血清總膽固醇濃度測(cè)定_生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)

實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目六　血清總膽固醇濃度測(cè)定

學(xué)習(xí)目標(biāo)

【知識(shí)目標(biāo)】

（1）能夠迅速而準(zhǔn)確地陳述血清總膽固醇濃度檢測(cè)操作要點(diǎn)。

（2）能用自己的語言描述硫磷鐵化學(xué)顯色法及膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度的原理。

【能力目標(biāo)】

（1）能在規(guī)定時(shí)間內(nèi)正確完成血清總膽固醇濃度檢測(cè)的各項(xiàng)操作內(nèi)容，做到步驟正確、動(dòng)作連貫協(xié)調(diào)、內(nèi)容全面無遺漏。

（2）能夠鑒別血清總膽固醇濃度結(jié)果，并能舉例說明其臨床意義。

（3）能夠理解利用手工比色分析與自動(dòng)比色分析的異同。

案例引導(dǎo)

患者，女，25歲，在體格檢查中檢測(cè)到血清總膽固醇濃度為9.0mmol/L，甘油三酯濃度為1.79mmol/L，血樣透明，兩手有腱黃瘤，血壓為16.0/9.3kPa。其父40歲時(shí)因缺血性心臟病做過冠狀動(dòng)脈分流術(shù)，其哥哥現(xiàn)30歲，總膽固醇濃度為13.0mmol/L。請(qǐng)說出其可能患有何種病，并說明原因。

（提示：家族性高膽固醇血癥）

膽固醇是人體的主要固醇，是非飽和固醇，基本結(jié)構(gòu)為環(huán)戊烷多氫菲的衍生物，主要在體內(nèi)合成，另有一部分直接從食物中攝取。它不僅是血漿脂蛋白的組成成分，而且也是細(xì)胞的必要結(jié)構(gòu)成分，另外還可以轉(zhuǎn)化成膽汁酸鹽、某些類固醇激素（如性激素、腎上腺皮質(zhì)激素等）和維生素D等。血液中的膽固醇僅有不到20%是從食物中攝取的，其余均由機(jī)體自身合成，肝、腸、腎、骨髓及內(nèi)分泌腺等均是合成場(chǎng)所。由于血液與組織內(nèi)的膽固醇經(jīng)常不斷地交換，因此血清膽固醇水平基本能夠反映膽固醇的攝取、合成及轉(zhuǎn)運(yùn)情況。膽固醇在體內(nèi)以游離膽固醇及膽固醇酯兩種形式存在，統(tǒng)稱為總膽固醇，其中膽固醇酯占70%～75%。血清膽固醇測(cè)定是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病防治、臨床診斷和營養(yǎng)研究的重要指標(biāo)，據(jù)國外報(bào)道體內(nèi)膽固醇長(zhǎng)期偏低，是誘發(fā)癌癥的因素之一。因此，血清總膽固醇的測(cè)定是臨床最普遍檢測(cè)項(xiàng)目之一。

血清總膽固醇的測(cè)定方法目前已超過200種，可分為化學(xué)比色法、酶分析法、熒光法、氣相色譜法和高效液相色譜法等五大類。由于氣相色譜法和高效液相色譜法條件高，臨床實(shí)驗(yàn)室最常用的是化學(xué)比色法和酶分析法。

一、硫磷鐵化學(xué)顯色法

【實(shí)驗(yàn)原理】

化學(xué)比色法一般包括抽提、皂化、純化、顯色、比色五個(gè)階段?；瘜W(xué)比色法測(cè)定總膽固醇的比色原理主要分以下三類。①膽固醇與醋酐－硫酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生藍(lán)綠色產(chǎn)物。膽固醇酯和膽固醇在與醋酐－硫酸反應(yīng)后，呈色深淺不同，因此用這種方法測(cè)定結(jié)果偏高。②膽固醇與高鐵－硫酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色產(chǎn)物。高鐵－硫酸比色法靈敏度高，顯色穩(wěn)定，測(cè)定精密度好，是臨床上檢驗(yàn)?zāi)懝檀纪扑]的方法，但干擾因素多。③膽固醇與鄰苯二甲醛－硫酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生穩(wěn)定的紫紅色產(chǎn)物。鄰苯二甲醛－硫酸比色法不需要對(duì)膽固醇進(jìn)行抽提而直接進(jìn)行測(cè)定。

