間都依具體的反應(yīng)而改變。反應(yīng)系統(tǒng)如下:

DNA樣品　　　　　　 1μL

10×緩沖液　　　　　1μL

限制性內(nèi)切核酸酶　　1μL

ddH₂O　　　　　　　 7μL

三、影響酶切效率的主要因素

影響酶切反應(yīng)的因素有很多，主要有DNA的純度、DNA甲基化程度、緩沖液系統(tǒng)和溫度等。

1.DNA純度

限制酶酶解反應(yīng)的效率很大程度上取決于DNA的純度。DNA制品中的污染(如蛋白質(zhì)、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、高鹽濃度)均能抑制酶解活性。小量快速提取制備的DNA樣品往往存在這種情況。這種抑制可通過增加酶的量(10～20U/μg DNA)，增大反應(yīng)體積以稀釋可能的抑制物或延長反應(yīng)時間來加以克服。有些DNA樣品被DNase污染，因DNase的活性依賴Mg²⁺，所以這樣的DNA樣品在儲存的緩沖液(含EDTA)中是穩(wěn)定的。但一旦加緩沖液，它們迅速被DNase降解，因此污染了DNase的DNA樣品必須重新純化才能使用。

消化基因組DNA時，加入終濃度為1～2.5mmol/L的多聚陽離子亞精胺可改善酶切效果，其作用是結(jié)合帶負電的污染物。消化超螺旋或病毒DNA較線狀DNA需要更大量的酶(20倍以上)。

2.DNA甲基化程度

大腸桿菌的絕大多數(shù)菌株含有兩種甲基化酶:dam甲基化酶和dcm甲基化酶。dam甲基化酶可在5'-GATC-3'序列中的腺嘌呤N⁶位置上引入甲基。一些限制性內(nèi)切核酸酶(PvuⅡ、Bam HⅡⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、Sau 3AⅠ)的識別位點內(nèi)含有5'－GATC－3'序列。另一些限制性內(nèi)切核酸酶的識別位點也有一部分含有5'-GATC-3'序列，如ClaⅠ(1/4，4個識別序列位點中有1個含5'－GATC－3')、XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅡ(1/16)和HpbⅠ(1/16)。

原核DNA被MboⅡ消化時受dam甲基化酶的抑制，這在實際應(yīng)用中并無大礙。因為Sau3AⅠ的識別序列與MboⅡ的完全相同，但其作用不受dam甲基化酶的影響(注:哺乳動物DNA不會在腺嘌呤的N⁶位置上發(fā)生甲基化，因此，MboⅡ和Sau 3AⅠ均能有效地使用)。但是，當需要在ClaⅠ、XbaⅠ、TaqⅠ、MboⅡ及HpaⅠ的每一個位點處切割原核DNA或用BcⅡ酶完全消化原核DNA時，必須從dam－的大腸桿菌提取DNA。

dcm甲基化酶能在序列5'－CCAGG－3'或5'－CCTGG－3'中的胞嘧啶C⁵位置上引入甲基。受dcm甲基化酶影響的酶是EcoRⅡ。大多數(shù)情況下，用BstNⅠ可避免這一影響。BstNⅠ識別序列與EcoRⅡ相同(盡管它在識別序列內(nèi)的另一位置切割DNA)，如果不能用BstNⅠ代替EcoRⅡ，那么DNA必須從大腸桿菌dcm－菌株中制備。其他某些酶識別序列可能與經(jīng)過修飾的dcm甲基化酶識別序列部分重疊。

哺乳動物DNA偶爾含5－甲基化嘧啶，通常在鳥嘌呤殘基的5'側(cè)。DNA甲基化的程度與細胞類型有關(guān)。真核DNA甲基化方式可用甲基化敏感性不同的同裂酶進行研究。例如，MspⅠ和HpaⅡ的酶切位點都是C↓CGG，當CCGG序列內(nèi)部的胞嘧啶甲基化時，MspⅠ可切割而HpaⅡ則不能切割，原因是HpaⅡ?qū)@種甲基化非常敏感。有時，限制酶對甲基化的核苷酸序列失去切割能力是一種好事。甲基化酶的識別序列與相伴的限制酶的識別序列接近，當用合成的接頭修飾DNA片段的末端時，先將DNA片段甲基化，保護其內(nèi)部的限制酶切位點，再用限制酶切割接頭。

3.緩沖液條件

典型的限制酶緩沖液成分包括:MgCl₂、NaCl/KC1、Tris-HCl、2-巰基乙醇(2-ME)或二硫蘇糖醇(DTT)和牛血清白蛋白(BSA)。二價陽離子(一般為Mg²⁺)對于酶切是必需的;Tris-HCl對維持適當?shù)膒H值是需要的;巰基試劑可穩(wěn)定限制酶，但也可穩(wěn)定潛在的污染物。有些酶類對Na⁺和K⁺濃度敏感，而有些酶在較高的離子強度范圍內(nèi)仍然有活性。

每種限制酶均有其最佳緩沖液，許多酶在幾種緩沖液中均能保留大部分活性。許多廠商為每種限制酶推薦4種緩沖液，這些緩沖液在購買酶時由廠商提供，也可單獨購買或者實驗室自配制10×酶切緩沖液，于－20℃儲存可達一年以上。

各廠商推薦的緩沖體系不完全相同。我們建議購買哪家公司的酶就使用該公司與此配套的緩沖液。

除上述4種緩沖體系外，許多實驗室用谷氨酸鉀緩沖液或乙酸鉀緩沖液消化DNA。這些緩沖液的主要特點是用谷氨酸鉀或乙酸鉀替代NaCl，用Tris-乙酸取代Tris-HCl。雖然有些酶在這些緩沖液中活性較低(有時僅20%)，但多數(shù)限制酶在這些緩沖液中具有活性。幾種DNA修飾酶在這些緩沖液中也具有活性，如T₄DNA聚合酶和T₄DNA連接酶。上述“通用”緩沖液在多種限制酶消化DNA時是有用的，尤其是當幾種限制酶在任何一個標準緩沖液中都不相匹配時，通用緩沖液特別有用。

在非適當反應(yīng)條件下，如鹽離子強度低、高濃度酶、高甘油濃度、高pH值或用Mn²⁺替換Mg²⁺時，有些限制酶特異性降低，通常在識別序列之外發(fā)生切割反應(yīng)。