低階煤降解微生物菌群的分離及其降解效果研究

高同國(guó) 姜  峰 楊金水 袁紅莉

（農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)微生物資源及利用重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院 北京 100193）

摘  要：本研究從不同地域低階煤中分離篩選得到低階煤降解菌群，選取其中降解能力最強(qiáng)的菌群，對(duì)其降解內(nèi)蒙霍林河褐煤產(chǎn)生的黃腐酸特性及產(chǎn)品效果進(jìn)行初步研究，并與真菌(Penicillium s p.P6)降解內(nèi)蒙霍林河褐煤得到的黃腐酸進(jìn)行比較，研究褐煤經(jīng)不同微生物降解后黃腐酸的特性及生物活性的差別。結(jié)果分離到優(yōu)勢(shì)降解菌群3個(gè)，紫外-可見(jiàn)光光譜，紅外光譜表明SL-2降解褐煤得到的黃腐酸與P6降解褐煤得到的黃腐酸在結(jié)構(gòu)上有所差別；生菜發(fā)芽的效果表明，兩種黃腐酸均表現(xiàn)出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)似物的性質(zhì)，但由于不同微生物降解產(chǎn)生的黃腐酸在官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和數(shù)量上有所差別，黃腐酸對(duì)根和莖生長(zhǎng)的作用和濃度不盡相同。

關(guān)鍵詞：低階煤 褐煤 菌群 黃腐酸 微生物

Study on the Isolation and Degradation of Bacterial Consortium From Low-Rank Coal

Gao Tongguo, Jiang Feng, Yang Jinshui, Yuan Hongli

( State Key Lab for Agrobiotechnology

Key Llaboratory of Agro-Microbial Resource and Application, Ministry of Agriculture

College of Biological Science, China Agricultural University, Beijing, 100094)

Abstract: Bacterial consortium was isolated from low rank coal collected from different places. The character and biological activity of fulvic acid, produced by the effective mixed-culture, were studied, and compared with the fulvic acid produced from lignite by Penicillium sp.P6 in this work. The results showed that 3 consortia have the ability to degrade the weathered coal, and the SL-2 was the most effective one. Ultraviolet-visible absorption spectroscopy and FT-IR spectra results indicated the character of fulvic acid produced by degrading lignite by SL-2 and P6 were different .The effect of the two fulvic acids on the lettuce was also studied. The results showed fulvic acid have the of hormone-like activity on plant growth, but different fulvic acid have different way to stimulate the plant on shoot and root.

Key words: low- rank coal; lignite; bacterial consortium; fulvic acid; microorganism

黃腐酸(fulvic acid，簡(jiǎn)稱(chēng)為FA)又被稱(chēng)作富里酸，是腐植酸中分子量最小、生物活性最強(qiáng)、水酸堿均可溶的組分，黃腐酸在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工、醫(yī)藥上都有廣泛的應(yīng)用。在農(nóng)業(yè)上黃腐酸具有刺激植物根系生長(zhǎng)，提高根系活性，提高葉綠素含量，縮小氣孔開(kāi)放度，提高三羧酸循環(huán)關(guān)鍵酶活性[1]，改善產(chǎn)品品質(zhì)，提高作物產(chǎn)量等作用，并且越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃腐酸具有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)[2，3]。黃腐酸的來(lái)源不同，其化學(xué)組成略有不同，因此不同來(lái)源的黃腐酸在相同植物上的作用效果，以及同一種黃腐酸在不同植物上的作用濃度不盡相同。

自然環(huán)境中任何物質(zhì)的降解都是多種微生物協(xié)同完成的，單一降解菌具有產(chǎn)生的降解酶種類(lèi)單一，降解不完全等缺點(diǎn)。20世紀(jì)80年代人們開(kāi)始研究不同微生物間的相互協(xié)同作用，利用不同菌的特點(diǎn)及相互作用達(dá)到降解目的，并形成了混合培養(yǎng)技術(shù)。雖然混合培養(yǎng)具有單一菌種不具有的優(yōu)點(diǎn)，但是目前的混合培養(yǎng)技術(shù)主要由純培養(yǎng)的菌株組合起來(lái)的，而以純培養(yǎng)的方式獲得的微生物只占樣品中微生物種類(lèi)的1%[4]，絕大多數(shù)的微生物是不可培養(yǎng)的，導(dǎo)致自然界中很多的高效微生物無(wú)法純培養(yǎng)得到。菌群發(fā)酵技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展較快的技術(shù)，其菌群一般是從樣品中直接培養(yǎng)，富集得到，與單一降解菌及混合發(fā)酵技術(shù)相比，菌群發(fā)酵具有降解徹底，易培養(yǎng)，節(jié)約成本等優(yōu)點(diǎn)，有的發(fā)酵料甚至可以不用經(jīng)過(guò)滅菌直接發(fā)酵。

