組織工程喉軟骨的檢測技術_組織工程學實驗技

一、膠原組織檢測

膠原是軟骨基質的主要成分，對維系軟骨的結構和功能有極其重要的作用。Ⅱ型膠原是透明軟骨基質的特異性標志。前兩節(jié)我們已在實驗觀察部分對兔喉甲狀軟骨缺損修復區(qū)新生軟骨和構建出的組織工程化喉軟骨通過部分特殊染色和Ⅱ型膠原免疫組織化學方法做了膠原組織的定性檢測，證實再生軟骨組織Ⅱ型膠原含量豐富。除了前述軟骨組織膠原檢測方法外，還有其他一些常用定性和定量檢測的方法。

（一）軟骨基質膠原Mallory三色染色法（MCT法）

【組織固定】　10%中性甲醛、70%～90%乙醇和Zenker液等均可。

【試劑配制】

（1）Mallory液：苯胺藍0．5g、橘黃G 2g、磷鎢酸1g、蒸餾水100ml。

（2）酸性復紅液：酸性復紅0．5g、蒸餾水100ml。

【染色方法】

（1）4～5μm石蠟切片，二甲苯脫蠟、過逐級乙醇至蒸餾水；

（2）軟骨組織若用Zenker液固定，應先用0．5%碘酒溶液脫汞5～10min，水洗后再用0．5%硫代硫酸鈉水溶液脫碘；

（3）Harris明礬蘇木精染液染2～3min；

（4）水洗后，0．5%鹽酸乙醇分化，蒸餾水洗2遍；

（5）入酸性復紅水溶液2～5min；

（6）入Mallory液20～40min；

（7）逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

【染色結果】　軟骨組織中膠原組織染呈深藍色。

（二）軟骨基質膠原偶氮卡紅苯胺藍染色法（Azocarmin　and　aniline　blue，Azan法）

【組織固定】　Zenker液、Bouin液和Carnoy液等均可，小塊組織固定時間以12～24h為佳。

【試劑配制】

（1）偶氮卡紅液：偶氮卡紅1g，加入100ml蒸餾水中，煮沸溶解，冷卻后慢慢滴入冰醋酸1ml，過濾后備用。

（2）苯胺藍橘黃液：苯胺藍0．5g、橘黃G 2g、蒸餾水100ml，煮沸溶解，冷卻后過濾，再加入冰醋酸8ml，染色前稀釋1～3倍。

（3）苯胺乙醇液：苯胺0．1～1g、95%乙醇100ml。

【染色方法】

（1）4～5μm石蠟切片，二甲苯脫蠟、過逐級乙醇至蒸餾水；

（2）偶氮卡紅液染30～60min，蒸餾水洗；

（3）苯胺乙醇液分化至細胞核鮮紅，胞質褪色為止；

（4）入含1%冰醋酸的95%乙醇中1～2min，以洗去苯胺；

（5）入5%磷鎢酸水溶液1～3h，蒸餾水漂洗；

（6）苯胺藍橘黃液染1～3h，蒸餾水漂洗；

（7）逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

【染色結果】　軟骨基質膠原呈藍色。

（三）軟骨基質膠原的定量測定

透明軟骨基質Ⅱ型膠原中含有特異的氨基酸－羥脯氨酸（hydroxyproline，HPR），它含量穩(wěn)定，通過測定HPR的含量可以基本了解軟骨中膠原的含量。

【測定原理】　HPR在有過量丙氨酸存在下，用氯胺T氧化可生成Δ′－吡咯啉－4－羥－2羧酸，加熱后使其溶于甲苯，與對二甲氨基苯甲醛反應，顯色后可于540nm波長進行比色定量。本法對羥脯氨酸專屬性強，其他氨基酸即使同時存在1萬倍量也不干擾。

