變性梯度凝膠電泳解析微生物菌群結(jié)構(gòu)_現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)二十一　變性梯度凝膠電泳解析微生物菌群結(jié)構(gòu)

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

（1）掌握變性梯度凝膠電泳的原理及用途。

（2）學(xué)習(xí)變性梯度凝膠電泳的操作方法，并解析環(huán)境樣品中的微生物菌群結(jié)構(gòu)。

二、實(shí)驗(yàn)原理

變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）技術(shù)是用于檢測(cè)DNA突變的一種電泳技術(shù)。它的分辨精度比瓊脂糖電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳更高，可以檢測(cè)到一個(gè)核苷酸水平的差異。其原理是：雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長(zhǎng)度的DNA片段能夠被區(qū)分開(kāi)，但同樣長(zhǎng)度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區(qū)分。DGGE／TGGE技術(shù)在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎(chǔ)上，加入了變性劑（尿素和甲酰胺）梯度或是溫度梯度，從而能夠把同樣長(zhǎng)度但序列不同的DNA片段區(qū)分開(kāi)來(lái)。一個(gè)特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區(qū)域（melting domain，MD）和解鏈行為（melting behavior）。一個(gè)幾百個(gè)堿基對(duì)的DNA片段一般有幾個(gè)解鏈區(qū)域，每個(gè)解鏈區(qū)域有一段連續(xù)的堿基對(duì)組成。當(dāng)溫度逐漸升高（或是變性劑濃度逐漸增加）達(dá)到其最低的解鏈區(qū)域溫度時(shí)，該區(qū)域這一段連續(xù)的堿基對(duì)發(fā)生解鏈。當(dāng)溫度再升高依次達(dá)到各其他解鏈區(qū)域溫度時(shí)，這些區(qū)域也依次發(fā)生解鏈。直到溫度達(dá)到最高的解鏈區(qū)域溫度后，最高的解鏈區(qū)域也發(fā)生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。因此，即使是大小相同，但堿基排列有差異的DNA片段，在不同濃度梯度的變性劑（尿素和甲酰胺）凝膠中電泳，根據(jù)部分解離的條件不同，其移動(dòng)速度不同而得到分離。通過(guò)染色后可以在凝膠上呈現(xiàn)為分散的條帶。因此，該技術(shù)可以分辨具有相同或相近分子量的目的片斷序列差異，可以用于檢測(cè)單一堿基的突變和遺傳多樣性以及PCR擴(kuò)增DNA片段的檢測(cè)，常常被用于環(huán)境樣品中復(fù)雜微生物菌群的分析。

從環(huán)境樣品中直接提取總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增到含有某一高度可變區(qū)的目的DNA序列產(chǎn)物，通過(guò)DGGE得到圖譜。因?yàn)槊總€(gè)條帶就代表一個(gè)微生物物種，所以DGGE帶譜中條帶的數(shù)量，即反映該環(huán)境微生物群落中類群的數(shù)量。為了得到更詳細(xì)的信息，往往采用種或類群專一性探針與得到的條帶進(jìn)行雜交或?qū)l帶切下，重新PCR擴(kuò)增后測(cè)序，進(jìn)而得到部分系統(tǒng)發(fā)育信息。

圖21－1　PCR－DGGE工作流程

根據(jù)DGGE變性梯度的方向與電泳方向是否一致，可將其分為兩種形式的DGGE。垂直DGGE的變性梯度方向垂直于電泳方向，常用的變性劑濃度梯度范圍較寬，如0～100%、20%～70%，常用于優(yōu)化樣品的分離條件（即最佳變性梯度范圍），電泳后經(jīng)染色其DNA片段呈現(xiàn)“S”形曲線。水平DGGE的變性梯度方向平行于電泳方向，常用的變性劑濃度梯度范圍較窄，可用于多個(gè)樣本的同時(shí)分析，能更好地分離DNA片段。

三、實(shí)驗(yàn)器材

（一）樣品

提取天然溫泉水的宏基因組并制備16SrDNA V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，作為本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)材料。

（二）藥品

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－Na2），丙烯酰胺－雙丙烯酰胺（37．5∶1），Tris，過(guò)硫酸銨（APS），TEMED，冰醋酸，去離子甲酰胺，6×Loading Buffer。

（三）溶液

（1）0．5mol／L EDTA（pH 8．0）：在800mL水中加入186．1g二水乙二胺四乙酸二鈉，在磁力攪拌器上劇烈攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH值至8．0（約需20g NaOH顆粒），然后定容至1L，分裝后高壓滅菌備用。