本課題組從1987年開(kāi)始了微生物降解褐煤的研究，并選育得到一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的高效降解真菌(Penicillium s p.P6)。首次闡述了褐煤自然風(fēng)化與微生物區(qū)系演替之間的關(guān)系，表明褐煤的風(fēng)化降解是多種微生物共同作用的結(jié)果，在前期主要是放線(xiàn)菌起作用，接著是細(xì)菌，在風(fēng)化程度較高的褐煤中則是真菌起主要作用[5]，基于這一發(fā)現(xiàn)課題組研究確定了3株菌(放線(xiàn)菌、真菌和細(xì)菌各1株)混合培養(yǎng)降解褐煤的工藝技術(shù)，大大提高了內(nèi)蒙古霍林河褐煤經(jīng)降解后水溶性黃腐酸的產(chǎn)量，并獲得發(fā)明專(zhuān)利。本研究旨在通過(guò)直接從自然界低階煤中分離得到混合菌群，減少分離、純化、菌種復(fù)配篩選的步驟；此外，對(duì)降解產(chǎn)物的特性及對(duì)植物生長(zhǎng)的效果進(jìn)行了初步研究，以期直接獲得降解低階煤的微生物組合，為低階煤的高效開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定理論及方法基礎(chǔ)。

1  材料與方法

1.1 低階煤來(lái)源

分別從低階煤資源比較豐富的新疆，山西，云南，內(nèi)蒙古等地采集到12種類(lèi)型的低階煤資源(包括褐煤、風(fēng)化煤)，取樣深度為地表以下15～30 cm處，采集到的煤直接粉碎，過(guò)50目篩，備用。

1.2 降解菌群的分離

采用LB液體培養(yǎng)基，裝入150 mL三角瓶中使液面深度達(dá)到約4 cm左右，121 ℃滅菌30 min。將未滅菌的風(fēng)化煤按液體體積的1%加入到三角瓶中，并以加入單獨(dú)滅菌的低階煤為對(duì)照，37℃靜止培養(yǎng)1周。將從不同低階煤中富集到的菌群轉(zhuǎn)接到新的150 mL三角瓶中，以單獨(dú)滅菌的煤代替未滅菌的煤加入到培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)一周。按上述方法傳代培養(yǎng)至第十代。

1.3 紫外可見(jiàn)分光光度分析

將兩種混合微生物降解內(nèi)蒙古褐煤得到的水溶性部分用6 mol/l的鹽酸調(diào)節(jié)到pH2.0，過(guò)夜沉淀后，6000 rpm離心15 min，棄上清，并用蒸餾水洗滌3次。將得到的黃腐酸低溫烘干待用。取烘干的黃腐酸固體溶解到去離子水中，選取適當(dāng)濃度的溶液進(jìn)行190～1000 nm的波長(zhǎng)掃描。

1.4 紅外光譜掃描

紅外光譜測(cè)定采用Thermo Scientific公司NICOLET iN10 MX顯微紅外光譜儀，制樣時(shí)將微量樣品放置在金剛石窗片表面上壓平后測(cè)試，測(cè)試范圍為4000～600 cm-1，分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品掃描64次[6]。

1.5 兩種黃腐酸對(duì)生菜發(fā)芽的影響

將低溫烘干的黃腐酸配成100 mg/kg、200 mg/kg、300 mg/kg、400 mg/kg、500 mg/kg、1000 mg/kg的溶液。將生菜種子浸在去離子水中12 h后，置于滅過(guò)菌的雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿25粒種子，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入5 mL不同濃度的黃腐酸溶液，每個(gè)處理4次重復(fù)。并以清水作對(duì)照，于室溫(15～20 ℃)連續(xù)培養(yǎng)7 d后每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)取樣10棵測(cè)定幼苗的莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、全長(zhǎng)，計(jì)算根冠比。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0處理軟件，分析方法采用單因素方差分析，顯著性水平為5%。

2  結(jié)果與分析

2.1 低階煤降解菌群篩選結(jié)果

采用1.2的方法對(duì)來(lái)源不同的12種低階煤進(jìn)行菌群富集(表1)，結(jié)果得到具有較好降解能力的菌群3株，編號(hào)分別為SL-1、SL-2、NM-1, 其中SL-2不但對(duì)風(fēng)化煤降解效果好，對(duì)內(nèi)蒙褐煤也有很好的降解效果。對(duì)于SX-1、SX-2、TLF-1分離到的菌群沒(méi)有自身低階煤降解能力，Akesu-1、Akesu-1、YN-1、YN-2在分離前期具有一定的降解自身低階煤的效果，但繼續(xù)傳代后降解能力有所下降。顯微鏡鏡檢的結(jié)果表明，降解效果最好的3個(gè)菌群(SL-1、SL-2、NM-1)的組成為細(xì)菌，其中包括長(zhǎng)桿菌、短桿菌、球菌等。由于菌群中含有大量不可培養(yǎng)的微生物，菌群的組成需要進(jìn)一步用分子生態(tài)學(xué)的方法鑒定。