【測定方法】

（1）軟骨脫脂：將軟骨切成薄片，置20ml試管中，加丙酮2次，各6h棄去，樣品放入乙醚中過夜，得到脫脂軟骨組織片，剪切軟骨呈1mm×1mm左右碎塊，置50℃恒溫箱中干燥。

（2）膠原提?。焊稍锏拿撝浌菢悠罚糠莘Q取50mg，置10ml帶蓋試管中，加入0．3mol／L三氯醋酸（TCA）3ml，置90℃恒溫箱內(nèi)3h，冷卻后3　000r／min離心5～8min，取上清，沉淀依上法提取一次，合并上清后，將盛有提取液的試管置烘箱中蒸干備測。

（3）待測樣品制備：蒸干后的試管中加入6mol／L　HCl　2ml，溶解全部樣品后移入5ml潔凈試管內(nèi)，密封管口，120℃水解10h。取水解液20μl，加蒸餾水6ml，搖勻，待測。

（4）標準測試液配制：取2mg標準HPR，溶于50ml容量瓶中，配成儲備液，測試時按0、2、4、6、8……16μg／ml稀釋成不同濃度梯度，與待測樣品同步測試。

（5）HPR測定：取待測樣品1ml，加入0．05mol／L　CuSO40．5ml及10%NaOH 0．5ml，再加入6%H2O20．5ml，置30℃水浴10min，其間振蕩3次；加入無水乙醇0．5ml，放置20min，并振蕩至少3次；加6mol／L HCl　1ml，再加5%對二甲氨基苯甲醛1ml，搖勻，于60℃水浴15min，自然冷卻后，用分光光度儀測540nm吸光值。

（6）膠原含量計算：樣品HPR含量＝標準HPR含量×所測樣品吸光值／標準HPR此含量吸光值。

樣品中膠原含量百分比（1ml水解物）＝樣品HPR含量／組織量×D×100（D為計算常數(shù)，D＝7．46）。

【HPR鑒別】　取檢測液點于層析濾紙上，干燥后點吲哚醌溶液（1g吲哚醌溶于100ml乙酸及10ml冰醋酸），熱風吹干，則HPR顯墨綠色，（與其他氨基酸顯色有別，如脯氨酸顯深藍色，其他氨基酸顯不同的紫紅色），再點上對二甲氨基苯甲醛溶液［1g對二甲氨基苯甲醛溶于100ml丙酮濃鹽酸（9∶1）混合液中，新配制］，吹干，HPR檢測點即轉為玫瑰紅色，其他氨基酸與吲哚醌所產(chǎn)生的顏色即褪去。

二、軟骨基質酸性黏多糖檢測

黏多糖是軟骨基質的另一重要成分，其含量直接代表了軟骨基質中特異性大分子聚糖體的含量。對其定性、定量檢測有助于對構建出的組織工程化喉軟骨質量的了解。軟骨基質黏多糖以酸性黏多糖為主，其間也含有少量中性黏多糖，對其定性定量檢測，除前述AB－PAS方法外，還有下列一些常用方法。

（一）軟骨基質黏多糖Lev－Spicer染色法

【組織固定】　10%甲醛或4%多聚甲醛、Carnoy液等。

【試劑配制】　阿爾辛藍（pH1．0）染液：阿爾辛藍8GS　1g、0．1N鹽酸水溶液100ml。

【染色方法】

（1）4～5μm石蠟切片，二甲苯脫蠟、過逐級乙醇至蒸餾水；

（2）阿爾辛藍染液染20～40min；

（3）0．1N鹽酸水溶液稍洗；

（4）不經(jīng)水洗，用濾紙吸去多余鹽酸；

（5）逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

【染色結果】　軟骨基質黏多糖染呈藍色。

（二）軟骨基質黏多糖甲苯胺藍（toluidine blue）－PAS染色法

【組織固定】10%甲醛或4%多聚甲醛、Carnoy液等。

【試劑配制】

（1）甲苯胺藍Schiff液：甲苯胺藍1g、1M鹽酸20ml、重亞硫酸鈉2g、蒸餾水200ml。先將200ml蒸餾水煮沸，然后加入甲苯胺藍，再煮沸1min，冷卻至50℃時加入鹽酸，搖均后再加入重亞硫酸鈉，貯存待用。