（2）50×TAE緩沖液：242g Tris，57．1mL冰醋酸，100mL 0．5mol／L EDTA （pH 8．0），定容至1L，高壓蒸汽滅菌，室溫保存。

（3）40%丙烯酰胺－雙丙烯酰胺：40g丙烯酰胺－雙丙烯酰胺（37．5∶1）用蒸餾水溶解，定容至100mL，4℃保存。

（4）丙烯酰胺變性膠制備：DGGE變性膠中的丙烯酰胺濃度為8%。變性劑濃度為0和100%的變性膠配方如下所示。

（5）變性劑溶液：DGGE的變性膠在普通的丙烯酰胺膠的基礎(chǔ)上加入一定濃度的變性劑（甲酰胺和尿素），不同濃度變性劑溶液的配方如下所示。

（6）10%APS溶液：稱取0．1g過(guò)硫酸銨，溶解于0．9mL的蒸餾水中。

（四）儀器

壓力蒸汽滅菌器、pH計(jì)、移液槍、水平凝膠電泳儀、變性梯度凝膠電泳、凝膠成像系統(tǒng)。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

（一）DGGE垂直電泳

1．丙烯酰胺變性凝膠膠溶液的配制

垂直DGGE的變性梯度方向與電泳方向垂直。這種膠適用于確定分離長(zhǎng)度相同但序列不同的DNA片段的最佳梯度范圍。垂直電泳的凝膠溶液中丙烯酰胺－雙丙烯酰胺（37．5∶1）的濃度為8%，低濃度膠的變性劑濃度為20%，高濃度膠的變性劑濃度為70%。

2．垂直梯度膠7．5mm×10mm制膠板的裝配

在灌膠之前，必須先將制膠板裝配好，并檢查其密封性。DGGE垂直膠的制膠板裝配步驟如下：

（1）先將長(zhǎng)玻璃板水平放置，再將兩片塑料隔片分別放在長(zhǎng)玻璃板的左右兩側(cè)，塑料隔片的厚度均為1．0mm，有凹槽的那面貼著長(zhǎng)玻璃板，并且隔片上的小洞必須在玻璃外側(cè)，使得兩片隔片面對(duì)面，以確保凝膠溶液能流入“三明治”夾板。

（2）將短玻璃板疊在上面，底部和長(zhǎng)玻璃板對(duì)齊，兩片玻璃板和塑料隔片形成“三明治”夾板。

（3）將“三明治”夾板用左右兩個(gè)夾具夾緊，并將左右兩個(gè)注射螺帽擰緊，完全將“三明治”夾板固定住。

（4）將“三明治”夾板放在制膠架上，兩邊固定住，底部用海綿墊固定防漏，將夾具的螺絲檸松，在玻璃板中間插入直線隔片用來(lái)對(duì)齊兩邊的塑料隔板，對(duì)齊后將螺絲擰緊，并將直線隔板取出。

（5）將“三明治”夾板從制膠架上取出，在玻璃板中間的頂部插入兩孔的梳子，從玻璃板底部的正中間插入中間隔片。

（6）將“三明治”夾板頂部用梳架固定住，確保密封性，然后將整個(gè)裝置垂直放在制膠架上固定，注意短玻璃的一面正對(duì)著自己。

（7）裝配好16mm×10mm制膠板，被中間隔片分成兩塊7．5mm×10mm的小制膠板。

3．垂直梯度膠的制備

在制膠板裝配好后，將凝膠溶液用梯度形成器灌入制膠板，靜置1h，等待凝膠凝固。步驟如下：

（1）將制膠板裝置翻轉(zhuǎn)90°。

（2）共有三根聚乙烯細(xì)管，其中兩根較長(zhǎng)的為15．5cm，短的那根長(zhǎng)9cm。將短的那根與Y形管相連，兩根較長(zhǎng)的則與小套管相連，并連在10mL的注射器上。

（3）在兩個(gè)注射器上分別標(biāo)記“高濃度”與“低濃度”，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度傳送系統(tǒng)的刻度到適當(dāng)?shù)奈恢谩?/p>

（4）反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)凸輪到起始位置。旋松體積調(diào)整旋鈕，將體積設(shè)置顯示裝置固定在注射器上并調(diào)整到4．5，旋緊體積調(diào)整旋鈕。

（5）配制兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液各10mL，置于兩個(gè)離心管中。

（6）每管加入60μL 10%APS，10μL TEMED，迅速蓋上并旋緊帽后上下顛倒數(shù)次混勻。用連有聚乙烯管標(biāo)有“高濃度”的注射器吸取所有高濃度的膠，對(duì)低濃度的膠同樣操作。