表1 低階煤降解菌群的篩選結(jié)果
Tab.1 Bacterial consortium isolated from low-rank coal

注：F0表示加入樣品后的發(fā)酵液，定義為第0代；F1表示取第0代的發(fā)酵液中轉(zhuǎn)接入新的培養(yǎng)基，定義為第1代；Fn表示連續(xù)傳代10次以上后的發(fā)酵液；Fa表示保存的菌群活化后的發(fā)酵液；-表示煤樣經(jīng)7 d降解后OD450值小于0.1；+++ 表示煤樣經(jīng)7 d降解后OD450值大于2；+表示煤樣經(jīng)7d降解后OD450值大于0.1小于1；++表示煤樣經(jīng)7d降解后OD450值大于1小于2。

2.2 黃腐酸紫外-可見(jiàn)光光譜掃描

選取降解能力最強(qiáng)的SL-2菌群，在LB液體培養(yǎng)基中添加1%內(nèi)蒙霍林河褐煤培養(yǎng)7 d后，采用1.3方法對(duì)得到的黃腐酸進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光光譜掃描，并與Penicillium s p.P6降解內(nèi)蒙霍林河褐煤得到的黃腐酸進(jìn)行比較。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 Sl-2和P6降解內(nèi)蒙褐煤產(chǎn)生的黃腐酸紫外-可見(jiàn)光圖譜比較
Fig.1 Ultraviolet - visible absorption spectroscopy of FA from degraded lignite by SL-2 or P6

注：SL：SL-2降解褐煤得到的黃腐酸；NM：Penicillium s p.P6降解得到的黃腐酸。

由圖1可以看出，黃腐酸含有共軛雙鍵及含氧官能團(tuán)，在紫外可見(jiàn)范圍內(nèi)有吸收，吸收從高頻到低頻依次遞減。可以看出SL-2菌群降解得到的黃腐酸其最大吸收峰在216 nm處，而真菌降解得到黃腐酸的最大吸收峰為220 nm，菌群降解褐煤得到的黃腐酸的吸收峰較真菌得到的向左偏移，這可能和黃腐酸中共軛鍵、芳香環(huán)及含氧官能團(tuán)結(jié)構(gòu)及含量不同有關(guān)。

2.3 紅外光譜掃描結(jié)果

紅外光譜是表征腐植酸組成和結(jié)構(gòu)最常用的方法之一，HA的IR圖譜有幾個(gè)明顯的特征峰[7]，不同來(lái)源的FA在吸收峰的位置或強(qiáng)度上可能有些變化。見(jiàn)表2。

將SL-2菌群降解得到的黃腐酸經(jīng)酸析后，離心收集，洗滌并低溫烘干，對(duì)樣品進(jìn)行紅外光譜的掃描，結(jié)果與Penicillium s p.P6降解得到的黃腐酸進(jìn)行比較，見(jiàn)圖2。

表2 HA 的紅外吸收特征峰及其歸屬
Tab.2 Assignment of wavenumbers to structural groups

注：數(shù)據(jù)來(lái)源于Swift (1996)。

圖2 Sl-2和P6降解內(nèi)蒙褐煤產(chǎn)生的黃腐酸紅外吸收光譜比較
Fig 2. FT-IR spectra of FA from degraded lignite by SL-2 or P6

注：A：SL-2降解得到的黃腐酸；B：Penicillium s p.P6降解得到的黃腐酸(數(shù)據(jù)來(lái)源[8])。

首先，SL-2菌群降解褐煤得到的黃腐酸在3430 cm-1、2929 cm-1、1711 cm-1、1614 cm-1、 1416 cm-1、1261 cm-1、1080 cm-1處均有上述表2中典型的吸收峰，但由于煤來(lái)源有所不同，得到的結(jié)果有些差別。其次，由圖2可以看出，不同微生物降解同一種煤得到的黃腐酸其紅外光譜也有所不同，主要表現(xiàn)為1400 cm-1左右羥基OH較P6降解得到的黃腐酸振動(dòng)減弱，1250  cm-1處羧基的-C-O-伸縮振動(dòng)加強(qiáng)，并且該菌群降解褐煤得到的黃腐酸在1250～1000 cm-1之間振動(dòng)迅速減弱，而P6降解得到的黃腐酸在1000 cm-1處仍然有強(qiáng)烈的基團(tuán)振動(dòng)。