（2）氫氧化鉀液：氫氧化鉀0．5g、70%乙醇100ml。

【染色方法】

（1）石蠟切片二甲苯脫蠟、過逐級乙醇至蒸餾水，用1%過碘酸氧化20min；

（2）蒸餾水充分洗后用甲苯胺藍Schiff液染15min；

（3）水洗5min，再用70%乙醇浸洗，然后將切片置于氫氧化鉀液中30min；

（4）70%乙醇洗后用蒸餾水洗3遍；

（5）用Schiff原液染10min，自來水沖洗5min；

（6）逐級乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

【染色結果】　軟骨基質黏多糖呈藍色。

（三）軟骨基質酸性黏多糖蛋白酶消化法定量檢測

【檢測原理】　軟骨基質中的酸性黏多糖是以蛋白多糖的形式存在的，一種蛋白質往往含有數(shù)十條或上百條黏多糖鏈，蛋白多糖單體分子常與其他蛋白多糖分子或蛋白質分子形成聚集體。已知蛋白多糖中鏈與核心蛋白通過共價鍵連接（糖肽鏈）。其聯(lián)結點是在木糖和絲氨酸羥基之間有一個糖苷鍵。蛋白多糖的聚集體則通過次級鍵（氫鍵、鹽鍵等）形成。因而提取分離黏多糖僅僅依靠破壞次級鍵的作用只能分離蛋白多糖，而必須以降解蛋白質的方法，破壞多糖鏈與蛋白質的共價結合，方能達到提取黏多糖的目的。

近年來提取軟骨基質中的黏多糖常用蛋白質水解酶消化法，利用專一性低的蛋白水解酶進行廣泛水解當然最為理想。但由于蛋白酶不能斷裂糖肽鏈及其附近的肽鍵，因此生成物可能保留較長的肽段。為除去肽段，以不改變糖鏈結構為前提，可和堿合用。

常用的蛋白水解酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶，其中以木瓜蛋白酶和鏈霉菌蛋白酶最為常用。

【檢測方法】

（1）軟骨脫脂：取新鮮軟骨組織，去凈附著的軟組織和軟骨膜，切成薄片，剪成1mm× 1mm×1mm左右碎塊，用5倍體積丙酮處理兩次，乙醚處理1次，以脫水和去脂，組織塊真空干燥。

（2）酶消化：將干燥脫脂軟骨，加入10倍體積0．1mol／L磷酸鹽緩沖液（pH8．0），加入胰蛋白酶（終濃度達0．25%左右），混勻后加入少量甲苯，37℃消化，直到組織完全化解為止，此時軟骨被消化成黏粥狀。用醋酸調整軟骨消化懸液pH至6．0，加入EDTA及半胱氨酸鹽酸鹽（使兩者終濃度分別為0．005mol／L），然后再加入木瓜蛋白酶溶液（2mg／g干燥組織），混勻后置60℃水浴中消化36h左右，并隨時用0．1M氫氧化鈉調整pH，當消化液由稀粥狀變?yōu)橥该鳡顣r，表示消化完畢。

（3）酸性黏多糖獲?。簩⑾涸诘蜏仉x心機中離心（3　000r／min），取上清液，加入40%三氯醋酸至不再出現(xiàn)沉淀為止，離心后取上清液，將上清液對水透析，將透析液濃縮至原體積一半，然后滴加2%氯化二六烷基吡啶溶液至不再出現(xiàn)沉淀為止，過濾、收集沉淀，沉淀物用少量0．6mol／L氯化鈉液洗3次，洗液棄去。將沉淀溶于少量1．2mol／L氯化鈉溶液中，加入3倍體積2%醋酸鈉乙醇液，硫酸黏多糖（主要為硫酸軟骨素成分）即沉出，翌日離心，沉淀用少量乙醇洗滌3次后，真空干燥，即得所測軟骨基質酸性黏多糖干燥品。

