電泳分析技術(shù)的臨床應(yīng)用_生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)

1.隨著電泳技術(shù)的不斷發(fā)展和改進(jìn),自動(dòng)化電泳分析已引入臨床實(shí)驗(yàn)室,電泳技術(shù)在疾病診斷中發(fā)揮的作用越來(lái)越大,特別是為體液蛋白質(zhì)、同工酶等的檢測(cè)方面提供了新的手段。

(1)血清蛋白電泳:新鮮血清經(jīng)醋酸纖維薄膜或瓊脂糖電泳、染色后,常見清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5條區(qū)帶。急性炎癥或急性時(shí)相反應(yīng)時(shí)α1、α2區(qū)帶加深為特征;妊娠時(shí)α1區(qū)帶增高,伴有β區(qū)帶增高;缺鐵性貧血β區(qū)帶增高;腎病綜合征、慢性腎小球腎炎清蛋白下降,α1-、β-球蛋白升高;慢性肝病或肝硬化清蛋白顯著降低,γ-球蛋白升高2~3倍,甚至可見β~γ橋;單克隆Ig異常癥(M蛋白血癥)在α~γ區(qū)呈現(xiàn)致密而深染,高度集中的蛋白質(zhì)克隆增生區(qū)帶(M蛋白區(qū)帶)。

(2)尿蛋白電泳:在無(wú)損傷時(shí),用于協(xié)助判斷腎病變的嚴(yán)重程度。尿蛋白電泳后呈現(xiàn)中、高分子蛋白質(zhì)區(qū)帶主要反映腎小球病變,呈現(xiàn)低分子蛋白質(zhì)區(qū)帶見于腎小管病變或溢出性蛋白尿(如本周蛋白),混合性蛋白尿可見到各種分子量區(qū)帶,提示腎小球和腎小管均受累及。

(3)腦脊液蛋白電泳:將患者血清和腦脊液(CSF)同步進(jìn)行電泳分析,如CSF標(biāo)本中檢出寡克隆區(qū)帶,是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要指標(biāo),主要用于多發(fā)性硬化癥、癡呆、脊髓炎、亞急性腦白質(zhì)炎、神經(jīng)性梅毒等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷和鑒別診斷。

(4)血紅蛋白及糖化血紅蛋白電泳:用電泳法鑒別血紅蛋白(Hb)的類型及含量對(duì)于貧血的診斷及治療具有重要意義。Hb A 2增高是β2輕型地中海貧血的典型表現(xiàn),Hb A 2減低常見于缺鐵性貧血及其他血紅蛋白合成障礙性疾病(如α2地中海貧血)。電泳發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白如HbC、Hb D、Hb E、Hb K和HbS等可診斷為相應(yīng)血紅蛋白分子病。在酸性條件下電泳,可將糖化血紅蛋白的不同組分Hb A 1 a、Hb A 1 b和Hb A 1 c分離,糖化血紅蛋白(Hb A 1 c)是血紅蛋白與血糖結(jié)合的產(chǎn)物,可特異性反映測(cè)定前1~2個(gè)月體內(nèi)葡萄糖水平。

(5)免疫固定電泳:對(duì)各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型,常用于臨床常規(guī)M蛋白的分型與鑒定。一般用于單克隆免疫球蛋白病、單克隆免疫球蛋白增殖病、多組分單克隆免疫球蛋白病、多克隆免疫球蛋白病、CSF寡克隆蛋白鑒別、本周蛋白和游離輕鏈病、重鏈病的診斷和鑒別診斷。

(6)同工酶電泳:臨床上用于同工酶或同工酶亞型分析。

①乳酸脫氫酶(LDH)同工酶:用瓊脂糖凝膠電泳(AGE)法可分離出5種同工酶區(qū)帶(LDH 1~LDH 5)。主要用于急性心肌梗死(LDH 1>LDH 2)及骨骼肌疾病(LDH 5升高)的診斷和鑒別診斷。惡性腫瘤、肝硬化時(shí)LDH 5明顯升高,或在胸腔積液、腹水中出現(xiàn)一條異常LDH 6區(qū)帶。