（7）通過(guò)推動(dòng)注射器推動(dòng)桿小心趕走氣泡并輕柔地晃動(dòng)注射器，推動(dòng)溶液到聚丙烯管的末端（注意不要將膠液推出管外，因?yàn)檫@樣會(huì)造成溶液的損失，導(dǎo)致最后凝膠體積不夠）。

（8）分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側(cè)固定好（注意位置一定要放正確），再將注射器的聚丙烯管同Y形管相連。

（9）輕柔并穩(wěn)定地旋轉(zhuǎn)凸輪來(lái)傳送溶液，此步驟最關(guān)鍵是要保持恒定勻速且緩慢地推動(dòng)凸輪，以使溶液恒速地被灌入到三明治式的凝膠板中。

（10）讓凝膠聚合大約一個(gè)小時(shí)，待凝膠凝固后，將制膠裝置翻轉(zhuǎn)180°，用同樣的方法將另一塊膠制好。

4．電泳

（1）在電泳槽中加入7L1×TAE緩沖液，并把電泳控制裝置打開(kāi)，預(yù)熱到60℃。

（2）等兩塊膠都聚合完畢后拔走梳子，將膠放入電泳槽內(nèi)，清洗點(diǎn)樣孔，蓋上溫度控制裝置使溫度上升到60℃。

（3）將16SrDNA樣品和6×Loading Buffer以5∶1混合，用注射針點(diǎn)樣。

（4）按設(shè)定好的條件進(jìn)行電泳，60℃，恒壓80V，電泳1h。

（5）電泳完畢后用EB染色，然后用Bio－Rad Quantity One system拍照。

（二）DGGE水平電泳

1．丙烯酰胺變性凝膠膠溶液的配制

水平DGGE可以用來(lái)分析大量的樣品。水平電泳的凝膠溶液中丙烯酰胺－雙丙烯酰胺（37．5∶1）的濃度為8%，低濃度膠的變性劑濃度為35%，高濃度膠的變性劑濃度為55%。

2．水平梯度膠16mm×16mm制膠板的裝配

（1）先將長(zhǎng)玻璃板水平放置，再將兩片塑料隔片分別放在長(zhǎng)玻璃板的左右兩側(cè)，塑料隔片的厚度均為1．0mm。

（2）將短玻璃板疊在上面，底部和長(zhǎng)玻璃板對(duì)齊，兩片玻璃板和塑料隔片形成“三明治”夾板。

（3）將“三明治”夾板用左右兩個(gè)夾具夾緊，將“三明治”夾板放在制膠架上，兩邊固定住，底部用海綿墊固定防漏。

（4）將夾具的螺絲檸松，在玻璃板中間插入直線隔片用來(lái)對(duì)齊兩邊的塑料隔板，對(duì)齊后將螺絲擰緊，并將直線隔板取出。

3．水平梯度膠的制備

（1）將海綿墊固定在制膠架上，把類似“三明治”結(jié)構(gòu)的制膠板系統(tǒng)垂直放在海綿上方，用分布在制膠架兩側(cè)的偏心輪固定好制膠板系統(tǒng)，注意一定是短玻璃的一面正對(duì)著自己。

（2）共有三根聚乙烯細(xì)管，其中兩根較長(zhǎng)的為15．5cm，短的那根長(zhǎng)9cm。將短的那根與Y形管相連，兩根長(zhǎng)的則與小套管相連，并連在30mL的注射器上。

（3）在兩個(gè)注射器上分別標(biāo)記“高濃度”與“低濃度”，并安裝上相關(guān)的配件，調(diào)整梯度傳送系統(tǒng)的刻度到適當(dāng)?shù)奈恢谩?/p>

（4）反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)凸輪到起始位置。為設(shè)置理想的傳送體積，旋松體積調(diào)整旋鈕，將體積設(shè)置顯示裝置固定在注射器上并調(diào)整到14．5，旋緊體積調(diào)整旋鈕。

（5）配制兩種變性濃度的丙烯酰胺溶液各20mL，置于兩個(gè)離心管中。

（6）每管加入120μL 10%APS，20μL TEMED，迅速蓋上并旋緊帽后上下顛倒數(shù)次混勻。用連有聚乙烯管標(biāo)有“高濃度”的注射器吸取所有高濃度的膠，對(duì)低濃度的膠同樣操作。

（7）通過(guò)推動(dòng)注射器推動(dòng)桿小心趕走氣泡并輕柔地晃動(dòng)注射器，推動(dòng)溶液到聚丙烯管的末端。

（8）分別將高濃度、低濃度注射器放在梯度傳送系統(tǒng)的正確一側(cè)固定好，再將注射器的聚丙烯管同Y形管相連。

（9）輕柔并穩(wěn)定地旋轉(zhuǎn)凸輪來(lái)傳送溶液，此步驟最關(guān)鍵是要保持恒定勻速且緩慢地推動(dòng)凸輪，以使溶液恒速地被灌入到“三明治”式的凝膠板中。