（四）圖像分析技術在軟骨基質酸性黏多糖定量檢測中的應用

根據(jù)軟骨基質特殊染色深淺與軟骨基質黏多糖含量成正比的關系，用特制的圖像分析掃描儀將標本染色圖像輸入計算機，計算機通過一定的圖像分析軟件根據(jù)標本染色的深淺進行細致的分析，得出其灰度值，依圖像分析灰度值可求得軟骨基質膠原或黏多糖的大致含量。圖像分析系統(tǒng)定量法測定軟骨基質膠原或黏多糖含量要求所有待測標本在取材、切片、染色及所用圖像分析條件上嚴格保持一致，每一染色標本隨機抽取用于圖像分析的片數(shù)不應少于5片，計算不少于5片圖像分析結果的平均值作為其含量參考值。

三、軟骨組織生物力學檢測

1．軟骨力學性質　軟骨組織結構相對簡單，僅由軟骨細胞及其分泌的基質成分組成，不含無機鹽，所以在質地上相對柔軟，有一定的形變范圍，在一定程度上能承受壓縮、彎曲和剪切載荷。一般情況下軟骨在自重或一定的力學載荷下能維持本身及其所構成器官的幾何形態(tài)，具有支持、連結與緩沖功能。目前，軟骨組織的生物力學在關節(jié)軟骨研究得較多，包括它的黏彈性、應力－應變性、表面潤滑和磨損性等都有研究的報道。但在耳鼻咽喉科領域有關軟骨組織的生物力學研究頗少。迄今，耳鼻咽喉軟骨組織生物力學的測試指標、測試方法和有代表性的力學數(shù)據(jù)尚沒有確立。根據(jù)喉支架軟骨部位、形態(tài)和解剖結構特點，并與其生理功能相結合，一般認為喉支架軟骨的生物力學應注重其拉伸、壓縮和支撐力及其影響因素的研究上。組織工程化喉支架軟骨的生物力學測試應在可比范圍內(nèi)與相應的自然狀態(tài)喉支架軟骨生物力學測試數(shù)據(jù)相比，以確定構建出的人工喉軟骨生物力學性能和實際應用的可行性。

研究組織工程化喉支架軟骨生物力學，首先應了解軟骨的黏彈性概念。軟骨的彈性是指軟骨在變形后恢復到變形前的形狀和尺寸的能力。黏性則是指加載時阻滯物體變形和卸載時阻滯物體恢復原有形狀和尺寸的能力。軟骨黏彈性特點主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①力－變形的滯后性；②應力松弛特性；③蠕變特性；④變形速率影響特性等。

力－變形滯后性表現(xiàn)為在軟骨的加載和卸載循環(huán)中其曲線不重合，反映出在順序作用力下軟骨加載和卸載后的變形與所需能量是不相同的。

應力松弛特性可用軟骨的松弛曲線來描述，即將軟骨由原有長度L1迅速拉伸到長度L2，并且使它張緊在L2長度上，此時軟骨中出現(xiàn)了張緊力T0，隨著時間的延長此張緊力越來越小，將每一時刻的張緊力T與T0之比作為時間的函數(shù)作出的曲線即為松弛曲線，用公式表示為：