②肌酸激酶(CK)同工酶:用AGE法可分離出3種CK同工酶。CK-MB在心肌梗死早期增加,短時(shí)間內(nèi)達(dá)峰值也是心肌再灌注的指征。CK-BB增高見于腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、小細(xì)胞肺癌和胃腸道惡性腫瘤等。

③CK同工酶亞型:指CK-MM亞型(CK-MM 1、CK-MM 2、CK-MM 3)和CK-MB亞型(CK-MB1、CK-MB2),采用瓊脂糖凝膠高壓電泳可進(jìn)行CK同工酶亞型的常規(guī)快速分析,用于早期心肌損傷的診斷與鑒別診斷。主要用于急性心肌梗死的早期診斷,也可用于確定心肌再灌注、溶栓治療后的病情觀察。

④堿性磷酸酶(ALP)同工酶:可采用AGE法進(jìn)行ALP同工酶的常規(guī)快速分析。肝外阻塞性黃疸、轉(zhuǎn)移性肝癌、肝膿腫和膽石癥時(shí)膽汁ALP檢出率很高,并伴有肝ALP增加,肝內(nèi)膽汁淤積、急性肝炎、原發(fā)性肝癌等主要表現(xiàn)為肝ALP增多,大多數(shù)不出現(xiàn)膽汁ALP。甲狀腺功能亢進(jìn)癥、惡性骨損傷、佝僂病、骨折、肢端肥大癥所致骨損傷等,均引起骨ALP同工酶增加。骨ALP、高分子ALP同工酶對(duì)惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移或肝轉(zhuǎn)移的陽(yáng)性預(yù)示值較總ALP高。胃腸道腫瘤、肺癌等惡性腫瘤時(shí)出現(xiàn)類腸型ALP。

⑤γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT/GGT)同工酶:用CAE或AGE法可將γ-GT同工酶分離為γ-GT1~γ-GT4,正常人只見γ-GT 2和γ-GT3,重癥肝膽疾病和肝癌時(shí)常有γ-GT1出現(xiàn),γ-GT 4與膽紅素增高密切相關(guān)。

(7)脂蛋白電泳:脂蛋白電泳主要用于高脂血癥的分型、冠心病危險(xiǎn)性估計(jì),動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)疾病的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療效果觀察的研究。

2.下面介紹醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的原理和方法。

(1)目的:理解醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質(zhì)的基本原理及質(zhì)量保證,學(xué)會(huì)基本操作步驟,了解血清蛋白電泳的主要臨床意義。

(2)原理:利用不同蛋白質(zhì)的分子大小和表面電荷的差別,在直流電場(chǎng)中泳動(dòng)速度不同將蛋白質(zhì)分離。血清中各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)(pI)均低于7.0,在p H8.6的緩沖液中都帶有負(fù)電荷。由于各種蛋白質(zhì)的pI不同,帶電荷量不相等,加之分子大小不一,導(dǎo)致在電場(chǎng)中的泳動(dòng)速度不同,帶電荷越多泳動(dòng)速度越快;分子量和體積越大的蛋白分子泳動(dòng)速度越慢;等電點(diǎn)低的蛋白質(zhì)分子泳動(dòng)快,等電點(diǎn)高的泳動(dòng)慢。按其泳動(dòng)速度可從正極起,依次分離出清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5個(gè)組分,它們的相對(duì)分子質(zhì)量及等電點(diǎn)見表3-2。

表3-2　血清蛋白各組分的分子量及等電點(diǎn)

將蛋白質(zhì)固定染色后,洗去多余染料,可觀察清晰的色帶。將各色帶剪開,分別溶于堿性液中,進(jìn)行比色分析,計(jì)算出各種蛋白質(zhì)的百分含量,或用光密度掃描儀掃描定量。