本實(shí)驗(yàn)采用硫磷鐵化學(xué)顯色法。用無水乙醇抽提血清中的膽固醇，同時(shí)使蛋白質(zhì)沉淀。然后在乙醇提取液中加入硫磷鐵顯色劑，使膽固醇及其酯與濃硫酸及三價(jià)鐵作用，生成紫紅色化合物，此物質(zhì)在550nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，其顯色程度（顏色深淺）與膽固醇濃度（含量）呈正比。因此，可用比色法作總膽固醇的定量測(cè)定。將血清樣本與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，即可求出總膽固醇的含量。本法顏色產(chǎn)物比較穩(wěn)定。

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管及試管架，刻度吸量管或移液器，離心機(jī)，722型分光光度計(jì)，恒溫水浴箱。

【藥品及試劑】

血清，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，膽固醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，鐵儲(chǔ)存液，顯色液，濃硫酸，無水乙醇。

【試劑配制】

1.膽固醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液

精確稱取干燥重結(jié)晶膽固醇100mg，溶于無水乙醇內(nèi)（稍加溫助溶），然后移入100mL容量瓶中，加無水乙醇至所需刻度，儲(chǔ)存于棕色瓶中，密塞瓶口置于4℃冰箱內(nèi)保存。配制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液時(shí)，應(yīng)將其預(yù)先恢復(fù)至室溫。

2.膽固醇標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液

取上述儲(chǔ)存液5mL置于100mL容量瓶中，加無水乙醇至刻度，再加蒸餾水2 mL，儲(chǔ)存于棕色瓶?jī)?nèi)，放置在冰箱中保存，用時(shí)再將其恢復(fù)至室溫。

3.鐵儲(chǔ)存液

稱取三氯化鐵晶體（FeCl₃·6H₂O）2.5g溶于87%濃磷酸內(nèi)，并加至100mL，儲(chǔ)存于棕色瓶中。此液在室溫條件下可長(zhǎng)期保存。

4.顯色液

取鐵儲(chǔ)存液8mL，加濃硫酸至100mL，此液在室溫條件下可保存6～8周。

操作流程

【操作步驟】

1.提取液制備

準(zhǔn)確吸取血清0.10mL，置入干燥的試管中，對(duì)準(zhǔn)血清吹入無水乙醇2.9mL，抽提膽固醇，同時(shí)使蛋白質(zhì)分散成細(xì)小的沉淀，用力振蕩約10s，放置5min，再次搖勻沉淀，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心約10min，吸取上清液（即抽提液）置于另一支干凈試管中備用。

2.顯色反應(yīng)

取干燥試管3支，分別標(biāo)記。按表3－7進(jìn)行用硫磷鐵化學(xué)顯色法檢測(cè)血清總膽固醇濃度顯色反應(yīng)的操作步驟。

表3－7　硫磷鐵化學(xué)顯色法檢測(cè)血清總膽固醇濃度顯色反應(yīng)操作步驟（單位：mL）

3.比色測(cè)定

顯色液加畢，每加完一管試劑，立即振搖15～20次，置于室溫下冷卻15min，然后在550nm波長(zhǎng)處比色，以空白管調(diào)零點(diǎn)，測(cè)出各管吸光度值A(chǔ)。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

【注意事項(xiàng)】

（1）離心后上清液必須清亮透明，不能混有細(xì)微沉淀顆粒，否則要重新離心。

（2）顯色反應(yīng)與加顯色液后混合時(shí)的產(chǎn)熱程度有關(guān)，因此在操作中應(yīng)注意：①加入的顯色液必須與乙醇分成兩層，可稍后混合，不能邊加邊搖，否則顯色不完全；②顯色液要加一管混合一管，混合的手法也要一致；③實(shí)驗(yàn)過程中涉及濃硫酸、濃磷酸，混合時(shí)會(huì)導(dǎo)致試管發(fā)熱，且注意勿使管內(nèi)液體濺出，以免損傷衣服、皮膚、眼睛。