式中t為時間，C、τ1、τ2為材料常數(shù)，E是時間的函數(shù)，可以由Abramowitz（1964）專用表給出，當t→∞時，由該表得出的E值為零。

軟骨的松弛特性反映出在壓力載荷作用下，其瞬間松弛速度極快，以便在較短的時間內(nèi)吸收較多的能量，以減少沖擊載荷傷害的持續(xù)性。

蠕變特性表現(xiàn)在當軟骨受到恒定不變的載荷時，其變形將不斷加大，但最后會趨于一恒定值。

變形速率影響特性表現(xiàn)為軟骨在不同的變形速度（一般以mm／s計）時，其所需的作用力明顯不同。

軟骨結構決定了軟骨的黏彈性，黏彈性影響著軟骨的生物力學性質。

2．軟骨生物力學主要測試指標

（1）力：是物體之間的相互作用，它能使物體的運動狀態(tài)發(fā)生變化或使物體發(fā)生形變。單位：牛頓（N）。

（2）應變：物體受力作用時發(fā)生形變，其體積、形態(tài)和長度變化與其原有值之比。

（3）應力：是物體中各部分之間單位面積上相互作用的內(nèi)力。

（4）剛度：物體產(chǎn)生單位變形所需的外力，材料的彈性模量和剪切模量越大，則剛度越大。

3．軟骨生物力學測試手段

（1）材料力學試驗機測量：可以直接測出位移、力和應變等力學指標。推薦美國MTS公司20世紀90年代推出的生物材料力學測試機（MTS－858型），它由計算機自動控制，液壓伺服，雙軸雙向（上下拉壓，左右扭轉），既能位移控制，又能載荷控制，可載范圍及速度可調范圍廣。國內(nèi)長春試驗機研究所20世紀80年代后期制造的萬能材料試驗機（SWD－10型）也是較好的材料力學試驗機，它操作簡單，使用方便，是單軸單拉、單壓位移控制試驗機。其傳感器精確度高，通過計算機進行數(shù)據(jù)采集，可以直接測量力、位移、應變等生物力學指標，通過轉換裝置，還可進行力矩和角位移的測量。

（2）撞擊試驗機測量：可模擬戰(zhàn)傷、交通事故傷和其他創(chuàng)傷等對撞擊速度和能量的要求，測量不同模擬狀態(tài)下的軟骨生物力學指標。推薦第一軍醫(yī)大學全軍重點生物力學實驗室自行設計制造的CZZ－Ⅱ型撞擊試驗機。

（3）三維運動試驗機測量：通過對軟骨標本反復進行加載、卸載，可測量軟骨的屈、伸、左右側彎和左右旋轉等運動幅度，從而確定軟骨的三維運動范圍。第一軍醫(yī)大學全軍重點生物力學實驗室自行設計制造的三維運動試驗機可滿足對軟骨的三維運動的測量。

（4）壓敏片測量法：是目前較先進的醫(yī)用生物力學測試方法，其基本原理是應用特制的試紙樣壓敏片感受測試物所受的作用力，壓敏片能根據(jù)受力的大小呈現(xiàn)出不同深淺度的顏色。測試后的壓敏片用圖像掃描儀將所測不同深淺度的顏色輸入計算機，通過事先編好的程序將壓敏片不同深淺度的顏色轉化成大小不同的力值，從而得到所測軟骨的生物力學數(shù)據(jù)。

四、組織工程化喉軟骨的電子顯微鏡觀察

（一）透射電子顯微鏡觀察

1．標本處理

（1）取材：透射電子顯微鏡觀察軟骨超微結構須先將標本做成厚度為10～100nm的超薄切片，由于透射電鏡觀察視野小，所以取材正確與否直接關系到電鏡觀察的準確性與效果。正確的取材必須做到：①組織切取必須快速，一般要求在1～2min內(nèi)把要觀察的組織浸入固定液；②切取的組織塊要盡可能小，一般以0．5～1．0mm3大小為宜，以利于固定液的滲透；③所用固定液要預冷，以降低離體細胞內(nèi)酶的活性，減少細胞自溶；④所用切割器要鋒利干凈，一刀切成，避免鋸、扯、壓等不良操作和其他雜質污染，以防細胞受到損傷與影響結果的準確性。