(3)器材與試劑

①器材

a.電泳儀:選用穩(wěn)壓直流電源,電壓0~600V,電流0~300m A。

b.電泳槽:適合醋酸纖維薄膜的電泳槽,電極用鉑(白金)絲。

c.血清加樣器:可用10μl的微量吸管或?qū)Ｓ玫碾娪狙寮訕悠鳌?/p>

d.光密度掃描儀。

e.分光光度計(jì)。

②試劑

a.巴比妥緩沖液(p H8.6,離子強(qiáng)度0.06):取巴比妥1.62g,巴比妥鈉12.38g,用500ml蒸餾水加熱溶解,冷卻后,再用蒸餾水補(bǔ)足至1000ml。

b.染色液

氨基黑10B染色液:氨基黑10B 1g,三氯乙酸13.4g,磺基水楊酸(磺柳酸)13.4g,加蒸餾水溶解,并定容至1000ml。

麗春紅染色液:麗春紅2R 0.8g,溶于6%三氯乙酸100ml中。

c.漂洗液

氨基黑漂洗液:甲醇40ml,冰乙酸10ml,蒸餾水50ml,混勻。

麗春紅漂洗液:2.5%(V/V)乙酸溶液。

d.洗脫液

氨基黑洗脫液:0.4mol/L NaOH溶液。

麗春紅洗脫液:0.1mol/L NaOH溶液。

e.透明液:冰乙酸30ml,無(wú)水乙醇70ml,乙酸乙酯1ml,混勻。

f.醋酸纖維薄膜:規(guī)格:2cm×8cm。

(4)操作

①準(zhǔn)備:將緩沖液加入電泳槽內(nèi),調(diào)節(jié)兩側(cè)槽內(nèi)的緩沖液,使其液面處在同一水平面上,在電泳槽內(nèi)側(cè)支持板上搭橋(一般用4層濾紙或紗布)。

②醋酸纖維薄膜的準(zhǔn)備:在醋酸纖維薄膜(2cm×8cm)的無(wú)光澤面(毛面)距一端1.5cm處,與端線平行用鉛筆輕畫一橫線,作為點(diǎn)樣線。把膜放入緩沖液中浸泡30min以上,使其完全浸透。

③點(diǎn)樣:將浸透后的醋酸纖維薄膜取出吸干,用微量吸管或?qū)Ｓ眉訕悠魑o(wú)溶血血清3~5μl在毛面點(diǎn)樣線上加樣,使血清全部滲入膜內(nèi)。

④電泳:將點(diǎn)樣后的醋酸纖維薄膜置于電泳槽架上,毛面向下,點(diǎn)樣端置于負(fù)極側(cè),并拉直,用雙層濾紙或4層紗布將膜的兩端與緩沖液連通,平衡約5min后通電。電壓為90~ 150V,電流為0.4~0.8m A/cm寬,夏季通電約45min,冬季通電約60min,待電泳區(qū)帶展開25~35mm,即可關(guān)閉電源。

⑤染色與漂洗:通電完畢后,取出薄膜并水平移出,浸于染色液中固定染色5~10min后取出,用漂洗液反復(fù)漂洗數(shù)次,直到背景無(wú)色為止。用濾紙吸干多余的漂洗液,此時(shí)可見界限清晰的5條區(qū)帶。

⑥定量:取6支試管編號(hào),各加入0.4mol/L NaOH溶液4ml。剪開薄膜上各條蛋白區(qū)帶,另于空白部位剪一平均大小的薄膜條,將各條分別浸于上述試管中,振搖數(shù)次后,置于37℃水浴箱20min,使染料浸出。氨基黑10B染色,用分光光度計(jì)選用620nm波長(zhǎng),麗春紅染色選用580nm。用空白管調(diào)零,分別讀取各管吸光度值。以各管吸光度值之和作為100%,求出各管吸光度值的百分?jǐn)?shù),即該種蛋白質(zhì)占血清總蛋白的百分含量。