（10）小心插入梳子，讓凝膠聚合大約一個(gè)小時(shí)。在電泳槽中加入7L1×TAE緩沖液，并把電泳控制裝置打開(kāi)，預(yù)熱至60℃。

（11）聚合完畢后拔走梳子，將膠放入到電泳槽內(nèi)，清洗點(diǎn)樣孔。

（12）將16SrDNA樣品和5×Loading Buffer以5∶1混合，用注射針點(diǎn)樣，上樣量為30μL PCR產(chǎn)物。

（13）蓋上溫度控制裝置使溫度上升至60℃，然后開(kāi)始電泳。

（14）電泳完畢后用EB染色，然后用Bio－Rad Quantity One System拍照。

4．電泳條件

水平DGGE的電泳條件為60℃，恒壓150V，電泳4．5h。

（三）特征條帶的回收及純化

純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析后，然后根據(jù)需要對(duì)圖譜中的條帶進(jìn)行割膠回收。

（1）用干凈的無(wú)菌手術(shù)刀片將特征條帶切割下來(lái)，用無(wú)菌蒸餾水清洗膠表面后放入潔凈的無(wú)菌1．5mL離心管中。

（2）用無(wú)菌槍頭將凝膠塊搗碎。

（3）加入20μL ddH2O，混勻，4℃下放置過(guò)夜。

（4）稍微離心，將上清液轉(zhuǎn)移到新的1．5mL離心管中。

將回收到的DNA片段再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序同上。將回收DNA的PCR產(chǎn)物再用DGGE分析，確定此條帶在DGGE圖譜上的位置和原始條帶一致，才能進(jìn)行序列分析。

（四）16SrDNA序列分析

回收到的DNA片段經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，16SrDNA擴(kuò)增引物F341－GC／R518，模板為回收產(chǎn)物10μL，程序采用降落PCR。測(cè)序由上海生工生物工程有限公司完成。登錄NCBI（www．ncbi．nlm．nih．gov／blast／），將所得序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行比較。用Clustal X進(jìn)行相似性分析，然后用MEGA 4．0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。

圖21－2　系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)

五、實(shí)驗(yàn)記錄

（1）分析電泳后形成的條帶。

（2）將實(shí)驗(yàn)拍照結(jié)果貼到指定框內(nèi)。

六、思考題

（1）DGGE技術(shù)可以應(yīng)用到哪些領(lǐng)域？

（2）DGGE在制膠過(guò)程中有哪些注意事項(xiàng)？

（3）V3區(qū)為何可被用于細(xì)菌的分類學(xué)研究？

參考文獻(xiàn)

［1］都立輝，劉芳．16SrRNA基因在細(xì)菌菌種鑒定中的應(yīng)用［J］．乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006，120（5）：207—209．

［2］Liang ZB，Drijber RA．A DGGE－cloning method to characterize arbuscular mycorrhizal community structure in soil［J］．Soil Biology and Biochemistry，2008，40（4）：956—966．

［3］Cherif H，Ouzari H，et al．Bacterial community diversity assessment in municipal solid waste compost amended soil using DGGE and ARISA fingerprinting methods［J］．World Journal of Microbiology ＆Biotechnology，2008，24（7）：1159—1167．

［4］Yoshida A，Seo Y，et al．Actinomycetal community structures in seawater and freshwater examined by DGGE analysis of 16SrRNA gene fragments ［J］．Marine biotechnology，2008，10（5）：554—563．

［5］Smalla K，Oros－Sichler M，Milling A，et al．Bacterial diversity of soils assessed by DGGE，T－RFLP and SSCP fingerprints of PCR－amplified 16SrRNA gene fragments：do the different methods provide similar results？［J］．Journal of Microbiological Methods，2007，69（3）：470—479．

［6］The DCodeTM Universal Mutation Detection System．Catalog Numbers 170—9080 through 170—9104．

［7］Zidkova K，Kebrdlova V．Detection of variability in apo（a）gene transcription regulatory sequences using the DGGE method［J］．Clinica Chimica Acta，2007，376（1）：77—81．

［8］Hong H，Pruden A，Reardon K F．Comparison of CE－SSCP and DGGE for monitoring a complex microbial community remediating mine drainage［J］．Journal of Microbiological Methods，2007，69（1）：52—64．

［9］楊龍．氡溫泉耐輻射嗜熱微生物的分類鑒定及其耐輻射機(jī)制的初步研究［D］．杭州：浙江工商大學(xué)，2010．