【實(shí)驗(yàn)意義】

1.正常值

正常空腹靜脈血清膽固醇濃度為2.9～6.0mmol/L。

2.意義

參見膽固醇氧化酶法實(shí)驗(yàn)意義。

二、膽固醇氧化酶法（COD－PAP法）

【實(shí)驗(yàn)原理】

酶分析法是目前常規(guī)檢測(cè)血清膽固醇的應(yīng)用方法，其優(yōu)點(diǎn)是快速準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)、樣本用量少、不需抽提，便于自動(dòng)化分析和批量測(cè)定，是中華醫(yī)學(xué)會(huì)檢驗(yàn)學(xué)會(huì)推薦的膽固醇測(cè)定的常規(guī)方法。

血清中的膽固醇約1/3為游離膽固醇，2/3為與脂肪酸結(jié)合的膽固醇酯。血清中膽固醇酯可被膽固醇酯水解酶（CEH）水解成游離膽固醇和游離脂肪酸（FFA）。膽固醇被膽固醇氧化酶（COD）氧化成Δ4－膽甾烯酮，并產(chǎn)生過氧化氫，再經(jīng)過氧化物酶（POD）催化，使H₂O₂與4－氨基安替吡啉、酚（三者合稱PAP）反應(yīng)，生成紅色苯醌亞胺（Trinder反應(yīng)）。苯醌亞胺在波長(zhǎng)為500nm左右有最大光吸收峰，其顯色程度（顏色深淺）與總膽固醇濃度（含量）呈正比。因此，血清樣本與同樣處理的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行比色，即可求出總膽固醇的含量。

反應(yīng)式如下：

【實(shí)驗(yàn)器材】

試管，試管架，微量加樣器，半自動(dòng)生化分析儀，記號(hào)筆，恒溫水浴箱。

【藥品及試劑】

（1）新鮮無溶血血清。

（2）商品試劑盒供應(yīng)，其主要成分與實(shí)驗(yàn)濃度如表3－8所示。

表3－8　膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度某試劑盒的主要成分與實(shí)驗(yàn)濃度

【試劑配制】

現(xiàn)在多用現(xiàn)成的試劑盒，方便、實(shí)用，既適用于手工操作，也適用于自動(dòng)分析儀。

操作流程

【操作步驟】

1.手工測(cè)定操作步驟

取干燥試管3支，分別標(biāo)記。按表3－9進(jìn)行膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度手工測(cè)定的操作步驟。

表3－9　膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度手工測(cè)定操作步驟（單位：μL）

各管搖勻，置于37℃恒溫水浴箱中5min，分光光度計(jì)波長(zhǎng)為500nm，比色杯光徑為1cm，以空白管調(diào)零，讀取各管吸光度值A(chǔ)。

2.自動(dòng)分析操作步驟

反應(yīng)模式：終點(diǎn)法。反應(yīng)溫度：37℃。測(cè)定波長(zhǎng)：500nm。

取一定量R₂（參看R₁瓶簽）復(fù)溶1瓶R₁，溶解后即為工作液。取干燥試管3支，分別標(biāo)記，按表3－10進(jìn)行膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度自動(dòng)分析的操作步驟。

表3－10　膽固醇氧化酶法檢測(cè)血清總膽固醇濃度自動(dòng)分析操作步驟（單位：mL）

分別混勻，在37℃恒溫水浴箱中保溫6min，以空白管調(diào)零，讀取濃度數(shù)值。

【實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析】

如果讀取吸光度值A(chǔ)，則按下式計(jì)算結(jié)果。

【注意事項(xiàng)】

（1）總膽固醇濃度可達(dá)12.93mmol/L。若樣品中膽固醇含量過高，則可用生理鹽水稀釋樣品，重新測(cè)定。結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。

（2）若檢測(cè)總膽固醇的血清（漿）標(biāo)本密閉保存，在40℃時(shí)可穩(wěn)定1周，－20℃時(shí)可穩(wěn)定半年以上。

（3）要求空腹抽血測(cè)定。

（4）酶分析法測(cè)定膽固醇的前兩步反應(yīng)特異性高，而指示反應(yīng)（第三步反應(yīng)）特異性則較差，干擾反應(yīng)往往發(fā)生在指示反應(yīng)中。溶血標(biāo)本、黃疸標(biāo)本及高血脂標(biāo)本均不影響測(cè)定結(jié)果，但血液中一些還原性物質(zhì)，如維生素C、谷胱甘肽及左旋多巴可與色原性氧受體競(jìng)爭(zhēng)H₂O₂，使結(jié)果出現(xiàn)偏差。