如使用光密度掃描儀掃描,需先將染色干燥后的薄膜置透明液中10~20min,取出貼于玻璃板上晾干。得到透明薄膜,可用光密度掃描儀描記電泳曲線(圖3-3)。

圖3-3　血清蛋白電泳光密度掃描曲線

(5)計(jì)算

式中:A T表示各組分蛋白吸光度總和;A X表示各個(gè)組分蛋白的吸光度。

(6)參考區(qū)間:清蛋白:55%~74%;α1-球蛋白:2%~5%;α2-球蛋白:4%~9%;β-球蛋白: 6.5%~12%;γ-球蛋白:12%~20%。

(7)質(zhì)量保證

①電泳槽緩沖液的液面要保持一定高度,過(guò)低可出現(xiàn)γ-球蛋白的電滲現(xiàn)象,同時(shí)電泳槽兩側(cè)的液面保持在同一水平面上,避免虹吸現(xiàn)象產(chǎn)生,影響蛋白質(zhì)分子的泳動(dòng)速度。

②每次電泳完畢后應(yīng)交換電極以使兩側(cè)電泳槽內(nèi)的正、負(fù)離子相互交換,維持緩沖液的p H在一定水平。

③電泳失敗或圖譜不理想的原因常見于以下幾個(gè)方面。

a.電泳圖譜不整齊:點(diǎn)樣不均勻、薄膜未完全浸透、溫度過(guò)高致使水分蒸發(fā)、緩沖液變質(zhì)、薄膜放置不正,使電流方向不平行。

b.樣品分離不清晰:點(diǎn)樣過(guò)多、電流過(guò)低、薄膜結(jié)構(gòu)過(guò)密、透水性差、導(dǎo)電差等。

c.清蛋白中間著色淺:染色時(shí)間不足或染色液陳舊;清蛋白含量過(guò)高,可減少血清用量或延長(zhǎng)染色時(shí)間。

d.電泳速度慢:電流過(guò)低、供給薄膜的水分不足、溫度過(guò)低、薄膜結(jié)構(gòu)致密,導(dǎo)電差、緩沖液蒸發(fā)使離子強(qiáng)度增加等。

e.薄膜透明不完全:薄膜未完全干燥即浸入透明液中、透明液中冰醋酸含量不足、浸透時(shí)間不夠、透明過(guò)程中遇水分。

f.透明膜上有氣泡:玻片上有油脂,貼膜時(shí)滾動(dòng)不佳。

(8)臨床意義:正常血清經(jīng)電泳后,常見清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白5條區(qū)帶。臍帶血清、胎兒血清、部分原發(fā)性肝癌,在清蛋白與α1球蛋白之間增加了一條甲胎蛋白帶。常見電泳圖譜異常如下。

①M(fèi)蛋白血癥:單克隆γ-球蛋白(M蛋白)血癥,主要見于多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、重鏈病及一些良性的M蛋白增多癥。在β-球蛋白和γ-球蛋白后區(qū)段的各部分出現(xiàn)一條致密深染的M蛋白帶。

②蛋白缺乏癥:主要包括α1抗胰蛋白酶缺乏癥、γ-球蛋白缺乏癥等。臨床上較少見。電泳圖譜表現(xiàn)為α1-球蛋白和γ-球蛋白缺乏或顯著降低。

③腎病:見于急慢性腎炎、腎病綜合征、腎衰竭等表現(xiàn)為清蛋白降低,α2-球蛋白和β-球蛋白升高。

④急性炎癥或急性時(shí)相反應(yīng):α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白均升高。

⑤急慢性肝炎或肝硬化:清蛋白顯著降低,β-球蛋白、γ-球蛋白升高2~3倍,可見兩種球蛋白相粘連的“β-γ”橋,主要由于Ig A增高所致。