2.3 兩種黃腐酸對(duì)生菜發(fā)芽效果的比較

不同來(lái)源的黃腐酸對(duì)植物生長(zhǎng)的作用效果有所不同，見(jiàn)表3。

對(duì)于SL-2降解褐煤得到的黃腐酸，當(dāng)濃度在0～500 mg/kg時(shí)，生菜幼苗莖長(zhǎng)、根長(zhǎng)、全長(zhǎng)均隨黃腐酸濃度增加而增加，并在500 mg/kg時(shí)達(dá)到最大，均表現(xiàn)出顯著性差異；但根冠比隨黃腐酸濃度的加大而減小，說(shuō)明在0～500 mg/kg濃度范圍內(nèi)，該黃腐酸對(duì)莖的刺激作用大于對(duì)根的刺激作用；當(dāng)濃度為1000 mg/kg時(shí)，所測(cè)定的生菜的各項(xiàng)指標(biāo)均比500 mg/kg時(shí)小，莖長(zhǎng)與500 mg/kg黃腐酸處理相比差別并不顯著，與對(duì)照相比具有顯著性的增加；而根長(zhǎng)、全長(zhǎng)、根冠比與500 mg/ kg黃腐酸處理顯著減少，尤其是根長(zhǎng)比對(duì)照減小了14.0%，這說(shuō)明莖生長(zhǎng)的最適黃腐酸濃度高于根部生長(zhǎng)所需要的黃腐酸濃度，高濃度的黃腐酸對(duì)根的伸長(zhǎng)起到抑制作用。Penicillium s p.P6降解褐煤得到的黃腐酸(表4)，也表現(xiàn)出各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)先升高后降低的趨勢(shì)，但濃度有所不同，具體來(lái)說(shuō)當(dāng)濃度為200 mg/kg時(shí)對(duì)莖的刺激作用最為明顯，對(duì)根刺激的最佳作用濃度為400 mg/kg；根生長(zhǎng)的最適生長(zhǎng)濃度大于莖生長(zhǎng)的最適濃度，根冠比也同樣證明兩種黃腐酸對(duì)根和莖生長(zhǎng)作用不同。這可能由于兩種黃腐酸分別來(lái)自不同微生物對(duì)褐煤的降解，黃腐酸中所含官能團(tuán)及生物活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及含量有所不同引起的。

表3 SL-2降解褐煤產(chǎn)生的黃腐酸對(duì)生菜萌發(fā)影響
Tab.3 Effect of FA from degraded lignite by SL-2 on lettuce germination

注：同一列數(shù)據(jù)中不同字母代表處理間差異達(dá)0.05顯著水平，下同。

表4 P6降解褐煤產(chǎn)生的黃腐酸對(duì)生菜萌發(fā)的影響
Tab.4 Effect of FA from degraded lignite by P6 on lettuce germination

3  結(jié)論

對(duì)不同來(lái)源的低階煤進(jìn)行菌群分離，結(jié)果分離得到3個(gè)具有低階煤降解能力的菌群，避免了單菌分離、篩選、復(fù)配的步驟，可直接應(yīng)用于研究生產(chǎn)中。通過(guò)比較，其中降解能力最強(qiáng)的SL-2降解褐煤得到的黃腐酸與真菌P6降解相同來(lái)源的褐煤得到的黃腐酸在降解產(chǎn)物的特性與產(chǎn)品效果，結(jié)果表明，2種黃腐酸在紫外-可見(jiàn)光光譜掃描、紅外光譜的掃描結(jié)果有所不同，其中SL-2降解褐煤得到的黃腐酸其紫外-可見(jiàn)光光譜整體向左偏移，而真菌P6降解褐煤得到的黃腐酸的紅外光譜在1000cm-1左右有較強(qiáng)吸收峰。在生菜萌發(fā)上的效果表明，兩種黃腐酸均表現(xiàn)出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類(lèi)似物的性質(zhì)，即低濃度黃腐酸對(duì)植物生長(zhǎng)起到刺激作用，高濃度的黃腐酸抑制植物的生長(zhǎng)。但兩種黃腐酸在生菜發(fā)芽上的作用方式不同，其中SL-2菌群降解褐煤得到的黃腐酸對(duì)根生長(zhǎng)刺激的最佳濃度小于對(duì)莖生長(zhǎng)的作用濃度，而P6降解褐煤得到的黃腐酸則相反。

總之，由于不同微生物對(duì)煤的降解機(jī)理不同，降解相同的煤得到的產(chǎn)物在官能團(tuán)的結(jié)構(gòu)及數(shù)量上有所不同，生物活性也有所差別。

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