（5）試劑中酶的質(zhì)量影響測(cè)定結(jié)果。

【實(shí)驗(yàn)意義】

1.正常值

正常血清膽固醇濃度為3.6～5.17mmol/L（或參考試劑盒提供的參考范圍）。

2.意義

膽固醇是C3位置結(jié)合有羥基的類固醇。很多組織均可合成膽固醇，尤其是肝臟或小腸壁。體內(nèi)約3/4的膽固醇均為合成的，只有1/4來源于飲食。

影響總膽固醇水平的因素如下。①年齡與性別：膽固醇水平往往隨年齡上升，但到70歲后有所下降。中青年期女性低于男性，但女性絕經(jīng)后超過男性。②長(zhǎng)期的高膽固醇、高飽和脂肪、長(zhǎng)期的高蛋白和高熱量飲食，都可使膽固醇水平增高。③遺傳因素。④其他，如缺少運(yùn)動(dòng)、腦力勞動(dòng)、精神緊張等可能使膽固醇水平升高。

（1）總膽固醇水平增高常見于以下情況：①甲狀腺功能減退、動(dòng)脈硬化、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、心臟病及原發(fā)性高脂血癥（如家族性高膽固醇血癥及高脂血癥）、家族性apoB缺陷癥、多源性高膽固醇血癥、混合性高脂蛋白血癥等。②糖尿?。禾貏e是并發(fā)糖尿病昏迷時(shí)，幾乎都有總膽固醇水平升高。③慢性腎炎腎病期、腎病綜合征、類脂性腎病等。④膽總管阻塞時(shí)，總膽固醇水平增高且伴有黃疸。⑤長(zhǎng)期高脂飲食、精神緊張或女性妊娠期，總膽固醇水平也可升高。⑥家族性高總膽固醇血癥（低密度脂蛋白受體缺乏），家族性載脂蛋白β缺乏癥、混合性高脂蛋白血癥。⑦肥大性骨關(guān)節(jié)炎。⑧老年性白內(nèi)障、牛皮癬和黏液性水腫等。

（2）總膽固醇水平降低：在低脂蛋白血癥、惡性貧血、敗血癥、溶血性貧血以及甲狀腺功能亢進(jìn)時(shí)，血清膽固醇含量降低。其他如感染、營養(yǎng)不良、腸道吸收不良、家族性無β－脂蛋白、低β－脂蛋白血癥、藥物治療過程中的溶血性黃疸、慢性消耗性疾病、癌癥晚期等情況，膽固醇總量常見降低。近年來大量文獻(xiàn)報(bào)道表明，血清膽固醇含量過高與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，這更引起了人們的注意。肝臟是膽固醇及膽固醇卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶（LCAT）合成的器官。嚴(yán)重肝病患者，血清總膽固醇不一定很低，但由于血清中LCAT活力低下，血清膽固醇酯占TC的比例可達(dá)50%以下。此外，低總膽固醇者容易發(fā)生腦出血，也可能易患癌癥（未證實(shí)）。

能力檢測(cè)

一、單項(xiàng)選擇題

1.血清總膽固醇水平增高常見于（　?。?。

A.肝硬化　　B.心肌炎　　C.甲狀腺功能亢進(jìn)

D.糖尿病　　E.營養(yǎng)不良

2.下列哪種疾病可能不會(huì)繼發(fā)血清總膽固醇水平降低？（　?。?/p>

A.低脂蛋白血癥　　B.惡性貧血　　　C.敗血癥

D.溶血性貧血　　　E.膽總管阻塞

3.Ⅱa型高脂蛋白血癥的血清學(xué)檢查特點(diǎn)是（　　）。

A.血清透明，膽固醇明顯增加，甘油三酯正常

B.血清乳白色，膽固醇正?；蛏愿撸视腿ッ黠@增加

C.血清混濁，膽固醇稍高，甘油三酯增高

D.血清混濁，膽固醇正常，甘油三酯稍高

E.血清透明，膽固醇增加，甘油三酯低于正常水平

4.以下哪項(xiàng)增高與冠心病發(fā)病呈負(fù)相關(guān)？（　?。?/p>

A.HDL－c　　B.LDL－c　　C.CHO　　D.TG　　E.α－LP

5.血清中的膽固醇在下列哪種脂蛋白中含量最多？（　?。?/p>

A.CM　B.VLDL　C.LDL　D.HDL　E.α－LP