（2）固定：用于透射電鏡觀察的軟骨組織，其主要固定方法是化學固定法，最常用的固定方式是浸泡固定。固定液包括1%～2%四氧化鋨（osmium　tetroxide）、1%～4%戊二醛（glutaraldehyde）、4%多聚甲醛（paraformaldehyde）或戊二醛與多聚甲醛的混合液等。

（3）脫水：一般用乙醇或丙酮作為脫水劑，其程序為：30%乙醇或丙酮5～10min；50%乙醇或丙酮5～10min；70%乙醇或丙酮5～10min；90%乙醇或丙酮10～20min；100%乙醇或丙酮脫水3次，10～15min／次。

（4）滲透與包埋：一般所用滲透與包埋劑為環(huán)氧樹脂類物質，包括Epon812、ERL－4206（也稱Spurr樹脂）、TAAB812、環(huán)氧樹脂600和環(huán)氧樹脂618等。滲透與包埋分三步走：①將樣品置于100%脫水劑及等量包埋劑的混合液中，室溫下至少30min或數(shù)小時；②將樣品置于純包埋劑中，室溫下數(shù)小時或過夜；③將樣品置于一定的空心模具內(nèi)，灌滿包埋劑，然后根據(jù)包埋劑聚合時所需的時間和溫度置溫箱內(nèi)聚合，制成包埋塊。

（5）切片：用裝有鉆石刀的超薄切片機將軟骨組織切成50nm左右的超薄切片，特制銅網(wǎng)撈取超薄切片，濾紙吸干。

（6）染色：一般用醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色。切片經(jīng)雙重染色后，即可在電鏡下觀察。

2．標本觀察　軟骨組織透射電子顯微鏡觀察包括軟骨細胞和基質兩大部分。細胞部分的觀察應注意細胞膜、內(nèi)質網(wǎng)、高爾基復合體、線粒體、溶酶體、核膜以及胞質中的包含物如脂滴、糖原和結晶狀蛋白質等，除此之外，還應注意其中心體、微管、微絲、核仁、染色體和核蛋白體等；基質部分的觀察應注意膠原纖維排列和蛋白多糖大分子的結構。組織工程化軟骨的電子顯微鏡下觀察應與正常軟骨組織作比較，以確定其超微結構表現(xiàn)。

（二）掃描電子顯微鏡觀察

掃描電子顯微鏡主要是觀察組織或細胞表面的超微形貌，在組織工程化喉軟骨構建過程中主要用于種子細胞生長環(huán)節(jié)及其與生物材料復合情況的觀察。

1．樣品處理　主要包括取材、清潔、固定、脫水、干燥、黏托和鍍膜等操作。

（1）取材：生長在一定支持物上的細胞可以直接從培養(yǎng)環(huán)境中取出做清潔處理，無支持物的細胞分離后可適當離心使其成為細胞團，然后進行清潔處理或直接固定，負載了軟骨細胞的生物材料自培養(yǎng)環(huán)境中取出后，根據(jù)情況做清潔處理或直接固定。

（2）清潔：一般用PBS、蒸餾水或生理鹽水等溶液進行適當漂洗。

（3）固定：冷丙酮、無水乙醇、戊二醛和多聚甲醛等均可以作為軟骨細胞的固定劑。固定后PBS漂洗3次，2～3min／次。

（4）脫水：逐級乙醇脫水。

（5）干燥：自然干燥或用臨界點干燥法使標本干燥。

（6）黏托與鍍膜：有支持物的細胞可以直接離子淺射噴金鍍膜；無支持物的樣品須用一定的導電膠將樣品膠粘在裝物臺上，然后淺射噴金鍍膜。

2．樣品觀察　噴金鍍膜后的樣品即可進行掃描電鏡觀察，對軟骨種子細胞及其與生物材料的復合應注意觀察細胞的形態(tài)、表面形貌、細胞與細胞間的關系以及細胞在生物材料上的分布、黏附和分泌等情況。

（南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院　孫安科）

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